מאמר שיטה

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

DOI:

10.3791/59988

⸱

20 בדצמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טאו הוא חלבון קשירה מיקרוטודורית המתבטאת הנוירונים הפונקציה הידועה העיקרית שלה קשורה לתחזוקה של יציבות ציטושלד. עם זאת, הראיות האחרונות הראו כי טאו נמצא גם בתאי subcellular אחרים כולל הגרעין שבו הוא מעורב הגנת ה-DNA, בתמלול rRNA, בניידות של retrotransposons ובארגון המבני של גרעינון. לאחרונה הוכיחו כי טאו גרעיני מעורב בביטוי של הגן VGluT1, מציע מנגנון מולקולרי שיכול להסביר את הגידול הפתולוגי של שחרור גלוטמט בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר. עד לאחרונה, מעורבות של הטאו הגרעיני ב מודולים את הביטוי של גנים היעד היה בטוח יחסית מעורפל בשל מגבלות טכניות שמנע את הדרה של תרומת cytoplasmic טאו או את ההשפעה של אחרים גורמים במורד הזרם. לא קשורים לטאו גרעיני כדי להתגבר על חוסר ודאות זה, פיתחנו שיטה ללמוד את הביטוי של גנים היעד במיוחד מאופנן על ידי חלבון הטאו הגרעיני. העסקנו בפרוטוקול שזוגות את השימוש באותות הלוקליזציה ובשבר הסלולר, דבר המאפשר להתיר את ההפרעה ממולקולות הטאו של הציטוטופלמיק. בעיקר, הפרוטוקול הוא קל והוא מורכב משיטות קלאסיות ואמינות החלות באופן כללי על מנת ללמוד את התפקוד הגרעיני של הטאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים סלולריים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפונקציות של החלבון טאו בגרעין צברה עניין משמעותי בשנים האחרונות, כפי שהוא הוכח להיות קשור הדוק עם חומצות גרעין1,2,3,4,5,6. אכן, הגנום לאחרונה מחקר רחב הראה כי טאו נקשר רצפי DNA הגניים הבין vivo7. תפקיד בארגון נוקלאוולאר הוצע8,9,10,11. יתר על כן, טאו הציע להיות מעורב הגנת דנ א מ חמצוני היפרתרמיה5,10,12,13, ואילו מוטציה טאו היה קשור לחוסר יציבות כרומוזום ו מאנולודיה14,15,16.

עד היום, האתגרים בלימוד התפקודים של הטאו בתוך התא הגרעיני נותרו כמעט בלתי פתורים בשל הקשיים בניתוח התרומה הספציפית של הטאו הגרעיני מתרומתה של cytoplasmic טאו. יתרה מזאת, הפונקציות המיוחסות למולקולות של הטאו בתוך התא הגרעיני, עד כה, הן רק משום שהן חסרות הדגמה חד משמעית של המעורבות הישירה של החלבונים הגרעיניים של הטאו. ואכן, מעורבות של הטאו בניידות של הרטרוטרנספסונים או בתמלול או ב-DNA הגנה11,12,17,18,19 יכול להיות גם הסביר על ידי תרומת cytoplasmic טאו או על ידי השפעה של גורמים אחרים במורד הזרם לא קשור לטאו גרעיני.

כאן, אנו מספקים שיטה שיכולה לפתור בעיה זו על ידי ניצול הליך קלאסי כדי לבודד את התא הגרעיני בשילוב עם השימוש של בונה הטאו 0N4R מתויג עם לוקליזציה גרעינית (NLS) או אותות היצוא הגרעיני (NES). גישה זו מבטלת את הסוגיות המורכבות הקשורות לחפצי האמנות האפשריים בשל הגלישה של מולקולות טאו מהתא cytoplasmic. יתר על כן, המבנים של טאו-NLS וטאו-נס מעניקים להעשרה או להדרה של מולקולות של הטאו מהתא הגרעיני, בהתאמה, מתן שליטה חיובית ושלילית למעורבות של מולקולות באוניברסיטת טאו גרעינית בפונקציה מסוימת. הפרוטוקול הוא מבחינה טכנית קל והוא מורכב שיטות קלאסיות ואמינות, כי הם החלים באופן כללי כדי ללמוד את הפונקציה הגרעינית של הטאו בסוגי תאים אחרים, הבדיל או לא, כמו תאים סרטניים להפעיל מחדש את הביטוי טאו20,21. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים הנמצאים הן הציטופלסמה ואת הגרעין על מנת לנתח פונקציות ביולוגיות הקשורות לתאים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

  1. תרבות SH-SY5Y תאים (קו תאים נוירובלסטומה האדם, CRL-2266) בינונית לחלוטין (מדיום הנשר שונה של בינונית: תערובת מזינים F12 [DMEM/F-12] בתוספת עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין 100 μg/mL סטרפטומיצין). לשמור על התאים בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לגדול תאים ב 10 ס מ לוחות ולפצל כאשר מתוך שוטפת.

2. בידול תא

  1. כדי להבדיל התאים SH-SY5Y, יום לאחר ציפוי, להוסיף 10 μM חומצה retinoic (RA) כדי להשלים בינונית עבור 5 ימים.
  2. היום השישי להחליף בינוני עם בידול בינוני: Dמאמ/F-12 בתוספת עם 50 ng/mL BDNF, 2 מ"מ L-גלוטמין. אין להוסיף FBS או אנטיביוטיקה.
  3. לגדול את התאים בידול בינוני במשך 3 ימים.

3. כימאריק בונה שיבוט

  1. צור טאו-nls לבנות על ידי שיבוט על ידי הגבלת העיכול האנזים במסגרת על 3 ' סוף הסדרה של טאו 0n4r (383aa) the 3xnls (SV40NLS): 5 '-ccaאאאגאגאאכאאגאגאכאאאגאג'אאכאאגאגאמאגאכאאאגאכאאגראagcac
    הערה: 3xNLS ב 3 ' בסוף הטאו מוכפל לתוך הפלמביותר של pCMV-טאו עבור ביטוי היונקים לנצל את האתרים הגבלת Xהוי ו BamHI לתוך האתר הרב (MCS).
  2. צור טאו-NES לבנות על ידי שיבוט על ידי הגבלה העיכול האנזים במסגרת בסוף 3 ' הרצף של טאו הסדרה 0N4R (383aa) רצף נס: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA -3 '.
    הערה: ה-NES בקצה השלישי של הטאו מוכפל לתוך הפלמאג של pCMV-טאו עבור ביטוי היונקים הניצול של אתרי ההגבלה EcoRI ו-BamHI לתוך ה-MCS.
  3. שינוי צורה DH5alpha E. coli זן עם 100 NG של ה-DNA משלב 3.1 או 3.2 ותאי צלחת בצלחות LB-אגר עם 100 Mg/mL אמפיצילין. בואו לצמוח לילה ב 37 ° c.
  4. בחר מושבה אחת ספייק את התאים לתוך 5 מ ל של LB עם אמפיצילין. תנו לתאים לצמוח ב-37 ° c בעצבנות בלילה.
  5. לחלץ פלמיד עם miniprep DNA (טבלת חומרים) ורצף כדי לאמת את המבנים.
  6. המרה DH5alpha E. coli זן עם המבנה רצף מאומת ותאי צלחת על צלחות LB-אגר עם אמפיצילין. בואו לצמוח לילה ב 37 ° c.
  7. בחר מושבה אחת ספייק את התאים לתוך 5 מ ל של LB עם אמפיצילין. תנו לתאים לצמוח ב-37 ° c בעצבנות במשך 2 שעות.
  8. לשים את התאים משלב 3.7 ב 200 mL של LB עם אמפיצילין. בואו לצמוח לילה ב 37 ° c.
  9. כדור התאים בשעה 3,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
  10. לחלץ פלמיד עם מרבי DNA (טבלת חומרים).

4. מעבר תאים

  1. זרע 400,000 תאים משלב 1.1 ב 6-היטב צלחות או 20,000 תאים ב 8-היטב שקופיות קאמרית. צלחת ארבע דגימות: שליטה בתאי להיות מזוהמים עם וקטור ריק, תאים להיות מזוהמים עם טאו לא מתויג, תאים להיות מזוהמים עם טאו-NLS ותאים להיות מזוהמים בטאו-נס.
  2. היום לאחר זריעת transfect 400 ng של ה-DNA עבור כל טוב באמצעות ליפידים הרים (שולחן חומרים) ב 6-היטב צלחות או 200 NG של DNA עבור כל טוב עבור שקופיות קאמרית 8-טוב, על פי הוראות היצרן.
    1. דגירה של ה-DNA ואת ליפידים בנפרד ב 250 μL (לוחות 6-טוב) או 25 μL (עבור 8-באר שקופיות החדר) של בינונית סרום מופחת עבור 5 דקות ב RT. ואז לשלב אותם כדי ליצור את הקומפלקס DNA-ליפיד ו דגירה עבור 20 דקות.
    2. החלף את מדיום התרבות עם 2 מ ל (לוחות 6-היטב) או 250 μL (עבור שקופיות קאמרית של 8 שפות) של בינוני תרבותי טרי מלא. הוסף את מתחם ה-DNA-ליפיד לתאים ו-דגירה ב 37 ° c בלילה.
  3. לחילופין, העברה של דנ א עם הפוליאתילן המדריתית הכימית.
    1. מערבבים 2 μg של ה-DNA ו 6 μL של פיי עם 200 μL של מדיום תרבות מלאה (עבור כל טוב ב 6-טוב צלחות), או 1 μg של ה-DNA ו 3 μL של פיי עם 100 μL של מדיום תרבות מלאה (עבור כל טוב ב 8-היטב שקופיות קאמרית) , מערבולת ו דגירה עבור 10 דקות ב RT.
    2. להוסיף את התמהיל לתאים ולהוסיף 1.8 mL של מדיום התרבות המלאה בכל טוב ב 6-היטב צלחות או 150 μL של מדיום התרבות המלאה לכל טוב ב 8-היטב שקופיות קאמרית כדי להגיע נפח הציפוי.
  4. שנה את המדיום יום לאחר השינוי והוסף את מדיית הבידול כמתואר בשלב 2.2.

5. אימונולואורנציה

  1. הסר את בינונית התרבות ולשטוף תאים עם 1x PBS. תקן תאים עם 100% קרח קר מתנול עבור 3 דקות בלי לרעוד. הסר את פתרון התיקון ושטוף בקצרה עם ה-PBS 1.
  2. החדירות עם 0.1% שאינם יוניים ב-1x PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בקצרה, לשטוף עם 1 x PBS, 3 פעמים.
  3. דגירה תאים עם מאגר חוסם (0.1% רצף 20 ו 1% BSA ב PBS) עבור 30 דקות ב-RT על שייקר מסלולית.
  4. דגירה עם נוגדנים העיקרי המתאים (למשל, העכבר מונושבטיים anti-Tau13 נוגדן) מדולל 1:500 במאגר חסימת לילה ב 4 ° c על שייקר מסלולית. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף, בקצרה, עם 1x PBS.
  5. מודלת עם נוגדנים משני מצולים פלואורואופלפור (g., העזים נגד העכבר נוגדנים מצוחלים לאלקסה Fluor 633) מדולל 1:500 במאגר חסימת עבור 1 h ב RT. להסיר את פתרון הנוגדן ולשטוף בקצרה עם PBS 1x 3 פעמים.
  6. כדי להכתים את הגרעין, הדגירה עם DAPI מדולל 1:20000 במאגר חסימת עבור 10 דקות ב RT. לשטוף עם PBS 1x 3 פעמים. שמיכות הר על שקופית באמצעות מדיום הרכבה antifade.

6. כתם מערבי

  1. כדי לאסוף את הגלולה תא משלב 4.4, להסיר את המדיום, ולשטוף תאים עם PBS. דגירה עם 500 μL של 0.1% טריפסין עבור 4 דקות ב-37 ° c. הוסף כמות שווה של תאים בינוניים ומחדש.
  2. לאסוף תאים בצינור ובצנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות. בסוף צנטריפוגה הסירו בזהירות את הסופרנטאנט. הוסף 1 mL של PBS, צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ובזהירות להסיר את supernatant. מאחסנים כדורי תא בקרח לשימוש מיידי או בהקפאה ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך.
  3. עבור תמציות חלבון מוחלט, מודיית את הגלולה התא עבור 30 דקות על הקרח במאגר הליזה (20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 20 מ"מ הנינג, 10% גליצרול, 1% octylphenoxy פולי (ethyleneoxy) אתנול, מסועף (לוח חומרים), 10 מ"מ edta) שיושלם עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי. על פי השפע של הגלולה, להשתמש 50 μL ל 100 μL של מאגר הליזה.
    1. צנטריפוגה את התמצית ב 16,000 x g עבור 15 דקות. לאסוף את הסופרנטאנט ולכמת את ריכוז החלבון על ידי כל שיטת קוונפיקציה סטנדרטית. להכין את דגימות חלבון עבור SDS-עמוד על ידי ערבוב 20 μg של חלבונים עם 5 μL של מאגר 4x Laemmli בנפח הכולל של 20 μL ו לרתוח ב 100 ° c עבור 5 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן את המדגם ב-20 ° c.
  4. עבור הפסקות בסלולר, השהה מחדש את התאים משלב 6.2 בינוני מלא, ואסוף 1x 10 תאים לכל מדגם. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות כדי להשיג כדורי תא עבור השלבים הבאים.
    1. כדי לבודד תאים תת תאיים, אנגיופלסטיקה לפי מפרטי הערכה. כדי לבודד כל שבר, מודלת את הגלולה תא משלב 6.4 עם המאגר המתאים, צנטריפוגה, לאסוף את supernatant ולהוסיף את המאגר הבא לתוך הגלולה כפי שמתואר 6.4.1.1-6.4.1.5. להוסיף בסדר מאגר החילוץ cytoplasmic, מאגר החילוץ ממברנה, מאגר החילוץ הגרעיני, מאגר החילוץ הגרעיני שיושלם עם 5 מ"מ CaCl2 ו-3 U/μl מיקרוהחכירה ומאגר מיצוי השלד ציטומי.
      הערה: כל המאגרים חייבים להיות מצורפים עם מעכבי פרוטאז. קנה מידה של אמצעי אחסון של מאגר בהתאם לנפח של הגלולה הסלולרית.
      1. כדי לבודד את השבר cytosolic, כדורי תא כדוריות ב 100 μL של מאגר החילוץ הקרח קר cytoplasmic בתוספת מעכבי פרוטאז ב 4 ° צ' עם ערבוב עדין עבור 10 דקות. צנטריפוגה ב 500 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות ולהעביר את supernatant צינורות טרום מקורר.
      2. הוסף 100 μL של מאגר החילוץ ממברנה קרח קר בתוספת מעכבי פרוטאז לגלולה משלב 6.4.1.1, ו דגירה ב 4 ° צ' עם ערבוב עדין עבור 10 דקות. צנטריפוגה ב 3,000 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant.
      3. עבור שבר גרעיני מסיס, להוסיף 50 μL של מאגר החילוץ הגרעיני בתוספת מעכבי פרוטאז אל הגלולה משלב 6.4.1.2, ומערבולת. מודלת ב 4 ° c עבור 30 דקות, צנטריפוגה ב 5,000 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולאסוף את סופרנטאנט.
      4. עבור שבר גרעיני מסיס, להוסיף 50 μl של מאגר החילוץ הגרעיני שיושלם עם מעכבי פרוטאז, cacl2 ו-micrococcal נוקלאז אל הגלולה משלב 6.4.1.3, מערבולת. דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות, ולאחר מכן מערבולת שוב. צנטריפוגה ב 16,000 x g ב RT עבור 5 דקות ולאסוף את סופרנטאנט.
      5. עבור שבר ציטושלד, להוסיף 50 μL של מאגר החילוץ ציטושלד בתוספת עם מעכבי פרוטאז אל הגלולה משלב 6.4.1.4, ומערבולת. דגירה 10 דקות ב RT. צנטריפוגה את הצינור ב 16,000 x g עבור 5 דקות, לאסוף את supernatant ולמחוק את הגלולה.
        הערה: קנה מידה של אמצעי אחסון של מאגר בהתאם לאמצעי האחסון של התא, כפי שמצוין בפרוטוקול הערכה. עיין בפרוטוקול הערכה לקבלת פרטים נוספים על הדגירה והצנטריפוגה הזמן והטמפרטורה22,23,24,25,26,27,28,29. לחילופין, להשתמש בכל השיטות הסטנדרטיות30 כי, באמצעות דטרגנטים ועל ידי הגדלת כוח יונית ומהירות צנטריפוגה, מפריד את ציטוסולג, הממברנה מאוגד, השלד הציטוזה ואת השברים הגרעיניים. באמצעות ניצול מאגרי. החילוץ הגרעיניים הסטנדרטיים ניתן לאחסן את המדגם ב-20 ° c.
    2. עבור SDS-עמוד, להוסיף 7 μL של מאגר 4x Laemmli כדי 20 μL של שברים subcellular שהתקבלו משלבים 6.4.1.1-6.4.1.5, לרתוח ב 100 ° c עבור 5 דקות.
  5. לטעון דגימות על ג'ל אקרילמיד ולבצע אלקטרופורזה במתח קבוע של 120 V. העברת חלבונים כדי ניטרוגליצרין קרום תאית ב 250 mA עבור 90 דקות.
  6. בדוק אלקטרופורזה בחלבון ג'ל החלבונים ומצליחים לחסום על ידי דגירה של הקרום עבור 5 דקות בפתרון הכתמים של פוננסו. שטפו את הקרום במים מזוקקים עד שהרקע נקי. הסר את הכתם על ידי שטיפת המשך עם מלוחים טריס באגירה עם הרצף 20 (TBST) עבור 10 דקות על שייקר.
  7. דגירה הקרום עם פתרון חסימה (5% חלב ב TBST) עבור 1 h ב RT על שייקר. רוחצים 3 פעמים עם TBST עבור 5 דקות.
  8. Hybridize הקרום עם הנוגדן העיקרי בפתרון חסימה (1% חלב ב TBST) לילה ב 4 ° c. רוחצים 3 פעמים עם TBST עבור 5 דקות.
  9. Hybridize את הקרום עם הנוגדן HRP מצומשני בפתרון חסימה עבור 1 h ב RT. לשטוף 3 פעמים עם TBST עבור 5 דקות.
  10. לזהות את להקת החלבון באמצעות כימויומינסנס. לכמת את העוצמה של להקות כתמי מערביות על ידי ImageJ. לנרמל את הביטוי חלבון על המוצר של גן משק בית: היסטון H2B עבור השבר הגרעיני מסיסים ובלתי מסיס, שולי עבור שבר cytoplasmic עבור תמציות כולל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האסטרטגיה המשמשת לנתח את ההשפעה של טאו גרעיני ביטוי גנים הימנעות מתרומת חלבונים cytoplasmic טאו מתוארת באיור 1. בקצרה, החלבונים של טאו שתויגו עם NLS או NES נצברים או אינם נכללים בתא הגרעיני, בהתאמה. ההשפעה הפונקציונלית של חוסר איזון זה הוא שינוי של ביטוי הגנים שנמדד כתוצר של הגן VGluT1.

בעקבות תיאור הפרוטוקול, SH-SY5Y תאים טופלו RA עבור 5 ימים ולאחר מכן עם BDNF עבור 3 ימים כדי להשיג לאחר הmitotic תא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה למדוד את ההשפעה של חלבון הטאו גרעיני על ביטוי גנים. עם הפרוטוקול הזה התרומה. של cytoplasmic טאו מוגבלת מאוד צעדים קריטיים של פרוטוקול זה הם הבאים: הבידול של האדם נוירובלסטומה SY5Y תאים, את השבר הסלולר ואת הלוקליזציה של חלבון הטאו בתא הגרעיני.

ראשון, כפי שמוצג בסעיף תוצאות נציג, הבידול של SH-SY5Y תאים על ידי הוספת RA ו BDNF הוא חיוני כדי לקבל הכנה טובה של תאים כמו תא העצב בתרבות. צפיפות התאים הנזרע חשובה במיוחד מאחר שצפיפות נמוכה יותר עלולה להשפיע על תפוצת תאים. יתר על כן, עבור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Scuola Normale הסופרור (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 633 עז אנטי עכבר IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
אנטי אקטין נוגדןBETHYL LABORATORIEA300-485Aאנטי ארנב WB 1:10,000
אנטי GAPDH נוגדןפיצג'רלד תעשיות בינלאומי10R-G109aאנטי עכבר WB 1:10,000
אנטי H2B נוגדןAbcamab1790אנטי ארנב WB 1:15,000
אנטי Tau-13 נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-21796נגד עכבר WB 1:1,000; IF 1:500
אנטי טובולין אלפא נוגדןתרמו פישר מדעיPA5-16891אנטי עכבר WB 1:5,000
אנטי VGluT1 נוגדןסיגמא-אולדריץ'AMAb91041אנטי עכבר WB 1:500
BCA ערכת בדיקת חלבוןEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
חוסם בדרגת ספיגהBiorad1706404חלב יבש ללא שומן
BOVIN SERUM ALBUMINSIGMA-ALDRICHA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001מעכב פרוטאז
Criterion TGX 4-20% ללא כתמים, 10 בארותBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
הנשר השונה של Dulbeccoשל Medium Low GlucoseEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100 מ"לpH = 8, 0.5 M
סרום בקר עובריEurocloneEC50182L
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516-500 מ"ל
עיזים נגד עכבר IgG-HPRסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-2005WB 1:1,000
עז נגד ארנב IgG-HPRסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-2004WB 1:1,000
IGEPAL CA-630סיגמא-אולדריץ'I8896-50 מ"לאוקטילפנוקסי פולי (אתילנוקסי) אתנול
אימובילון מערביMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber שקופית 8 באר זכוכית שקופיותnunc177402
L-גלוטמיןEurocloneECB3000D100X
Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציהThermo Fisher Scientific12566014ליפיד קטיוני
מתנולSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM סרום מופחת בינוניGibco31985070
PEISigma-Aldrich40,872-7
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו פישר15140122מדעי 10,000 U/mL, 100 מ"ל
פוספט חוצץ מלח (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001מעכב פוספטאז
QIAGEN פלסמיד Maxi KitQiagen12163שלב 3.10
חומצה רטינואיתSigma-AldrichR2625-100mg
ערכת פיצול חלבון תת-תאי לתאים מתורבתיםThermo Fisher Scientific78840
קרום ניטרוצלולוזה נתמךBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833,920
TCS SP2 מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזרLeicaN / A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500 מ"לחומר פעילי שטח לא יוני
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific154000540.50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD antifade הרכבה בינוניתVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps מערכותטיהור DNAפרומגהA1330שלב 3.5

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577(2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western BlotTau NLS Tau NESSH SY5Y

מאמרים קשורים