הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59962

⸱

31 ביולי 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחדיר נוקאאוט גן לתוך amastigote החילוץ של טריאנוסומה cruzi, באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. פנוטיפ הצמיחה ניתן לעקוב גם על ידי ספירת התאים של התרבות האמסטימית axenic או על ידי התפשטות amastigote תאיים לאחר הפלישה התא מארח.

תקציר

טריאנוסומה cruzi היא מחלת פתוזוזה טפיל הגורם המחלה של חגיאס בעיקר באמריקה הלטינית. כדי לזהות מטרה התרופה הרומן נגד T. cruzi, חשוב לאמת את החומריות של הגן היעד בשלב היונקים של הטפיל, amastigote. Amastigotes של T. cruzi לשכפל בתוך התא המארח; לפיכך, קשה לבצע ניסוי מנוקאאוט מבלי לעבור בשלבים התפתחותיים אחרים. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחה על מצב גדילה שבו amastigote יכול לשכפל באופן מאקסיבי עד 10 ימים מבלי לאבד מאפיינים כמו amastigote שלה. באמצעות התרבות הרקתית הטמפורלית הזאת, הצגנו בהצלחה gRNAs ישירות לתוך Cas9 ביטוי amastigote כדי לגרום הסתרה גנים וניתח פנוטיפים שלהם באופן בלעדי בשלב amastigote. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי לייצר בעלי מיסוי מתורבת, amastigotes הנגזרים, ולהשתמש בתרבות axenic ב-CRISPR/Cas9-מתווך ניסוי הסתרה. פנוטיפ הצמיחה של בנוקאאוט amastigotes יכול להיות מוערך גם על ידי ספירות התא של התרבות axenic, או על ידי השכפול של amastigotes תאיים לאחר הפלישה תא מארח. שיטה זו עוקפת את השלב הטפיל בידול בדרך כלל מעורב בהפקת הטרנסגניים או amastigote נוק. הניצול של התרבות הרקתית הטמפורלית יש את הפוטנציאל להרחיב את החופש הניסיוני של מחקרים ספציפיים לבמה ב -T. cruzi.

מבוא

טריאנוסומה cruzi הוא הסוכן סיבתי של מחלת חגיאס, אשר נפוצה בעיקר באמריקה הלטינית1. T. cruzi יש שלבים מחזור החיים הייחודיים כפי שהוא נע בין וקטור חרק מארח יונקים2. T. cruzi משכפל כמו epimastigote ב באמצע המעיים של חרק triatomine דם מוצץ ומבדיל לתוך המעי הקדמי זיהומיות טריאואסטיגוטה בבטן לפני שהופקדו על מארח אדם או בעלי חיים. ברגע שטריאומואסטיט נכנס לגוף המארח דרך אתר העקיצה או דרך קרום רירי, הטפיל פולש לתא מארח והופך לצורה עגולה פחות שנקראת amastigote. ה-amastigote משכפל בתא המארח ובסופו של דבר מבדיל לטרימטואסטיגוטה, הפורץ מתוך התא המארח ונכנס לזרם הדם כדי להדביק תא מארח נוסף.

מאז הזמינים כיום סוכני כימותרפיה, בנזיל ו nifurטימופייביץ ', לגרום תופעות לוואי שליליות אינן יעילות בשלב כרונית של המחלה3, זה מעניין מאוד לזהות מטרות התרופה הרומן נגד T. cruzi. בשנים האחרונות, מערכת CRISPR/Cas9 הפכה כלי רב עוצמה כדי לבצע ביעילות בנוקאאוט גנים ב T. cruzi, או על ידי התפתחות של נפרד או בודד פלמיד (s) המכיל grna ו Cas94, על ידי ביטוי יציב של Cas9 ואחריו מבוא של grna5,6,7 או שעתוק תבנית של grna8, או על ידי אלקטרופורציה של הוקמה מראש grna/Cas9 rnp קומפלקס7,9. התקדמות טכנולוגית זו צפויה להאיץ את מחקר מטרות הסמים במחלת צ'אס.

כדי להמשיך בפיתוח התרופה, חיוני לאמת את החיוניות של הגן היעד או היעילות של תרכובות מועמדים לסמים ב-amastigote של T. cruzi, כפי שהוא שלב השכפול של הטפיל במארח היונקים. עם זאת, זוהי משימה מאתגרת, בגלל amastigotes לא ניתן לטפל ישירות בשל נוכחותם של תא מארח חסימתית. ב לישמניה, הקשורות באופן הדוק מאוד טפיל ל T. cruzi, השיטה האמסטימית amastigote שפותחה והיה מנוצל בסינון תרופות בחני10,11,12, 13. למרות שיש כמה אי-התאמות ברגישות לתרכובות בין האקסטיגוטים amastigotes ו תאיים מאוד14, היכולת לשמור על התרבות axenic בכל זאת מספק כלים ניסיוניים יקרי ערך ללמוד את ביולוגיה בסיסית של השלב הרלבנטי הקליני של לישמניה15,16. במקרה של T. cruzi, הספרות לגבי נוכחות של מוצרים באופן טבעי amastigotes (ea)17 ובייצור מחוץ לתחום של EA17,18,19 תאריך חזרה . לפני עשרות שנים בנוסף, EA ידוע יש יכולת מדבקת20, אם כי פחות מזה של טריאומואסטיגוטה, ואת המנגנון של הפלישה מארח amastigote כבר הובהר בשנים האחרונות (נבדקו על ידי bonfim-מלו אל.21). עם זאת, בניגוד לישמניה, EA לא היה מנוצל ככלי ניסיוני ב -T. cruzi, בעיקר בגלל EA היה נחשב כטפיל מחייב תאיים, ולכן לא נחשב בתור "הטופס replicative בצורה מעשית גיוני.

לאחרונה, הקבוצה שלנו הציע לנצל EA של T. cruzi כתרבות האקסון הזמני22. Amastigotes של T. cruzi tulahuen מאמץ יכול לשכפל חינם של תאים מארחים במדיום LIT ב 37 ° צ' עד 10 ימים ללא הידרדרות מרכזית או אובדן של תכונות כמו amastigotes. במהלך תקופת הצמיחה המארחת ללא תשלום, EA היה מנוצל בהצלחה עבור ביטוי גנים אקסוסוגני על ידי electroporation קונבנציונאלי, התרופה טיטור שיטת עם תרכובות טרינורצח, ו CRISPR/Cas9-בתיווך הנוקאאוט ואחריו בניטור הצמיחה פנוטיפ. בדו ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט כדי לייצר ב-EA מחוץ למבחנה ולנצל את האמסטיגוטה האקסון בניסויי הנוקאאוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: סקירה של הזרימה הניסיונית כולה מתוארת באיור 1.

figure-protocol-1
איור 1: מבט כולל על ניסוי ההסתרה באמצעות EA. רקמת התרבות-הטרימטיקה הנגזרת של העור הם קוצרים והבדיל לתוך EA. gRNA הוא מנוכר לתוך Cas9-ביטוי amastigotes על ידי אלקטרופורציה, והצמיחה פנוטיפ של הסתרה amastigotes מוערך גם על ידי שכפול axenic או על ידי שכפול תאיים לאחר פלישת התאים המארחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. ההכנות לתרבות הטפיל

  1. Tulahuen המתח של טריאנוסומה cruzi משמש לאורך הדו ח הזה. לשמור על epimastigotes של T. cruzi ב- LIT בינונית (10% fcs, ראה שולחן משלים 1). סגרו את המכסה באופן מאובטח ושמרו על הבקבוקון של התרבות ב -28 ° c.
  2. צור זן הטרנסגניים של T. cruzi כי הנמלים Cas9 endonuclease. דוגמאות של פלמידים הביטוי המכילים רצף Cas9 coding ו G418 (ניאוr) בחירת סמן ניתן למצוא לנדר ואח '4 ופנג ואח '5
    1. באמצעות הקיט הרשום בטבלת החומרים, מעביר את הפלסטלינה למעלה לאפימסטיגוטה על ידי אלקטרופורציה. עבור 1 קובט, ספין למטה 2 x 107 תאים, למחוק את supernatant, ולהשעות מחדש עם 100 μl של מאגר אלקטרופורציה המכיל את הפתרון המוסף המסופק.
      הערה: מאגר אלקטרופורציה יכול להיות מוחלף עם מאגר EM24 (3:1 תערובת של cytomix25 ו פוספט-סוכרוז מאגר).
    2. הוסף 20-40 μg של פלאמיד והעבר את התערובת לתוך קובט אלקטרופורציה מרווח של 2 מ"מ. החל את הפעימה בהתקן אלקטרופורציה (ראה טבלת חומרים), באמצעות תוכנית X-1426.
    3. העבר את תוכן קובט לבקבוקון T-25 המכיל 5 מ ל של מדיום מוארת (10% FCS). מפעיל את הבקבוקון ב -28 ° c. במשך 24 שעות
    4. הוסף G418 לריכוז הסופי של 250 μg/mL והמשך הדגירה ב -28 ° c. זה לוקח בערך שבוע לכבות. את האפימסטיטים הלא-מזוהמים לאחר האוכלוסיה עמיד G418 מתחיל להתאושש, מעבר התרבות פעם או פעמיים בשבוע כדי למנוע רוויה ולדלל את התאים המתים. הקמת קו תא יציב בדרך כלל לוקח בסך הכל 4 שבועות.
      הערה: אם הביטוי הקונסטיטוטיבי של Cas9 הוא נטל של התא5, להפוך את הביטוי ספציפי לשלב amastigote על ידי מעלה את 3 '-utr של גן amastin מיד במורד הCas9 פתוח קריאה מסגרת27. התיאור המפורט של מרכז הCas9 המסוים הספציפי ביותר ניתן למצוא בטקאגי אל.22
  3. להקים שיתוף הטפיל האנטי-שותף של Cas9-הביע T. cruzi ותאים מארחים מיונקים. בדו ח זה, השתמש בתאים 3T3-השוויצרי לבקן פיברוסט כמארח.
    1. להבדיל בין טי. קרוזי לבין. לקבוע את צפיפות התא של התרבות epimastigote באמצעות המטוציטומטר ולאסוף 5 x 107 תאים על ידי צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 2,100 x g. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים עם 10 מ ל של מדיום RPMI. מודאת הטפיל ב 28 ° צ' עבור 1 שבוע28.
    2. לאסוף את הטריסטיסטילסטיגוטים. בRPMI בינוני להטות בזהירות את הבקבוקון ואת ללטף את הפתרון מבלי להפריע טפילים דבקה על פני השטח התחתון. העבר את המדיום לצינור חרוט וצנטריפוגה עבור 15 דקות ב 2,100 x g. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הטפיל עם 5 מ ל של DMEM (10% FCS).
      הערה: אוכלוסיית הטפיל היא תערובת של מטאקלוסטיגוטיס, אפימטאסטטים וצורות ביניים מסוימות. למרות שאין צורך בכך, ניתן לבודד את הטריאומואסטיט באמצעותכרומטוגרפיה של שערי היון של deae. לחילופין, epimastigotes ניתן לחסל על ידי הדגירה טפילים עם סרום פעיל לנושא אותם כדי להשלים את הליזה30.
    3. זרעי 3T3-השוויצרי לבקן פיברוהפיצוץ תא 60-70% שליטה, או על 1.7-2.0 x 106 תאים ב 5 מ ל של dmem (10% fcs) בבקבוקון תרבות T-25. להסיר בינוני גדילה להחיל את התערובת טפיל משלב 1.3.2. מודטה עבור 24 h ב 37 ° c תחת 5% CO2 בחממה מחולל לחות כדי ליצור זיהום.
    4. הסירו את הטפילים שנותרו מחוץ לתאים המארחים 3T3 על ידי שטיפת תרבות שיתוף עם DMEM (10% FCS) פעמיים.
    5. לאחר שיתוף התרבות המשותף רווי, מעבר לתאי המחשב הפונדקאי הנגוע באמצעות טריסינוניזציה. . ולשטוף את התרבות פעם אחת עם הערוץ החל 1 מ ל של 0.05% טריפסין פתרון לכסות את משטח התרבות כולו, ו דגירה למשך כמה דקות בטמפרטורת החדר עד התאים המארחים המחוברים להשתחרר. ניתוק התאים ממשטח הבקבוקון על-ידי שטיפה 3 מ ל של DMEM (10% FCS) על התאים.
    6. להעביר תאים מארחים מנותקים לתוך צינור חרוט, ו צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 300 x g. משלחים את הסופרנטאנט ומחדשים את התאים עם 3 מ ל של DMEM טרי (10% FCS). שלב זה מסייע בסילוק אפימסטיגוטים שנותרו. העבר הכל לתוך בקבוקון T-75 נקי המכיל 9 מ ל של DMEM (10% FCS). המשיכו לעשות זאת עד שטריאומואסטיט משתחרר לתוך התרבות הסופרנטית.
    7. שמור על תרבות השיתוף על ידי הפסשה עם טריסיזציה פעמיים בשבוע. לאחר 70-80% של האוכלוסייה המארחת להידבק, באופן קבוע להוסיף מארח נגוע 3T3 תאים ביחס של 5:1 (בנושא: טרי), על מנת למנוע הידרדרות התרבות. טריאומואסטיט מגרפות ברציפות אם האיזון בין תאים מארחים לבין T. cruzi נשמר כראוי.

2. הבדלה באמצעות טרימטואסטיגוטס לתוך EA

  1. ביום שלפני הניסוי הזה, להסיר את המדיום צמיחה של שיתוף הפעולה טפיל מארח ולהוסיף DMEM טרי (10% FCS) לשטוף את EA ו טריאומווליטים כי כבר שוחרר מן התאים המארחים בימים קודמים. ניסויים רגילים דורשים לפחות שתי מבחנות T-75 של תרבות שוטפת של confluent.
  2. לאסוף את התרבות הסופר לתוך צינור חרוט לקצור את טריאומואסטיגוטס טרי. בדוק את המדגם תחת מיקרוסקופ (10x או 20x עדשה אובייקטיבית) עבור איכות. אם יש פסולת תא מארחים, יש לפרק בקצרה את הדגימה ולהעביר את הסופרנטאנט לתוך צינורית חדשה. אם יש מספר משמעותי של Ea, לבודד את הטריאואסטיוליטים על ידי הליך השחיה הבא.
    1. לסובב את התערובת של טריאומוסטיגוטים ו-amastigotes עבור 15 דקות ב 2,100 x g. התעלם מרוב הסופרנטנט, והשאיר 0.5-1.0 מ ל של המדיום בצינור.
      הערה: הפחתת אמצעי האחסון היא אופציונלית, אך היא הופכת את השלב הבא לקל יותר.
    2. דגירה את הגלולה ב 37 ° c עבור 1-2 h, המאפשר טריאומואסטיגוטים פעילים לשחות מתוך הגלולה (איור 2).
    3. העבר את הסופרנאנט המכיל טריקומאסטיוליטים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  3. צנטריפוגה את צינור החרוט עבור 15 דקות ב 2,100 x g כדי לאסוף טריאומואסטיוליטים. אם הליך השחייה-out התבצע לעיל, צנטריפוגה את שפופרת 1.5 mL עבור 2 דקות ב 4,000 x g כדי הגלולה טריאואסטיגוטה. . מחק את הסופרנטאנט
  4. השהה מחדש את הגלולה עם 5 מ ל של DMM באגירה עם 20 מ"מ MES (pH 5.0), שיושלם עם 0.4% BSA19. להעביר את הטפיל. לבקבוקון תרבות טי -25 . תשאיר את הכובע רופף צפיפות התא חייבת להיות סביב או מתחת 1 x 107 תאים/mL, מאז הרוויה מגביר את הסיכוי של מוות התא.
    הערה: צבע ה-DMEM חייב להיות צהוב, לא כתום. אם DMEM המקורי היה קיבולת אגירה גבוהה, 20 מ"מ MES (pH 5.0) אינו מספיק כדי להקטין את ה-pH. ה-pH של המדיום חייב להיות מותאם על ידי הוספת HCl במקרה זה. ניתן לשמור על המדיום החומצי ב -4 ° c, אך לא יותר מחודש אחד.
  5. מודטה את הבקבוקון של התרבות ב 37 ° c תחת 5% CO2 באינקובטור מחולל. סביב 95% של טפילים להבדיל לתוך amastigotes לאחר 24 h.

3. אלקטרופורציה של EA

  1. הכן gRNA עבור אלקטרופורציה. זה יכול להיעשות על ידי שעתוק חוץ גופית, או פשוט על ידי רכישת רנ א סינתטי oligונומ מהיצרן. בדוח זה, crRNA ו tracrRNA מ-DNA משולבת טכנולוגיות, Inc. משמשים.
  2. צנטריפוגה את התרבות של המלווים עבור 15 דקות ב 2,100 x g. . להיפטר מסופרנטאנט
  3. השהה מחדש את הגלולה עם מאגר אלקטרופורציה המכיל את הפתרון המוסף לצפיפות התא הסופית של 1 x 108 תאים/mL.
    הערה: מאגר EM גורם למותם יותר של תאים בהשוואה למאגר האלקטרופורציה המפורט ברשימת החומרים; לפיכך, היא אינה מומלצת לתרגום מדהים (איור משלים 1).
  4. Aliquot 100 μL של טפילים מושעה (1 x 107 תאים) לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. הוסף 5-10 μg של gRNA ולערבב בעדינות על ידי ליטוף.
  5. העבר את התערובת לקובט אלקטרופורציה מרווח של 2 מ"מ. החל את הפעימה בהתקן האלקטרופורציה, באמצעות תוכנית X-14.
  6. העבר את תוכן קובט לבקבוקון T-25 המכיל 5 מ ל של מדיום מחומם מראש (10% FCS). להשאיר את הכובע רופף ומלא את הבקבוקון ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  7. לנטר את צמיחת התא על ידי המשך של culenic קולטיורינג (סעיף 4) או כמו amastigotes תאיים לאחר זיהום תא מארח (סעיף 5).

4. ניטור התפתחותם של תאים מנוקאאוט כמו Axenic Amastigotes

  1. המלווים להתיישב בתחתית בינונית התרבות, כל כך בעדינות לנער את הבקבוקון כדי להשעות אותם מחדש לתוך הפתרון. שטיפת משטח הבקבוקון באמצעות ליטוף עוזרת, מכיוון שתאים מסוימים מתאחדים לבקבוקון.
  2. מערבבים 1 μL של propidium יודיד (PI) פתרון (20 μg/mL) עם 20 μL של תרבות amastigote.
    הערה: אין להשאיר את הבקבוקון התרבותי מחוץ לחממה במשך זמן רב מהדרוש. טמפרטורה היא אחד הגורמים המאפשרים התפשטות axenic22.
  3. החילו את המדגם על הימוציטומטר וצפו תחת מיקרוסקופ של זריחה. PI הוא התכוון לפגום קרום התא אבל הוא נשלל מתאים חיים. לספור את מספר amastigotes קיימא שאינם מוכתם על ידי PI (לשעבר/em 570 nm/602 nm).

5. ניטור הצמיחה של תאים נוקאאוט כמו Amastigotes תאיים

  1. הזרע מארח 3T3 תאים בצלחת 12-באר עם DMEM (10% FCS). כוונן את צפיפות התא ל-70-80% בשטף, או כ-3 x 105 תאים לכל היותר.
    הערה: כיוון שהמאמסטיגוטים אינם מורצפת, המכסה את רוב משטח הגדילה בתאי המחשב המארח משפרת את יעילות הזיהום.
  2. לאסוף הסתרה amastigotes משלב 3.6 על ידי צנטריפוגה יום אחד לאחר electroporation. השמט את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הטפיל עם 2 מ ל של DMEM (10% FCS).
  3. הסר את המדיום מתרבית התא המארח והחל השעיה מחדש של amastigotes. ריבוי של זיהום צריך להיות 20 או יותר. דגירה את הצלחת ב 37 ° c תחת 5% CO2 עבור 2 ימים כדי לאפשר amastigotes להקים זיהום.
    הערה: תקופת הזיהום יכולה להיות. יום אחד, בהתאם למטרה
  4. שטוף את האות נשאר מחוץ לתאי המחשב המארח פעמיים עם DMEM (10% FCS).
  5. הוסיפו DMEM טרי (10% FCS) לתרבות המארחת-שיתוף הטפיל והמשיכו בדגירה ב-37 ° c למשך יומיים נוספים.
  6. כדי להעריך את יעילות הזיהום, להמחיש גרעינים של התאים המארחים ו amastigote תאיים.
    הערה: הגרעינים     נוטים להיות חופפים בתרבות רווי-שיתוף. לציפוי מחדש של התאים בצפיפות תא נמוכה יותר (כגון 1:5 דילול) לפני קיבוע והצביעת מסייע לספור גרעינים בקלות רבה יותר.
    1. להסיר בינוני התרבות ולהחיל 1 מ"ל של 10% הפתרון פורמלין ב-PBS כדי לתקן את התאים. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. החלף את פתרון פורמלין עם 1 mL של PBS המכיל 1 μg/mL hoechst 33342 ו 0.1% טריטון X-100. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. להסיר את הפתרון Hoechst ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. הוסף 1 מ ל של PBS טרי.
  7. להתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית ולזהות גרעיני תא מארח המשויכים גרעיני טפיל קטן יותר (איור 4). תאים מארחים המכילים יותר מ-2 amastigotes צריך להיחשב כנגועים, לא לכלול זיהום ראשוני שאינו פרודוקטיבי או לא מדומה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד של טרימטואסטיוליטים על ידי הליך השחייה

כדי לקצור טריאומואסטיגוטים טריים מזהמים הישן על ידי הליך לשחות-out, כדורי תא צריך להיות מודבטים לפחות עבור 1 h. הדגירה של כדורי עבור יותר 2 h אינו מגדיל באופן משמעותי את מספר טריאומואסטיגוטים שחייה בתמיסה ( איור 2B). בניסוי מסוים זה, אחוז טריאומואסטיגוט בתערובת הראשונית היה 38%, והאחוז שלאחר השחייה היה מעל 98% בכל נקודת זמן נתונה. משני T-75 מבחנות של שיתוף תרבות confluent, אנחנו באופן שגרתי להשיג 3-4 x ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדגמנו כי התרבות axenic של T. cruzi amastigotes יכול להיות מנוצל CRISPR/Cas9-תיווך גן בנוקאאוט, על ידי electroporating grna ישירות לתוך Cas9-המבטא EA. בדרך זו, החיוני של הגן היעד במיוחד בשלב amastigote ניתן להעריך מבלי לעבור בשלבים התפתחותיים אחרים.

עוד היבט מועיל של מעבר החצייה הוא הנוחות בבדיקות עבור מספר רב של גנים מטרה. לאחר שיתוף התרבות של Cas9-ביטוי T. cruzi ומארחים תא היונקים הוא הוקם, זה לוקח רק כמה ימים כדי להפוך את הרקמה הנגזרת טריאומווליטים לתוך EA ו transfect grna...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד אינטרסים לגלות.

תודות

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר 18K15141 כדי חתיכה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת פורמלין 20%FUJIFILM Wako Pure Chemical068-03863תאי קיבוע
25 ס"מ2 בקבוק תרבית כובע איטום כפולAGC טכנו זכוכית3100-025
75 ס"מ2 בקבוק תרבית כובע חותם כפולAGC טכנו זכוכית3110-075
הכל באחד מיקרוסקופ פלואורסצנטיKeyenceBZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (לשליטה)IDTמותאם אישית= GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (עבור TcCGM1)IDTרצף יעד מותאם אישית= TAGCCGCGATGGAGAGTTTTTTTGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (עבור TcPAR1)IDTרצף יעד מותאם אישית= CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIDT1072532לחישול עם crRNA
Amaxa Nucleofector DeviceLONZAAAN-1001אלקטרופורציה
ערכת נוקלאופקטור טפיל בסיסי 2LONZAVMI-1021אלקטרופורציה
BSASigma-AldrichA3294רכיב של המדיום עבור אמסטיגוגנזה במבחנה
Burker-Turk המוציטומטר חד פעמיWatson177-212Cספירת תאים
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple WellLights Corning3513
DMEMFUJIFILM Wako Pure Chemical044-29765תרבית
בינונית סרום בקר עוברי, מוגדרHycloneSH30070.03הפעלה בחום לפני השימוש
G-418 תמיסת סולפטFUJIFILM Wako Pure Chemical077-06433מבחר של טרנספורמנט
Hemin כלורידSigma-AldrichH-5533רכיב של מדיום LIT
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570צביעה של גרעינים
מרק עירוי כבד, DifcoBecton Dickinson226920רכיב של מדיום LIT
MESFUJIFILM Wako Pure Chemical349-01623רכיב של המדיום עבור אמסטיגוגנזה במבחנה
PBS (–)FUJIFILM Wako Pure Chemical166-23555
Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10MLצביעה של תאים מתים
RPMI 1646Sigma-AldrichR8758מדיום למטאציקלוגנזה
רצף יעד

מקורות

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012(2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388(2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547(1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341(2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088(2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370(2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960(2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR Cas9RNA
היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.