מחלות אנושיות מורכבות יכול להיות מאתגר למודל במערכות מסורתיות דגם מעבדה. כאן, אנו מתארים גישה כירורגית למודל מחלת שריר האדם באמצעות השתלת ביופסיות שריר השלד האנושי לתוך עכברים לקויה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני
במאמר זה
סיכום
תקציר
תופעות הטיפול שנצפו במחקרים בעלי חיים לעתים קרובות אינן מצליחות להיות מיובחנות בניסויים קליניים. בעוד בעיה זו היא רבת פנים, סיבה אחת לכישלון זה הוא השימוש במודלים מעבדה לקוי. הוא מאתגר לדגם מחלות אנושיות מורכבות באורגניזמים המעבדה המסורתית, אבל בעיה זו ניתן להקיף באמצעות לימוד של האדם xenografts. השיטה הכירורגית שאנו מתארים כאן מאפשר יצירה של שתלי השלד האדם שרירים xenografts אשר ניתן להשתמש מודל מחלת שרירים לבצע בדיקות טיפוליות טרום קלינית. תחת הלוח סקירה מוסדית (IRB)-פרוטוקול מאושר, דגימות שריר השלד נרכשים מחולים ולאחר מכן מושתלים לתוך נוד-Rag1nullIL2rγnull (NRG) מארח עכברים. עכברים אלה הם מארחים אידיאליים עבור לימודי השתלת בשל חוסר היכולת שלהם להפוך לימפוציטים בוגרת ולכן אינם מסוגלים לפתח תא בתיווך ותגובות החיסונית מוסרית הסתגלות. עכברים מארחים מרדימים עם isof, והשרירים הקדמית ופושט המים הקדמי מוסרים. חלק משריר האדם מוצב לאחר מכן בתוך תא השוקה הריק והוא מונח אל הגידים האבוקיים והמרוחק של השריר הארוך ביותר. השריר מושתל באופן ספונטני ומinnervated על ידי מארח העכבר, וכתוצאה מכך שריר האדם מחדש מכבש שיכול לשמש כמודל למחקרים פרה-קליניים.
מבוא
דווח כי רק 13.8% של כל תוכניות פיתוח הסמים שעברו ניסויים קליניים מצליחים להוביל טיפולים שאושרו1. בעוד ששיעור הצלחה זה גבוה יותר מ-10.4% שדווחו בעבר2, יש עדיין מקום משמעותי לשיפור. גישה אחת כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של ניסויים קליניים היא לשפר את דגמי המעבדה המשמשים במחקר טרום קליני. מינהל המזון והתרופות (FDA) דורש מחקרים בעלי חיים כדי להפגין יעילות טיפול ולהעריך רעילות לפני שלב 1 ניסויים קליניים. עם זאת, לעתים קרובות יש קונקורדנציה מוגבלת בתוצאות הטיפול בין לימודי בעלי חיים וניסויים קליניים3. בנוסף, הצורך בלימודי בעלי חיים פרה-קליניים יכול להיות מכשול בלתי ניתן להתפתחות טיפולית במחלות שאין בהן מודל בעל חיים מקובל, שלעיתים קרובות מדובר במחלות נדירות או מפוזרות.
אחת הדרכים למודל מחלת האדם היא על ידי שתילת רקמת האדם לתוך עכברים לקוי כדי לייצר שתלי xenografts ישנם שלושה יתרונות מרכזיים ל מבע מודלים: הראשון, הם יכולים ללכוד את העיוותים גנטית מורכבים אפיגנטיים הקיימים במחלה האנושית, כי ייתכן שלעולם לא להיות מיוכל במודלים של בעלי חיים אחרים. שנית, ניתן להשתמש ב-xenografts כדי לדגמן מחלות נדירות או מפוזרות אם דגימות החולה זמינות. שלישית, xenografts תלי מודל המחלה בתוך מערכת שלמה vivo. מסיבות אלה, אנו ההשערה כי הטיפול תוצאות יעילות במודלים מבע נוטים יותר לתרגם ניסויים בחולים. האדם xenografts תלי הגידול כבר מנוצל בהצלחה כדי לפתח טיפולים עבור סוגי סרטן נפוצים, כולל מיאלומה נפוצה, כמו גם טיפולים אישיים עבור חולים בודדים4,5,6, 7. לאחר מכן
לאחרונה, xenografts שימשו כדי לפתח מודל של מחלת שריר האדם8. במודל זה, דגימות של ביופסיה של האדם האנושי מושתלים לתוך הגפיים של העכברים NRG לקויה ליצור שתלי xenografts הזרע מיושתלים האדם למות, אבל תאי גזע השריר האנושי הנוכחים בשתל מבע אחר מכן להרחיב ולהבדיל לסיבים האנושי החדש אשר מאכלס את הבסיס האנושי מנופה של האדם. לכן, הסיבים הנוצרות מחדש ב-xenografts אלה הם אנושיים לחלוטין, הם באופן ספונטני revascularized על ידי מארח העכבר. חשוב מכך, ניוון שרירים fascioscapulohumeral (FSHD) רקמת שריר החולה המושתלים לתוך עכברים לכידה של תכונות מפתח של המחלה האנושית, כלומר ביטוי של הגורם שעתוק DUX4 8. Fshd נגרמת על ידי הבעות יתר של DUX4, אשר מושתק גנטית ברקמת שריר נורמלי9,10. במודל fshd מבע, טיפול עם DUX4 olino מסוים הוכח לדכא בהצלחה DUX4 ביטוי ותפקוד, והוא עשוי להיות אופציה טיפולית פוטנציאלית עבור חולים fshd11. תוצאות אלה מציגות כי שרירי האדם xenografts הם גישה חדשה למודל מחלת שרירים אנושית ולבדוק טיפולים פוטנציאליים עכברים. כאן, אנו מתארים בפירוט את השיטה כירורגית ליצירת שרירי השלד האנושי xenografts בעכברים חיסוני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל שימוש בדגימות מחקר של בני אדם אושרה על-ידי הוועד המוסדי של ג'ונס הופקינס מוסדיים (IRB) כדי להגן על זכויותיהם ורווחתם של המשתתפים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על-ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס בעלי חיים מוסדיים טיפול והוועדה השימוש (IACUC) בהתאם למכון הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. זכר נוד-Rag1nullIL2rγnull (NRG) עכברים מארחים (8-12 שבועות ישנים) משמשים לביצוע ניסויים מבע. עכברים אלה שוכנו בארונות מאוורר ומקבלים HEPA מסוננים, מחוסמת, ומחולל אוויר, כמו גם הפוכה אוסמוזה מסוננים מים היפרלורומיים. עכברים מסופקים מים ודיאטה לאנטיביוטיקה לקרינה (טבלה של חומרים) ad libitum, והמתקן מספק 14 h של אור 10 h של כהה כפי שנשלט על ידי טיימר מרכזי.
1. הכנת ציוד
- לרכוש את נוד-Rag1nullIL2r γnull (NRG) עכברים, 8-12 שבועות של גיל.
- ציוד כירורגי אוטוקלב: מספריים, מלקחיים, מחזיק מחטים, מהדק כירורגי (שולחן חומרים), מחסניות כירורגיות, מגבונים (לוח חומרים), וגביע (איור 1a).
- להכין 50 mL של מדיה שרירים (20% סרום העובר העובר, 2% העוברי היום לחלץ, 1% אנטיביוטי/antimycotic ב בשר חזיר F10 בינוני). שמור את כל הכימיקלים/תרופות/פתרונות המשמשים לניתוח בטמפרטורת החדר, אלא אם נכתב אחרת בפרוטוקול.
- להכין מזרק 1 mL עם מחט של 26 גרם כי הוא 3/8 אינצ'ים ארוך המכיל 2 מ"ג/mL משכך כאבים (טבלת חומרים), ומקום על קרח. משכך כאבים ניתן לדלל את הריכוז הנכון באמצעות מלוחים סטרילית מאגור פוספט (PBS).
2. הכנה כירורגית
- השג ביופסיה של שריר האדם תחת פרוטוקול IRB מאושר מחולים ששריריו להציג כוח > 4-/5 על MRC (מועצת המחקר הרפואי) סולם12. מניחים את הדגימה מחקר 100 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי המכילה מדיה שריר.
הערה: סולם MRC משמש בפרקטיקה קלינית כהערכה של חוזק השריר עם 0 מראה לא התכווצות, 5 מראה כוח רגיל, ו 4 (4-to 4 +) מראה תנועה נגד התנגדות12. מצאנו כי שרירים עם חולשה עד מתונה (mrc > 4-/5) בדרך כלל להראות פתולוגיה מחלה אך אינם מוחלפים באופן נרחב על ידי רקמת שומן או פיברוזיס, שניהם לעכב התחדשות מבע. במקרה של רקמת ניתוח שלאחר המוות שבו ציון MRC האחרונות אינו זמין, איכות השריר ניתן לגשת באמצעות התבוננות ברוטו. ביופסיות שרירים כי הם ורוד חיוור במראה או שטחים גדולים של רקמת שומן אינם צפויים מבע בהצלחה. - להסיר כל fascia או רקמת שומן הנותרים מן הדגימה עם מספריים כירורגית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ומקור אור כדי לסייע הדמיה.
- לנתח את ביופסיה השריר לתוך כ 7 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ חתיכות עם מספריים כירורגי באמצעות מיקרוסקופ סטריאו מקור אור. להבטיח סיבים מסודרים longitudinally בתוך הדגימה.
- מניחים את צלחת פטרי המכילה שריר גזור על הקרח. בממוצע, שתלי xenografts במדיה במשך 4 שעות בזמן הניתוחים מתבצעים. עם זאת, ביופסיות אוחסנו במדיה עבור 24 שעות לפני השתלת xenografting ועיכוב זה לא נראה לרעה השפעה השתלת או התחדשות.
- מניחים את התפרים הסינתטיים, הלא נספגים (טבלת חומרים) בצלחת פטרי ב100 מ"מ x 15 מ"מ המכילה 70% אתנול.
- הגדר מעגל כפול ההרדמה הרדמה: לסדר את המעגל נשימה של מייפל סון על מיקרוסקופ סטריאו ולמקם את התא אינדוקציה בקבינט אבטחה טיחות (איור 1a,ב).
- להשיג את המשקל של העכבר NRG על ידי הצבת בגביע אוטוקלע בקנה מידה, ולהעביר לחדר אינדוקציה. . לגרום להרדמה מתחת ל -3% לאחר השגת עומק ההרדמה המתאים-כפי שמוערך על ידי התבוננות בקצב הנשימה, הרפיה שרירים וחוסר תנועה מרצון-הפחת את הגדרת האידוי ל-1.5% לשארית הניתוח.
- העבר את העכבר מחדר אינדוקציה למעגל הנשימה של מייפל סון ולהחיל משחה אופטלמולוגית לעיניים.
- להסיר את השיער על הקדמי הטישורי (TA) מקרסול לברך עם קוצץ, ואחריו טיפול 1 דקות עם קרם הסרת שיער (טבלת חומרים) (איור 2a).
- לחטא את האתר כירורגי ידי לטהר את הרגל עם povidone-פתרון יוד. ואז לשטוף את povidone הנותרים-יוד עם 70% אתנול.
- הכנס את תת-עורי העכבר עם משכך כאבים, כגון carprofen, (טבלה של חומרים) במינון של 5 מ"ג/ק"ג.
3. כירורגיה של xenograft
- סרט במורד הרגל ולעשות חתך ישר על פני השריר הקדמי (TA) שריר עם מספריים ומלקחיים איריס שמקורם הגידים ומסתיימת מתחת לברך (איור 2B).
- להפריד עור משריר באמצעות. ניתוח קהה עם מספריים כירורגיים
- חותכים דרך השריר של שריר ת א עם מספריים החל גיד ומסתיימת בברך.
הערה: זהו חתך שטחי מאוד (פחות מ 0.5 מ"מ; איור 2B, קו מקווקו שחור), ו-TA הבסיסית לא צריך להינזק בתהליך כמו זה יגרום להסרת מאתגרת יותר. כאשר מבוצעת בצורה נכונה, סיבי השריר יהיה להירגע בעליל. - חותכים את הגיד המרוחק של ה-TA עם מספריים, לתפוס את הגיד עם מלקחיים קשתית, ולמשוך את ה-TA לכיוון הברך (איור 2C).
- חותכים את הגיד המרוחק של החירום הפושט (אדי) עם מספריים ומושכים את אדי לכיוון הברך (איור 2D). ברגע שהגיד העומד ביותר של השריר הארוך ביותר (PL) מוצג, הסר את אדי עם מספריים (איור 2D, קו מקווקו ירוק).
- הסר את ה-TA עם מספריים (איור 2D, קו מקווקו כחול) והשתמש במחיקה כירורגית עם PBS ולחץ קל כדי להשיג הומוסטזיס (איור 2d).
- הליך המשנה תפר דרך לאורך הקרוב שוקית (PL) גיד ו לקצץ, עוזב כ 1.5 סנטימטר של חוט משני צדי הגיד (איור 2f).
- בצעו את המחצית הראשונה של קשר מרובע דו-יד, אך לא להדק: זה יצור עיגול. מניחים השתלת מבע מעגל זה ולהדק את הלולאה כדי לאבטח את השתל מבע השלימו את החצי השני של הקשר הריבועי (איור 2G,H). זה יהיה לתפור את השתל מבע גיד האבובי של PL.
- חוט תפר דרך גיד הדו המרוחק ולחזור על טכניקת הקשר מרובע משלב 3.8 לקשור את מבע לגיד המרוחק (איור 2h,אני).
הערה: העורק האמצעי והווריד יכולים לשכב. קרוב או על גבי הגיד המרוחק של היחידה אין להציב תפרים בכלים אלה או מסביבם. קל לדעת אם תפר הוצב בצורה לא נכונה כמו כלי יהיה לחולץ או דימום. אם זה קורה, להסיר את התפר ומקום במיקום אחר. - משוך את העור מעל שריר xמושתל, חותם עם דבק כירורגי, ומניחים 2-3 כירורגי סיכות על החתך (איור 2J).
- מקום העכבר בכלוב נקי על משטח מחומם להתאושש. הצג את העכבר עד להכרה מלאה ומעת לעת במשך הימים הבאים עבור סימנים של זיהום מערכתי מקומי וכיצד להבטיח את האתר כירורגי לא נפתח מחדש.
הערה: מנה אחת של כאבים כמתואר בשלב 2.11 הוא בדרך כלל מספיק להקלה על הכאב. עם זאת, העכברים צריכים גם להיות מנוטרים על כאבים מתמידים (למשל, מעיל מעצבן, תנוחה מבוקרת), ואם יש צורך, לקבל מחדש עם משכך כאבים ב 24 הפוסט לאחר הניתוח.
4. אוסף xenograft
הערה: Xenografts נאספים בדרך כלל בין 4 עד 6 חודשים לאחר הניתוח. עם זאת, הקולקציות נערכו עד 12 חודשים לאחר הניתוח.
- מניחים בגביע מקורה המכיל 200 mL של 2-מתילבוטאן בקופסה המכילה קרח יבש למינימום של 30 דקות לפני אוסף מבע.
- לגרום להרדמה מתחת ל -3%. בחדר האינדוקציה לאחר עומק ההרדמה המתאים מושגת, להפחית את הצבת האידוי כדי 1.5% לשארית הניתוח.
- להעביר את העכבר מהחדר אינדוקציה למעגל נשימה מייפל סון מסודרים על מיקרוסקופ סטריאו.
- להסיר את השיער על הקדמי ה, מקרסול לברך עם קוצץ וקרם הסרת שיער. התפרים המחזיקים את מבע במקום ניתן לראות דרך העור (איור 3a).
- סרט במורד הרגל ולהשתמש במספריים מלקחיים איריס לפתוח את העור על השתל מבע שני תפרים גלויים (איור 3b). העור על גבי מבע ניתן להסיר כפי שמוצג כדי להפוך את ההסרה של השתל מבע.
- השתמש אזמל לחתוך בין השתל מבע השוקה (איור 3b, החץ מציין את האתר הראשוני ואת הכיוון של החתך). זה יהיה לשחרר צד אחד של השתל xenograft
- השתמש אזמל לחתוך בין השריר PL ואת השריר הגקטמיאוס (איור 3C, אניncision לאורך epimysium מתויג עם החץ). משחק PL יוסר עם השתל xenograft
- חותכים מתחת לתפר המרוחק דרך הגיד המרוחק של PL (איור 3D, לחתוך לאורך קו מנוקד).
- הסר את השתל מבע PL על ידי תופס את תפר עם מלקחיים קשתית וההסיט אותו לכיוון הברך תוך שימוש במספריים לחתוך אותו הרחק שריר הבסיס (איור 3e).
- לחתוך מעל תפר הקודם עם מספריים כדי להסיר את השתל מבע PL (איור 3f, לחתוך לאורך קו מנוקד ב 3f).
- הניחו את הדגימה על פיסת קרטון או פלסטיק קטנה, והצמד קרוב לתפרים ככל האפשר. בזמן הצמדת הדגימה, מתחו בעדינות את השריר כדי לוודא שכיוון הסיבים נשמר במהלך תהליך ההקפאה. לאחר סיכות מאובטח במקום, החלק את השריר למעלה את הפינים כך הוא נח ממש מעל קרטון.
הערה: לחילופין, קצה אחד של מבע יכול להיות רכוב tragacanth על פקק, או שזה יכול להיות מתחת לחלוטין בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) במתחם cryomold. עם הטיפול, השריר יכול להישמר בשתי השיטות. - הצמד להקפיא את השתל מבע מקורר טרום 2-מתילבוטאן.
- חנות מבע ב-80 ° c.
- מיד לאחר אוסף מבע, המתת חסד עכברים בהתאם הנחיות האגודה האמריקנית לרפואה וטרינרית:
- מניחים עכברים בתא אטום עם מערכת ניקוי גז מתאים. השתמשו באיזוofלאנה בריכוז של 3-4% כדי לגרום להרדמה.
- לאחר עומק ההרדמה המתאים מושגת-כפי שמוערך על ידי התבוננות בקצב הנשימה, הרפיה שרירים, וחוסר תנועה מרצון-להגדיל את הצבת האידוי ל 5% כדי לגרום למוות. השאירו את העכברים בחדר למשך 2 דקות נוספות אחרי שהנשמה חדלה. המוות מאומת על ידי התבוננות כי העכברים להיכשל להתאושש בתוך 10 דקות לאחר מנת יתר של isofלאנה.
- לבסוף, לבצע פריקה צוואר הרחם על העכברים.
הערה: במקרה של עכברים בקיעים xenografted, השתלת xenografted, הצלעות ניתן לשמור עבור אוסף מאוחר יותר. כדי לבצע איסוף הישרדות, לפתוח את העור על גבי מבע עם חיתוך ישר אחד עם מספריים כירורגית, ולהסיר את מבע כפי שמתואר בשלבים 4.6 כדי 4.10. לאחר מכן לסגור את העור מעל תא החיות הריק באמצעות דבק וסיכות כירורגי. לטפל בעכבר עם כאבים כמתואר בשלב 2.11 ומניחים את העכבר בכלוב נקי על משטח מחומם להתאושש. עקוב אחר העכבר עד להכרה מלאה ומעת לעת במשך הימים הבאים עבור סימנים של זיהום מערכתי מקומי, כדי להבטיח את האתר כירורגי לא נפתח מחדש.
5. xenograft אימונוהיסטוכימיה
- השתמש בקריוסטט כדי לחתוך 10 עד 12 מקטעים יקרומטר מהשתל מבע נאסף אל שקופיות שחויבו באופן חיובי (טבלת חומרים).
- מילוי צנצנת עם המתנול והקדם מגניב ב-20 ° c עבור 30 דקות.
- מניחים שקופיות קרח קר מתנול עבור 10 דקות כדי לתקן ולחלחל את הסעיפים מבע.
- מניחים שקופיות בצנצנת מכתים ומכבסת 3x עם תמיסת מלח באגירה (PBS) עבור 5 דקות.
- בלוק עם אנטי עכבר IgG (לוח חומרים) עבור 2 h ב 4 ° c.
- אבן חשופה עם נוגדנים ראשוניים, כגון ספקטרומטר, lamin A/C, ו רירן עובריים (טבלה של חומרים) ב-PBS שיושלם עם 2% סרום עז לילה ב 4 ° c.
- מניחים שקופיות צנצנת מכתים ולשטוף 3x עם תמיסת מלח מאגור פוספט (PBS) עבור 5 דקות.
- אבן החשופה בנוגדנים משנית בצבע פלורסנט (טבלת חומרים) ב-PBS בתוספת 2% סרום עז עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- מניחים שקופיות בצנצנת מכתים ומכבסת 3x עם תמיסת מלח באגירה (PBS) עבור 5 דקות.
- מקום הרכבה בינונית (טבלה של חומרים) על מקטעים xenografts, המקום שמיכות על גבי, ולהשתמש לק ציפורניים כדי לאטום את הcoverslip.
איור 2: כירורגיה של קסאנושתל. (א) השיער מוסר מהאתר הכירורגי. (ב) החתך נעשה על פני העבר החדש (TA). הגידים האדירים של ה-TA והחירום הדיגיטלי (אדי) מסומנים בחיצים. הקו המקווקו השחור מציין היכן ייקצץ האפוליסיום בשלב 3.3. (ג) הגיד המרוחק של ה-TA נחתך והשריר נמשך עד הברך. (ד) גיד האדי נחתך והוא נמשך עד הברך. זה חושף את הגיד הטוב ביותר של הפראוס הארוך (PL) מסומן בחץ. קווים מקווקווים מציינים היכן לגזור עם מספריים כדי להסיר את אדי (ירוק) ו-PL (כחול). (ה) אדי ו-TA יוסרו. (ו) תפר ממוקם דרך הגיד האבובית של PL. (G) השתל מבע מוקם בתוך תא השוקה הריק ושולח את גיד PL האבובית באמצעות הקשר שתי יד כירורגית מרובע. (ח) תפר מוצב דרך הגיד המרוחק של PL, מסומן בחץ, ועוד קשר שני יד מרובע כירורגי משמש לתפר את השתל מבע הגיד המרוחק. (I) השתלת מבע ושתלים באופן מלא ומסושמים אל PL. (J) העור סגור עם דבק כירורגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3:4 שבאוסף החודש. (א) השיער מוסר מהאתר הכירורגי. התפרים נראים מתחת לעור. (ב) העור על גבי השתל מבע וסר. ואז השתל מבע עם מלקחיים קשתית בתפר המרוחק ומשך בעדינות כלפי מעלה. מתחיל בקרסול, אזמל משמש כדי לחתוך לאורך השוקה ולשחרר את השתל xenograft החץ מראה את תחילתו של החתך לאורך השוקה. (ג) על ידי משיכת השריר הגקטמימיוס לצד, קו לבן חלוש של אפאיסיום המפריד בין השריר הארוך (PL) והגמקמיוס (המוצג על ידי החץ) הופך לגלוי. השתמש אזמל לחתוך לאורך הקו הזה כדי להפריד את PL משרירי הרגל האחרים. (ד) הצד הימני של השתל xenograft ו PL הם כעת חופשיים מן השרירים האחרים ברגל והם מוכנים להסרה. הקו המקווקו מציין היכן לגזור עם מספריים כירורגיים כדי להתחיל להסיר את השתל מבע-PL. (E) לאחר חיתוך מתחת לתפר המרוחק, להסיט את השתל מבע עבר הברך. קו מקווקו מציין היכן לחתוך עם מספריים כירורגיים כדי להסיר את השתל מבע-PL מהתא טיביאליס. (ו) תא השוקה הריק עם השתל מבע-PL הוסר בהצלחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כפי שמתואר על ידי יואן-פאן ג'אנג ואח ', פרוטוקול זה כירורגי הוא שיטה ישירה לייצר שרירי השלד האנושי xenografts תלי8. שתלי xenografts חדש הופכים לinnervated באופן ספונטני ומציגים כיצד פונקציונלי. בנוסף, שריר xenografted ושתל מהחולים FSHD לאחר שינויים בביטוי גנים נצפתה בחולים FSHD8.
בניסיון שלנו, כ 7 מתוך 8 שתלי xenografts יצע מן המטופלים בשליטה דגימות יראה השריר מוצלחת התיאום. השתלת מבע וצלחת מראה התחדשות איתנה של סיבים אנושיים כמזוהה עם נוגדנים ספ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המטופל נגזר שתלי xenografts דרך חדשנית למודל מחלת שרירים ולבצע מחקרים טרום קליניים. השיטה המתוארת כאן כדי ליצור שתלי השלד xenografts מהירה, ישירה, ו להיות מנויית. ניתוחים חד צדדיים ניתן לבצע בתוך 15 עד 25 דקות, או בקיעים בתוך 30 עד 40 דקות. שתלי הדו הדו-צדדיים יכולים לספק גמישות ניסויית נוספת. למשל, החוקרים יכולים לבצע טיפול מקומי של השתלת xenograft, עם השני שמאל כפקד. העכברים NRG עמידים בפני זיהום באתר כירורגי כאשר הוא שוכן במתקן נטול הפתוגן; בניסיון שלנו ביצוע יותר מ-200 xenografts, מעולם לא היה לנו עכבר לרכוש דלקת כיר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי עמותת מיאוסיטיס וקרן פיטר באק. ברצוני להודות לד ר יואן-פן ג'אנג על שיתוף המומחיות וההכשרה שלה בטכניקת הכירורגיה הכירורגית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ | פישר סיינטיפיק | FB0875712 | |
| 2-מתילבוטן | פישר | O3551-4 | |
| 20 מ"מ x 30 מ"מ מיקרו כיסוי זכוכית | VWR | 48393-151 | |
| משקל שקילה לבעלי חיים | קנט סיינטיפיק | SCL- 1015 | |
| תמיסת אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית | , Cellgro | 30-004-CI | |
| מערכת AutoClip | FST | 12020-00 | |
| מחזיק מחט Castroviejo | FST | 12565-14 | |
| תמצית עובר אפרוח | מדויק | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| צנצנת צביעה קופלין | Thermo Scientific | 19-4 | |
| סיכות דיסקציה | פישר סיינטיפיק | S13976 | |
| קרח יבש - גלולה | פישר סיינטיפיק | NC9584462 | |
| נוגדן מיוזין עוברי | DSHB | F1.652 | ריכוז מומלץ 1:10 |
| אתנול | פישר סיינטיפיק | 459836 | |
| סרום בקר עוברי | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | דולן-ג'נר | Mi-150 | |
| מלקחיים | FST | 11295-20 | |
| עיזים נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | ריכוז מומלץ 1:500 |
| עיזים נגד עכבר IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | ריכוז מומלץ 1:500 |
| גומי tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 | קורנינג | 10-070-CV | |
| היסטואקריל כחול אטם רקמות דבק מקומי לעור | TS1050044FP | ||
| נוגדן למין למין ספציפי אנושי | Abcam | ab40567 | ריכוז מומלץ 1:50-1:100 |
| נוגדן ספקטרין ספציפי לאדם | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | ריכוז מומלץ 1:20-1:100 |
| תא אינדוקציה | VetEquip | 941444 | |
| איריס מלקחיים | FST | 11066-07 | |
| מוקרן גלובלי 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | דיאטת מכרסמים אנטיביוטית להגנה שוב על זיהומים בדרכי הנשימה |
| Isoflurane | MWI אספקה וטרינרית | 502017 | |
| Kimwipes Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | מגבונים כירורגיים |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| מתנול | פישר מדעי | A412 | |
| מכונת הרדמה ניידת | VetEquip 901805 | ||
| עכבר על עכבר ערכה בסיסית | מעבדות וקטור | BMK-2202 | עכבר IgG חוסם מגיב |
| לק | אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences | 72180 | |
| NAIR מסיר שיער קרם / שמן | פישר סיינטיפיק | NC0132811 | |
| עכברי NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) | מעבדת ג'קסון | 007799 | |
| תרכובת O.C.T. בת | 23-730-571 | ||
| חמצן | איירגז OX | USPEA | |
| PBS (פוספט חוצץ מלח) מאגר | פישר סיינטיפיק | 4870500 | |
| פובידון יוד פתרון הכנה | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ זהב אנטיפייד מאונטנט | פישר סיינטיפיק | P10144 (ללא DAPI); P36935 (עם DAPI) | |
| משחת עיניים Puralube | Dechra | 17033-211-38 | |
| רימדיל (קרפרופן) הזרקה | פטרסון וטרינרי | 10000319 | משכך כאבים כירורגי, ניתן תת עורי במינון של 5 מ"ג/ק"ג |
| להבי אזמל - #11 | FST | 10011-00 | |
| ידית אזמל - #3 | FST | 10003-12 | |
| סטריאו מיקרוסקופ | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק | 12-550-15 | |
| תפר, סינטטי, לא נספג, אורך 30 אינץ', מחט CV-11 | Covidien | VP-706-X | |
| מזרק 1 מ"ל (26 מד, מחט 3/8 אינץ') | BD Biosciences | 329412 | |
| גוזם | קנט סיינטיפיק | CL9990-KIT | |
| Vannas מספריים קפיציים, 8.0 מ"מ קצה חיתוך | FST | 15009-08 | |
| VaporGaurd מסנן פחם פעיל | VetEquip | 931401 | |
| תפסי פצע, 9 מ"מ | FST | 12022-09 |
מקורות
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 0, 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
