מאמר שיטה

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

DOI:

10.3791/59928

⸱

30 ביוני 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרוסקופיית NMR משמש לעתים קרובות לזיהוי ואפיון של מעכבי אנזימים בגילוי הסמים, במיוחד בהקשר של הקרנת קטע. NMR-מבוסס על פעילות מבוססת באופן אידיאלי מתאים לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן הנדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה ניגודים עם spectrophotometric assays, שבו לקרוא בעיות התערבות לעתים קרובות נובעים תרכובות עם חופפים UV-vis פרופילים הקליטה. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. תכונה זו הופכת אותם לשימושיים כמו אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת התפוקה ואת שחקן הראש. פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. השיטות מודגמות באמצעות שני אנזימים ריבוהידרוקלז. השימוש 1H nmr מוצג עבור אנזים ספציפי purine, בעוד 19F nmr מוצג עבור האנזים הספציפי pyrimidine. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו התהודה המצע מוצר ניתן לצפות ומכובד על ידי הספקטרוסקופיית NMR. כדי להיות שימושי ביותר בהקשר של גילוי סמים, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר 2-3x הערך Km שלה. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית מבוססת היטב לאפיון וניטור של תגובות אנזימים1,2. הבדלים במשמרות כימיים ודפוסי צימוד משמשים להבחנה בין המצע לבין מוצרים, ועוצמות תהודה יחסיות משמשות לכמת את אחוז התגובה. הן צריכת המצע והן יצירת המוצר מתבוננים ישירות בספקטרום NMR. זה נוגד את הספקטרוסקופיית הספקטרופוטומטר או הפלואורסצנטית, שבו קורס זמן התגובה מצוין על ידי שינוי בספיגה המיוחס למינים כימיים שנצרכים או נוצרו. בדיוק כמו עם שיטות אחרות, NMR יכול לשמש כדי ללמוד תגובות אנזימים כפונקציה של טמפרטורה, pH, או תנאי פתרון אחרים, ואת ההשפעות של מעכבי ניתן לקבוע.

לאחרונה, nmr-מבוססי האנזים פעיל....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מתחם הבדיקה הראשונית בחני ב 500 μm ו 250 μm

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות המניה של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ובמתחם 50 mM במבחן diמתיל סולפוקסיד (DMSO). עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד מ-4 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 4.
    3. הוסף 6 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 (0 דקות בקרה) ו-4 (30 דקות בקרה). הוסף 6 μL של תרכובת הבדיקה לצינור 2. הוסף 3 μL של מתחם בדיקה 3 μL של DMSO שניוני כדי צינור 3.
  2. הכינו פתרון מספיק. מלאי התגובה
    הערה: פתרון המניה הוא עבור חמש תגובות כי כל אחד מכיל 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאומיום, ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מציג את התוצאות עבור בדיקת שתי תרכובות נגד agnh באמצעות 1H nmr לאחר סעיף 1. תגובת האנזים הוא נצפתה ביותר בקלות וכימות על ידי העלמות של אדנוזין סינגקל ובלתי מאפשרים מהדהד ב 8.48 ppm ו 6.09 ppm, בהתאמה, ואת המראה של אדנוטין סינגקל תהודה ב 8.33 לדפים לדקה כפי שנצפתה 30 דקות בקרת ספקטרום. בנוכחות של 500 μM מתחם 1, אין מוצר נוצר כפי שמעידים על ידי חוסר תהודה אדנין ב 8.33 ppm. בנוכחות של 250 μM תרכובת 1, כ -10% מהמצע הומר למוצר. לעומת זאת, הריכוז של מתחם 2 מעכב את האנזים כפי שמעי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המתוארים הם חלים בדרך כלל על אנזימים רבים, בתנאי כי מצעים ו/או מוצרים יש אותות הניתנים לפתירה בספקטרום NMR. עם זאת, חשוב כי ריכוז המצע קרוב לערך Km שלה מספיק גבוה כדי להתגלות בניסוי nmr בתוך פרק זמן סביר. המצע ריכוז לא גבוה יותר 2-3x ערך Km הוא אופטימלי לגילוי תחרותי, לא תחרותי, מעכבי בלתי תחרותיים4. כפי שמוצג כאן עבור ה, המצע, ערכי Km נמוך כמו 15 μm מתאימים. השימוש של מצעים עם CH3 או CF3 אותות, ביחד עם א.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד ר הדיקן בראון על מתן תרכובות מספריית החלקים של אסטרזמקה וד ר דוד פרקין למתן אנזימים בעלי הדין והאנזים. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R15AI128585 ל B. J. S. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. המחקר נתמך גם על ידי מלגת מחקר הקיץ של הוראס ג'י מק הוענק ל-S. N. M, משפחת לנדסברג המענק הוענק לג א., ולמענקים לפיתוח הפקולטה ולפרס פרדריק בטלהיים מאוניברסיטת אדלפי, לשנת B. J.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AGNHמטוהר בביתN/ATVAG_213720
UNHמטוהר בביתN/ATVAG_092730
אדנוזיןסיגמאA9251
5-פלואורורידיןסיגמאF5130
דימתיל סולפוקסיד-D6מעבדות איזוטופ קיימברידג'DLM-10-100D, 99.9%
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigmaP0662
אשלגן פוספט דו-בסיסיSigmaP3786
אשלגן כלוריSigmaP9541
תחמוצת דאוטריוםCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99.9%
חומצה הידרוכלוריתפישרכימיקל A144212
Triton X-100SigmaX100
3-(טרימתילסיליל) פרופיוניק-2,2,3,3,-d4 מלח נתרן חומצה (TSP)סיגמא269913D, 98%
2,2,2-טריפלואורואתנול-1,1-d2סיגמא612197D, 99.5%
פיפטהגילסוןF123602PIPETMAN Classic P1000
פיפטהגילסוןF123601PIPETMAN Classic P200
פיפטהגילסוןF123600PIPETMAN Classic P20
צינורות מיקרופוגהפישר סיינטיפיק05-408-129
צינורות חרוטייםקורנינג352099
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף5418
מערבל מערבולתפישר סיינטיפיק02215365
צינורות NMRNorell502-7או לפי ההתאמה לספקטרומטר NMR NMR
BrukerN/ פריזמה AvanceIII500
GraphPadN/Aגרסה 5.04
תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NMRIC50NMRNMR

מאמרים קשורים