מאמר שיטה

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

DOI:

10.3791/59916

⸱

29 באוגוסט 2019

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים פורחים יש מערכת ייחודית רבייה מינית בשם ' הפריה כפולה ', שבה כל אחד מתאי הזרע מנתיכים בדיוק עם תא ביצה או תא מרכזי. לפיכך, שני אירועי הפריה עצמאיים מתרחשים כמעט בו זמנית. תא הביצית המופרית והתא המרכזי מתפתחים לזיגוטה ולאנדוזרע, בהתאמה. לכן, שליטה מדויקת של הפריה כפולה חיונית להתפתחות הזרעים שלאחר מכן. הפריה כפולה מתרחשת בתוך הנקבה המאובמת (שק העובר), אשר מוסתרים עמוקות מכוסה ברקמה עבה ורקמות שחלות. הבנייה הזאת רקמת העור עושה התבוננות וניתוח של הפריה כפולה די קשה ויצר את המצב הנוכחי שבו שאלות רבות לגבי המנגנון של הפריה כפולה נותרו ללא מענה. עבור הערכה תפקודית של מועמד פוטנציאלי לווסת הדישון, ניתוח פנוטימית של הפריה חשוב. כדי לשפוט את השלמת ההפריה ב Arabidopsis thaliana, הצורות של אותות פלואורסצנטית תיוג גרעינים זרע משמשים אינדיקטורים. תא זרע שאינו מגיע להפרות מצוין על-ידי אות מעובה מחוץ למשחק הנשי, ואילו תא זרע שמפרה בהצלחה מצוין על-ידי אות שאינו מעובד כתוצאה מקריסוגמיה בגרעין המגיים הנשי. השיטה המתוארת כאן מספקת כלי לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה תחת בתנאים vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים פורחים לייצר זרעים באמצעות הפריה כפולה, תהליך זה נשלט ישירות על ידי אינטראקציות בין חלבונים מקומי על ממברנה פלזמה תא רבייה1,2. פורח מפעל גברי, זוג תאים זרע, לפתח אבקה. שפופרת אבקה הצומחת לאחר האבקה מספקת זוג תאי זרע למשחק נקבה, תא ביצה ותא מרכזי, המתפתחים לתוך שק העובר. לאחר המשחק הגברי והנשי נפגשים, חלבונים על פני משטח גמטות לקדם הכרה, החזקה, והיתוך להשלים הפריה כפולה. במחקרים קודמים, קרום המשחק הגברי חלבונים תא מסוים 1 (GCS1)/הסיס 2 (HAP2)3,4 ו-תא רבייה ביטא 2 (GEX2)5 זוהו כרגולטורים הפריה מעורבים היתוך תא רבייה ו מצורף, בהתאמה. לאחרונה זיהינו מDUF679 זכר הממברנה הספציפי חלבון, תחום ממברנה חלבון 9 (DMP9), כמו וסת הפריה מעורב אינטראקציה תא רבייה. מצאנו כי ירידה של DMP9 ביטוי התוצאות עיכוב משמעותי של הפריה תא ביצה במהלך הפריה כפולה ב . thaliana6.

כמו הפריה כפולה מתרחשת שק העובר, אשר מוטבע בתוך ביצית כי הוא עטוף עוד עם רקמת שחלות, קשה להתבונן ולנתח את מצבי תהליכים הפריה כפולה. מסיבה זו, עדיין יש הרבה נקודות ברורות שיגבילו הבנה מלאה של המנגנון כולו של בקרת הפריה כפולה. הקמת טכניקות התבוננות כדי לעקוב אחר התנהגותו של גמטות במהלך הפריה כפולה תחת בתנאים vivo היא הכרחית לניתוח פונקציונלי של מועמדים פוטנציאליים הפריה ווסת. מחקרים שנעשו לאחרונה הניבו קווי סמן שבו מבנים subcellular המשחק מסומנים עם חלבונים פלורסנט. במאמר זה, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט ומהיר להתבוננות הפריה כפולה שהתרחשה שק העובר נגזר מpistils מלאכותית מלאכותי. באמצעות תא זרע הגרעין סמן קו HTR10-mRFP7, מצב הדישון של כל מגיים נקבה יכול להיות מופלים על בסיס של זרע המבנה הגרעיני האותות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בשינוי מורפולוגי כזה של גרעיני הזרע בהפריה יכול להשיג ביעילות כמות מספקת של נתונים עבור הוכחה סטטיסטית. קו DMP9-מיקוד עם רקע HTR10-mrfp (DMP9KD/HTR10-mrfp) שימש צמחים זכרים כדי להראות דפוס הפריה יחיד. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח פונקציונלי של מוסבי הפריה אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. האבקה מלאכותית

הערה: לפני שמתחילים בתהליך, נדרש זוג מלקחיים של No. 5.

  1. הגדל thaliana (Col-0) ב -22 ° c תחת מחזור כהה של 16-h בחדר הגידול.
    הערה: גזור ולהסיר את קנה הפרח הראשון שפותח עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים השחי. צמחים הגדלים במרץ (2-3 שבועות לאחר חיתוך של הקנה הראשון; גובה הצמח כ -25 ס מ) מתאימים לניתוח.
  2. כדי לסרס, להסיר עלי גביע (איור 1b), כותרת (איור 1b), ו אבקן (איור 1b) של ניצנים פרח בשלב 118 (איור 1b) באמצעות מלקחיים מס ' 5. ניצן עם פיסות של עלי כותרת לראות בראש הוא הטוב ביותר.
    הערה: השתמש המתאים הנקבה סמן קו הסימון. בפרוטוקול זה, השתמשנו בצמח סוג פראי כמו ההורה הנשי.
  3. 15 עד 18 שעות לאחר אה, לקחת את אבקן של DMP9KD/HTR10-mrfp פרח בשלב 138 על ידי צובט את חוט הלהט עם מלקחיים.
  4. כדי להאביק, בעדינות ללטף את הסטיגמה של מסורס פיסטיל מספר פעמים עם ביטול הריח.

2. הכנת ביצית להשגחה

הערה: הפריטים הבאים נדרשים: זכוכית שקופית עם קלטת כפולה מחוברת, מלקחיים מס ' 5, מחט הזרקת G 27, ומיקרוסקופ מבתר.

  1. 7 כדי 8 h לאחר האבקה (האפ), לאסוף את פיסטיל ולמקם אותו על קלטת כפולה, ולאחר מכן לחץ בעדינות עם מלקחיים כדי לתקן את הפיסטיל על הקלטת (איור 2a, A ').
    הערה: רוב הברגי מקבל לפחות צינור אבקה אחד 10 האפ9. אם שניהם או כל אחד מתאי הזרע מן הצינור אבקה הראשון להיכשל להפרות, צינור אבקה השני יימשך על ידי הביצית בשל ההפריה הפריה מערכת10. כדי לנתח את המבנה של גרעין הזרע מצינור האבקה הראשון, מומלץ להשלים את ההכנה באמצעות 10 האפ לאחרונה.
  2. חותכים את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 2B, B ').
  3. לחתוך את חומת השחלה לאורך שני צידי השזיף (איור 2c, C) על ידי הזזת קצה המחט הזריקה.
    הערה: הכנס את המחט הזריקה שתאפשר כדי למנוע הפרדה ביצית מן המחיצה.
  4. אוורט את חומת השחלה באמצעות מחט ההזרקה (איור 2D, D ').
  5. צבוט את בסיס המחיצה שאליה מחוברים המחוברים, והרימו אותו בזהירות עם מלקחיים (איור 2E).
  6. העבר את המכסה לתוך טיפת מים על זכוכית שקופית, ובעדינות לכסות עם זכוכית כיסוי להתבוננות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2E, E ').

3. מיקרוסקופיה

הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצויד קוביית מסנן פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים), מצלמה דיגיטלית, ואת התוכנה המלווה.

  1. השיגו תמונות של שימוש בגרעינים המכילים גרעיני זרע עם mRFP באמצעות עדשת המטרה 20x או 40x ומצלמה דיגיטלית מצוידת.
  2. אשר את מספר גרעיני הזרע המסומנים ב-mRFP בתוך שק העובר.
    הערה: ניתן לכלול בגודל האוכלוסיה שני גרעיני זרע בעלי תוויות של mRFP לניתוח סטטיסטי.
  3. אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין הזרע שכותרתו mRFP בתוך שק העובר.
    הערה: מיד לאחר ששוחרר מצינור האבקה, זוג גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות של mRFP מותאמים לבין הביצה לתא המרכזי. גרעין הזרע של mRFP מסומן על ידי שזיהה בצד של הצ מציין הפריה תא מרכזית, למשל. על-ידי שימוש בשורה מתאימה בצורת סמן ממברנה, כפי שמוצג באיור המשלים 1, בין אם תא הזרע עובר פלמוסוגמיה (לאחר היתוך ממברנה אבל לפני קריומיה) ניתן לפקח בבירור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוך פיסטיל מואבקים עם DMP9KD/HTR10-mrfp נאספו ב 7-8 האפ ו נצפתה.

רוב בעלי התפקידים הכילו שני גרעיני זרע mRFP המסומנים בתווית על תא הביצית (מיקרופיללר בצד) והתא המרכזי (צד הקצה של charazal), בהתאמה (איור 3A), המציין הפריה כפולה מוצלחת. בנוסף, המכיל את גרעין הזרע של mRFP מתויג בגרעין התא המרכזי בתוספת גרעין מרוכז mRFP בתווית הזרע מחוץ לתא ביצה (איור 3B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTR10-mRFP תוויות כרומטין אבהי (כלומר, לדמיין גרעיני תא זרע), ואת הדינמיקה הפריה כפולה דווחו7. מיד לאחר שחרורו מצינור אבקה, גרעיני זרע HTR10-mRFP עדיין צפוף. עם זאת, כל גרעין הזרע הוא לפרק עם מיזוג עם הגרעין הנקבי מגיים הנקבה בקאריומיה שלוש עד ארבע שעות לאחר פיוז ' ן קרום ממברנה7. תאי זרע לא מופרות נשארים מעובה, כפי שניתן לראות בתוך שק העובר שבו gcs1 תאי זרע נעצרו ללא הפריה (איור 3d). בדרך כלל, כאשר HTR10 פורייה-mrfp משמש ההורה אבקה, 5...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI מענק (JP17H05832 T. I.) ועל ידי מימון של תוכנית קידום המחקר בעדיפות אסטרטגית על פיטוכימיקלים הצמח מדעי מולקולרית, אוניברסיטת צ'יבה (יפן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BX51אולימפוסאפיפלואורסצנטי מיקרוסקופ
כיסוי זכוכיתזכוכית מטסונאמיC018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
קלטת דו צדדיתNichibanNW-15S15 מ"מ רוחב
DP72OlympusDegital מצלמה
מלקחייםVigorכל מלקחיים מס' 5 זמינים
תא גדילהNihonikaLPH-411PFQDT-SP
em>HTR10-mRFP<em>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. ( 2007)7
מחט הזרקהTerumoNN-2719S27 G
זכוכית שקופיותזכוכית מטסונאמיS9443
SZX9מיקרוסקופניתוח אולימפוס
U-MRFPHQקוביית מסנן פלואורסצנטי אולימפוס (עירור: BP535-555, פליטה: BA570-625, מראה דיכרומטית: DM565)
עדשת אובייקט (NA 1.3), טבילה בשמן
UPlanSApo 20xעדשת אובייקט אולימפוס(NA 0.75), יבשה
< UPlanFL N 40x אולימפוס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Arabidopsis thalianaHTR10 mRFP

מאמרים קשורים