מאמר שיטה

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

DOI:

10.3791/59928

⸱

30 ביוני 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרוסקופיית NMR משמש לעתים קרובות לזיהוי ואפיון של מעכבי אנזימים בגילוי הסמים, במיוחד בהקשר של הקרנת קטע. NMR-מבוסס על פעילות מבוססת באופן אידיאלי מתאים לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן הנדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה ניגודים עם spectrophotometric assays, שבו לקרוא בעיות התערבות לעתים קרובות נובעים תרכובות עם חופפים UV-vis פרופילים הקליטה. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. תכונה זו הופכת אותם לשימושיים כמו אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת התפוקה ואת שחקן הראש. פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. השיטות מודגמות באמצעות שני אנזימים ריבוהידרוקלז. השימוש 1H nmr מוצג עבור אנזים ספציפי purine, בעוד 19F nmr מוצג עבור האנזים הספציפי pyrimidine. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו התהודה המצע מוצר ניתן לצפות ומכובד על ידי הספקטרוסקופיית NMR. כדי להיות שימושי ביותר בהקשר של גילוי סמים, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר 2-3x הערך Km שלה. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית מבוססת היטב לאפיון וניטור של תגובות אנזימים1,2. הבדלים במשמרות כימיים ודפוסי צימוד משמשים להבחנה בין המצע לבין מוצרים, ועוצמות תהודה יחסיות משמשות לכמת את אחוז התגובה. הן צריכת המצע והן יצירת המוצר מתבוננים ישירות בספקטרום NMR. זה נוגד את הספקטרוסקופיית הספקטרופוטומטר או הפלואורסצנטית, שבו קורס זמן התגובה מצוין על ידי שינוי בספיגה המיוחס למינים כימיים שנצרכים או נוצרו. בדיוק כמו עם שיטות אחרות, NMR יכול לשמש כדי ללמוד תגובות אנזימים כפונקציה של טמפרטורה, pH, או תנאי פתרון אחרים, ואת ההשפעות של מעכבי ניתן לקבוע.

לאחרונה, nmr-מבוססי האנזים פעילות אנזימים הוכחו עבור הקרנת קטע3,4. Nmr מבוסס בחני מתאים באופן אידיאלי לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן (לעתים קרובות גבוה כמו 1 מ"מ) נדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה משווה בחיוב על spectrophotometric בחני היכן בעיות התערבות קריאה-out מתעוררות לעתים קרובות מתרכובות עם פרופילי UV-vis חופפים. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. יתרון זה הופך אותם לשימושיים כגון אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת תפוקה גבוההומיון שחקן ראשי.

במעבדת המחקר שלנו, בחני-מבוסס על הפעילות המבוססת משמשים כדי לזהות ולהעריך מעכבי של trichomonas וגיפרוציץ נוקלאוסייד ריבוליסיס. הטפיל ה -T וגינגיט גורם למחלות המועברות במין הלא-נגיפית הנפוצות ביותר6. התנגדות הגוברת לטיפולים הקיימים7 הוא המניע את הצורך הרומן, מנגנון מבוססי טיפולים, עם מסלול הצלה נוקלאוטיבצד העיקרי המייצג יעדים ראשוניים8. NMR-מבוסס על פעילות שפותחה עבור pyrimidine ו-purine הסגולי, ולאחר הריבוהידקלז נוקלאוטיל9, ו אדנוזין/guanosine העדפת נוקלאוטיההידרוקלז (agnh)10. התגובות מזרז על ידי שני אנזימים אלה מוצגים באיור 1. Nmr בחני נמצאים בשימוש כדי להקרין ספריות קטע עבור נקודות ההתחלה כימיים, לקבוע את IC50 ערכים, ולעשב מתחת מעכבי מבוסס מצבור או מעכבים כריכה מבוססת11. אותו הדבר גם להיות מתורגם כדי להעריך את פעילות האנזים בתאים שלמים12.

פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו ניתן להבחין במצע ומוצרי מוצר ולהבחין בספקטרוסקופיית NMR. . שלוש הנחות נעשו לפשטות ראשית, המצע לא צוין. עבור הפעילות nmr-מבוסס בחני אומר להיות שימושי, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר מ 2-3x הערך Km 4. בדוגמאות המוצגות, הריכוזים הסופיים של אדנוזין ו 5-פלואורוורידין הם 100 μM (km = 54 μm) ו 50 μm (km = 15 μm), בהתאמה. בפרוטוקולים, השגת ריכוזים אלה מתאים 12 μL של 5 מ"מ אדנוזין או 12 μL של 2.5 mM 5-פלואור.

שנית, כמות האנזים המסופק עבור בפרוטוקולים, 5 μL, נבחר להתאים את הסכום הנדרש כדי לגרום כ 75% המרה של מצע למוצר בתוך 30 דקות. כמות זו מייצגת בדרך כלל דילול גדול ממניות אנזימים מטוהרים, והדילול חייב להיקבע מראש לכל אנזים. מטוהרים AGNH ופתרונות מלאי אנזימים מאוחסנים ב-80 ° c ב ali, אשר מספקים מספיק אנזים עבור כמה אלפי תגובות. לפיכך, גורם הדילול באופן אידיאלי צריך להיקבע או להיות מאומת כל כמה חודשים. שלישית, ניסוי 1D NMR הספציפי לא צוין. בתוצאות הנציג, 1H nmr מוצג עבור agnh10 ו- 19F nmr מוצג עבור ללא9, עם ניסוי nmr המתואר ההפניות המתאימות. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין. לבסוף, יש לציין כי הגישה הניסיונית תיאר אינו תואם את הדרישות הקפדניות של nmr כמותי (qnmr)13,14. בפרוטוקול, תגובת אחוז נקבעת באמצעות השינויים היחסיים באינטנסיביות של אותה תהודה בכל קשת, ולא על-ידי קביעת ריכוזים מוחלטים. גישה זו מבטלת את הצורך ברכישת נתונים ועיבוד שינויים, כמו גם סטנדרטים פנימיים או חיצוניים, אשר נדרשים qNMR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מתחם הבדיקה הראשונית בחני ב 500 μm ו 250 μm

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות המניה של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ובמתחם 50 mM במבחן diמתיל סולפוקסיד (DMSO). עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד מ-4 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 4.
    3. הוסף 6 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 (0 דקות בקרה) ו-4 (30 דקות בקרה). הוסף 6 μL של תרכובת הבדיקה לצינור 2. הוסף 3 μL של מתחם בדיקה 3 μL של DMSO שניוני כדי צינור 3.
  2. הכינו פתרון מספיק. מלאי התגובה
    הערה: פתרון המניה הוא עבור חמש תגובות כי כל אחד מכיל 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאומיום, ו 5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא). עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון אנזים לשימוש.
    1. הוסף 2.59 mL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH 6.5) ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 300 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 25 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    2. הפוך בעדינות את צינור החרוט פעמיים כדי לערבב.
  3. במקביל ליזום ולהרוות את תגובת הבקרה 0 דקות. העברת 582 μL של פתרון מלאי התגובה לצינור microfuge נקי. הוסף 10 μL של 1.5 M HCl לצינור microfuge זה. העבר את משולב 592 μL ל microfuge tube 1. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת.
  4. ליזום ולהפעיל את שלוש התגובות הנותרות בצורה מתנדנדת. בזמן 0 דקות, להעביר 582 μL של פתרון מלאי התגובה microfuge tube 2. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. חזור על מרווחי 30 עבור microfuge צינורות 3 ו 4. . חכה 30 דקות
  5. . להרוות את התגובות בזמן 30 דקות, להוסיף 10 μL של 1.5 M HCl כדי microfuge 2. חזור על מרווחי 30 עבור microfuge צינורות 3 ו 4. העברת 600 μL של פתרון מכל microfuge לצינורות NMR.
  6. השיגו ספקטרום של 1 d NMR בכל דוגמה. עבד את הנתונים כדי להבטיח תיקון שגוי ותוכניות בסיסיות שטוחות.
  7. לחשב את אחוז ההמרה של מצע עבור ספקטרום הבקרה.
    1. שכבת-על של הספקטרום עבור 0 דקות ו-30 דקות של פקדים. שנה את קנה המידה של אות המצע בפקד 0 דקות כדי להתאים לפקד 30 דקות. שים לב לאחוז זה.
    2. חישוב ההמרה אחוז כמו (100 – אחוז נקבע בשלב 1.7.1).
  8. לחשב את אחוז ההמרה של מצע לתגובות המכילות מתחם בדיקה.
    1. ספקטרום שכבת-על עבור הפקד 0 דקות והתגובה הראשונה המכילה את מתחם הבדיקה 500 μM. שנה את קנה המידה של אות המצע בפקד 0 דקות כדי להתאים לספקטרום עם מתחם הבדיקה. שים לב לאחוז זה. חישוב אחוז המרה כמו (100-אחוז נקבע).
    2. חזור על התגובה השנייה המכילה את מתחם הבדיקה 250 μM.
  9. לחשב את התגובה אחוז ואת אחוז עכבות עבור כל ריכוז מתחם מבחן.
    1. לחשב את התגובה אחוז כמו (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. חשב את אחוז העכבות כמו (100 – אחוז שנקבע בשלב 1.9.1).

2. קביעת ערכי50 IC

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות מניות של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ו 10 מ"מ בדיקה במתחם DMSO. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
  2. הכנת הדלעות סדרתיות של שטח בדיקה של 10 מ"מ (ב DMSO הדאוט).
    1. הוסף 36 μL שניוני עד חמישה 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 5.
    2. הוסף 12 μL 10 מ"מ מתחם הבדיקה לצינור 1 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 2.5 מ"מ.
    3. העבר 12 μL מצינור 1 לצינור 2 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.63 מ"מ. העבר 12 μL מצינור 2 לצינור 3 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.16 מ"מ. העבר 12 μL מצינור 3 לצינור 4 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.04 מ"מ. העבר 12 μL מצינור 4 לצינור 5 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.01 מ"מ.
  3. הכינו 14 1.5 mL microfuge צינורות לתגובות.
    1. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד 14 1.5 mL microfuge צינורות, 1-14.
    2. הוסף 12 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 (0 דקות בקרה) ו -14 (30 דקות בקרה).
    3. הוסף 12 μL של 10 מ"מ מתחם בדיקה לצינורות 2 ו 3. הוסף 12 μL של 2.5 מ"מ מתחם מבחן כדי צינורות 4 ו 5. הוסף 12 μL של 0.63 מ"מ מתחם מבחן כדי צינורות 6 ו 7. הוסף 12 μL של 0.16 מ"מ מתחם מבחן לצינורות 8 ו -9. הוסף 12 μL של 0.04 מ"מ מתחם מבחן לצינורות 10 ו -11. הוסף 12 μL של 0.01 מ"מ מתחם מבחן לצינורות 12 ו -13.
  4. הכנת פתרון מלאי תגובה מספקת כדי להפעיל 15 תגובות המכילות 511 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאונטיום, ו-5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא) כל אחד. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון אנזים לשימוש.
    1. הוסף 7.67 mL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5) ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 900 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 75 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    2. היפוך עדין של שפופרת החרוט 2x כדי לערבב.
  5. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3 – 1.9 (באמצעות 576 μL של פתרון מלאי התגובה) כדי לקבוע את התגובה האחוז עבור כל ריכוז מתחם מבחן.
  6. חישוב ערך IC50 באמצעות מנסרה.
    1. צור טבלת נתונים הקשורים יומן של בדיקת התגובה ריכוזי מורכבים (200 μM, 50 μM, 12.5 μM, 3.13 μM, 0.78 μM, 0.20 μM) עם תגובת אחוז (שני ערכים כל אחד).
    2. השתמש בעקומה לא לינארית כדי לקבוע את ערך ה-IC50 ושגיאת התקן.

3. אבקת מונה מסך המונה Assays ב 100 μM ו 50 μM

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות מניות של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ו 10 מ"מ בדיקה במתחם DMSO. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) על כל אחד שמונה 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 8.
    3. הוסף 6 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 ו-5 (0 דקות בקרה) ו-4 ו-8 (30 דקות שליטה). הוסף 6 μL של תרכובת הבדיקה לצינורות 2 ו-6. הוסף 3 μL של תרכובת הבדיקה 3 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 3 ו -7.
  2. הכנת פתרון מלאי תגובה מספקת ללא ניקוי כדי להפעיל חמש תגובות המכילות 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאונטיום, ו-5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא) כל אחד. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון אנזים לשימוש.
    1. הוסף 2.59 mL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5) ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 300 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 25 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    2. היפוך עדין של שפופרת החרוט 2x כדי לערבב.
  3. הכנת פתרון מלאי תגובה מספקת עם 0.01% v/v טריטון X-100 אבקת להפעיל חמש תגובות המכילות 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאונטיום, ו-5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא) כל אחד.
    1. הוסף 2 μL של טריטון X-100 אבקת כביסה ל 20 מ מ של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5). יש להשתמש בפתרונות חומרי ניקוי תוך יום אחד.
    2. הוסף 2.59 mL של מאגר התגובה המכיל 0.01% טריטון X-100 אבקת כביסה ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 300 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 25 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    3. היפוך עדין של שפופרת החרוט 2x כדי לערבב.
  4. עבור צינורות 1 – 4, באמצעות פתרון מניות התגובה ללא ניקוי, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3 – 1.9 כדי לקבוע את אחוז העיכוב עבור כל ריכוז במבחן מורכב.
  5. עבור צינורות 5 – 8, באמצעות פתרון מלאי התגובה עם 0.01% v/v הטריטון X-100 כביסה, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3 – 1.9 כדי לקבוע את אחוז העיכוב עבור כל ריכוז מתחם בדיקה.

4. קפיצה-דילול מונה המסך מאמר

  1. הכן את המצע ואת תרכובות הבדיקה לתגובות
    1. הכנת פתרונות מניות של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ו 10 מ"מ בדיקה במתחם DMSO. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 53.8 μL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5) לשני 1.5 mL microfuge צינורות (כל אחד), 1 ו 2. הוסף 5 μL של אנזים (AGNH או לא) לצינורות 1 ו-2.
    3. הוסף 511 μL של מאגר התגובות שני 1.5 mL microfuge צינורות, 3 ו-4 (כל). הוסף 60 μL של תחמוצת דאומוניום לצינורות 3 ו-4. הוסף 5 μL של אנזים (AGNH או לא) לצינורות 3 ו-4.
    4. הוסף 1.2 μL של DMSO הדאומנטי לצינור 1 (30 דקות בקרה). הוסף 1.2 μL של מתחם הבדיקה לצינור 2. הוסף 12 μL של DMSO שניוני לצינור 3 (30 דקות בקרה). הוסף 12 μL של מתחם בדיקה לשפופרת 4. . מודקון למשך 30 דקות
  2. הכן 2 1.5 mL microfuge צינורות עם תמיסת דילול.
    1. הוסף 468 μL של מאגר התגובה לכל אחד 2 1.5 mL microfuge צינורות, 5 ו 6. הוסף 60 μL של תחמוצת דאומיום לכל צינור (5 ו-6).
  3. הכן ארבעה 1.5 mL microfuge צינורות עבור התגובות.
    1. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד מ-4 1.5 mL microfuge צינורות, 7 – 10.
  4. לבצע מדלל לקפוץ וליזום את התגובות.
    1. העבר 528 μL של הפתרון מצינור 5 לצינור 1. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. העבר 528 μL של הפתרון מצינור 6 לצינור 2. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת.
    2. בזמן 0 דקות, העברת 588 μL של הפתרון מצינור 1 לצינור 7. מנושף ומוותר על הדגם 2x בצורה איטית אך מכוונת. במרווחי זמן של 30, העבר 588 μL של הפתרון מצינור 2 לצינור 8, צינור 3 לצינור 9, ו צינור 4 לצינור 10. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. . חכה 30 דקות
  5. עבור צינורות 7 – 10, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.5 – 1.9 כדי לקבוע את אחוז העכבות עבור כל ריכוז מתחם בדיקה.

5. כתוב בתרכובת E. coli שלמות התאים

  1. הכינו 10 מ ל תרבות לילה של E. coli ביום לפני ניסויים.
  2. הכינו תאי אי-קולי . לניסויי nmr
    1. צנטריפוגה את התאים ב 1 mL במשך 10 דקות ב 15,000 x g.
    2. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש כל סדרת מחלקים של תאים 1 מ ל של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M kcl, pH = 6.5) על ידי vortexing.
  3. בצע את סעיפים 1 או 2 עבור הערך הרצוי עם השינויים הבאים:
    1. תחליף 280 μL של מאגר בפתרון מלאי התגובה עם 280 μL של תאים מושעה מחדש.
    2. תחליף 5 μL של אנזים (AGNH או הארה ב) בפתרון מניות התגובה עם 5 μL של מאגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מציג את התוצאות עבור בדיקת שתי תרכובות נגד agnh באמצעות 1H nmr לאחר סעיף 1. תגובת האנזים הוא נצפתה ביותר בקלות וכימות על ידי העלמות של אדנוזין סינגקל ובלתי מאפשרים מהדהד ב 8.48 ppm ו 6.09 ppm, בהתאמה, ואת המראה של אדנוטין סינגקל תהודה ב 8.33 לדפים לדקה כפי שנצפתה 30 דקות בקרת ספקטרום. בנוכחות של 500 μM מתחם 1, אין מוצר נוצר כפי שמעידים על ידי חוסר תהודה אדנין ב 8.33 ppm. בנוכחות של 250 μM תרכובת 1, כ -10% מהמצע הומר למוצר. לעומת זאת, הריכוז של מתחם 2 מעכב את האנזים כפי שמעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המתוארים הם חלים בדרך כלל על אנזימים רבים, בתנאי כי מצעים ו/או מוצרים יש אותות הניתנים לפתירה בספקטרום NMR. עם זאת, חשוב כי ריכוז המצע קרוב לערך Km שלה מספיק גבוה כדי להתגלות בניסוי nmr בתוך פרק זמן סביר. המצע ריכוז לא גבוה יותר 2-3x ערך Km הוא אופטימלי לגילוי תחרותי, לא תחרותי, מעכבי בלתי תחרותיים4. כפי שמוצג כאן עבור ה, המצע, ערכי Km נמוך כמו 15 μm מתאימים. השימוש של מצעים עם CH3 או CF3 אותות, ביחד עם א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד ר הדיקן בראון על מתן תרכובות מספריית החלקים של אסטרזמקה וד ר דוד פרקין למתן אנזימים בעלי הדין והאנזים. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R15AI128585 ל B. J. S. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. המחקר נתמך גם על ידי מלגת מחקר הקיץ של הוראס ג'י מק הוענק ל-S. N. M, משפחת לנדסברג המענק הוענק לג א., ולמענקים לפיתוח הפקולטה ולפרס פרדריק בטלהיים מאוניברסיטת אדלפי, לשנת B. J.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AGNHמטוהר בביתN/ATVAG_213720
UNHמטוהר בביתN/ATVAG_092730
אדנוזיןסיגמאA9251
5-פלואורורידיןסיגמאF5130
דימתיל סולפוקסיד-D6מעבדות איזוטופ קיימברידג'DLM-10-100D, 99.9%
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigmaP0662
אשלגן פוספט דו-בסיסיSigmaP3786
אשלגן כלוריSigmaP9541
תחמוצת דאוטריוםCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99.9%
חומצה הידרוכלוריתפישרכימיקל A144212
Triton X-100SigmaX100
3-(טרימתילסיליל) פרופיוניק-2,2,3,3,-d4 מלח נתרן חומצה (TSP)סיגמא269913D, 98%
2,2,2-טריפלואורואתנול-1,1-d2סיגמא612197D, 99.5%
פיפטהגילסוןF123602PIPETMAN Classic P1000
פיפטהגילסוןF123601PIPETMAN Classic P200
פיפטהגילסוןF123600PIPETMAN Classic P20
צינורות מיקרופוגהפישר סיינטיפיק05-408-129
צינורות חרוטייםקורנינג352099
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף5418
מערבל מערבולתפישר סיינטיפיק02215365
צינורות NMRNorell502-7או לפי ההתאמה לספקטרומטר NMR NMR
BrukerN/ פריזמה AvanceIII500
GraphPadN/Aגרסה 5.04
תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NMRIC50NMRNMR

מאמרים קשורים