מאמר שיטה

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

DOI:

10.3791/59992

⸱

4 באוקטובר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California Davis

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים קל להשתמש בפרוטוקולים להפקת וטיהור diterpenoid מטבוליטים דרך הביטוי קומבינטורית של אנזימים ביולוגיים ב Es chia coli או טבק benthamiana, ואחריו מוצר כרומאטוגרפי טיהור. מטבוליטים המתקבלים מתאימים למחקרים שונים כולל אפיון מבנה מולקולרי, מחקרים פונקציונלים וביואקטיביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diterpenoids ליצור מחלקה מגוונת של מולקולות קטנות הטבעית מוצרים המופצים באופן נרחב על פני ממלכות החיים יש פונקציות ביולוגיות קריטיות בתהליכים התפתחותיים, אינטראקציות בין-אורגאיתיות, והסתגלות סביבתית. בשל פעילויות ביולוגיות שונות אלה, הרבה דיטרפננואידים הינם גם בעלי חשיבות כלכלית כתרופות, תוספי מזון, דלק ביולוגי וביורוצינורות אחרים. גנומיקה מתקדמים וגישות ביוכימיים אפשרו עלייה מהירה בידע של diterpenoid-גנים מטבולית, אנזימים, ומסלולים. עם זאת, המורכבות המבנית של diterpenoids והתפלגות מטקמית צרה של תרכובות בודדות בדרך כלל רק מינים בודדים להישאר מגביל גורמים לייצור יעיל שלהם. הזמינות של מגוון רחב יותר של אנזימים מטבוליים מספקים כעת משאבים להפקת diterpenoids ב-מגדל מספיקות וטוהר כדי להקל על חקירה עמוקה יותר של קבוצת מטבוליזם חשוב זה. ציור על כלים שנקבעו עבור חיידקים ומבוסס על הצמח האנזים שיתוף ביטוי, אנו מציגים פרוטוקול מופעל בקלות להתאמה אישית עבור ייצור אנזימטי של diterpenoids ב es, coli או טבק benthamiana, ו טיהור של המוצרים הרצויים באמצעות כרומטוגרפיה סיליקה ובדיקות למחצה. באמצעות הקבוצה של תירס (Zea מייז) dolabralexin diterpenoids כדוגמה, אנו להדגיש כיצד שילובים מודולריים של diterpenoids סטנדרטים (מדיטטית) ו ציטוכרום P450 monooxygenase (P450) אנזימים ניתן להשתמש כדי ליצור מקפלים שונים diterpenoids. תרכובות מטוהרים ניתן להשתמש ביישומים שונים במורד הזרם, כגון ניתוחים מבניים מטבוליט, מבנה האנזים מחקר הפונקציה, ו בתוך מבחנה ובניסויים ביולוגית רצפה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diterpenoids מהווים קבוצה מגוונת כימית של יותר מ 12,000 ברובו פחמימנים 20-פחמן מוצרים טבעיים לשחק תפקידים קריטיים באורגניזמים רבים1. פטריות וצמחים לייצר את המגוון הגדול ביותר של diterpenoids, אבל חיידקים יש גם הוכחו טופס ביואקטיבי diterpenoids (ראה ביקורות2,3,4,5). מושרשת במגוון המבני העצום שלהם, diterpenoids לשרת שפע של פונקציות ביולוגיות. כמה diterpenoids, כגון הורמוני גדילה של הצמיחה, יש פונקציות חיוניות בתהליכים התפתחותיים5. עם זאת, רוב הדיטרפננואידים משמשים כמגשרים של הגנה כימית ואינטראקציות אינטראורגאיקליות. בין אלה, חומצות שרף diterpene בתוך הדברה ופתוגן הגנה של עצי מחטניים ומינים ספציפיים תערובות של diterpene מיקרוביאלית בגידולי מזון מרכזיים כגון תירס (Zea מייז) ו אורז (oryza סאטיבה) כבר בהרחבה למד6,7. פעילויות ביולוגיות אלה מספקות מאגר כימי עשיר ליישומים מסחריים, ובחירת diterpenoids משמשת כתרופות חשובות, תוספי מזון, דבקים, וביורוצינורות אחרים של החיים המודרניים היומיומיים8,9 ,10. כדי לקדם מחקר על הגיוון הטבעי ופונקציות ביולוגיות של diterpenoids ובסופו של דבר לקדם יישומים מסחריים רחבים יותר, כלים עבור הכנה חסכונית של תרכובות טהורות נדרשים. בידוד בקנה מידה גדול מחומר הצמח הוקם עבור כמה ביוטרואיד diterpenoid, כגון חומצות שרף diterpenoid המיוצרים כתוצר לוואי של תעשיית הנייר הזולה,8. עם זאת, הצטברות של diterpenoids ברקמות ספציפיות בלבד ותחת רגולציה הדוקה על ידי גירויים סביבתיים מגביל לעתים קרובות את הבידוד של סכומי מוצרים מספיקים ממפיק הטבעי2. בנוסף, המורכבות המבנית של דיטרפננואידים מסלים את הייצור שלהם באמצעות סינתזה כימית, למרות שגישות כאלה הצליחו במספר מקרים11,12. עם הזמינות של טכנולוגיות גנומית מתקדמת וביוכימית, פלטפורמות הייצור אנזימטיות צברה הגדלת תשומת לב להפקת מגוון תרכובות diterpenoid (ראה ביקורות13,14, 15,16,17,18).

כל הטרנואידים, כולל diterpenoids, נגזר שני מקדם-סמנים isoprenoid isopentenyl diפוספט (IPP) ו di allyl diפוספט (DMAPP)19 כי, בתורו, נוצרות דרך mevalonate (mva) או מתילאריתריטול-5-פוספט (MEP) מסלול. ביולוגי terpenoid ההכנסות דרך מסלול MEP בחיידקים ואת מסלול MVA בפטריות, בעוד צמחים בעלי ציטוסולג MVA ומסלול MEP הפלסטיות, עם האחרון להיות המסלול העיקרי לקראת היווצרות diterpenoid20. התעבות של IPP ו DMAPP על ידי העברת הסכם התפוקה המרכזית 20-פחמן מבשר לכל diterpenoids, geranylgeranyl diפוספט (GGPP)20. במורד המבנה של ggpp, שתי משפחות אנזימים, terpene סטנדרטים (tpss) ו ציטוכרום P450 monooxygenases P450s) שליטה במידה רבה על היווצרות המגוון הכימי המכריע של מטבוליזם terpene21,22. Diterpene סטנדרטים (מעודד) לזרז את המחזוריות הנהוגה על-ידי מחזוריות וסידור מחדש של ggpp כדי ליצור מגוון שונים של הדו-, פולי-, או מאקרו מחזורי מחזורית, מקפלים1,3,23, . עשרים וארבע חמצן ועוד קישוט פונקציונלי של הפיגומים האלה הוא הקלה לאחר מכן על ידי אנזימים P450 ולבחור משפחות אנזימים אחרים22,25. TPSs ו P450s להתקיים בדרך כלל כמו מינים ספציפיים, משפחות רב-גנים שיכולים ליצור רשתות biosynthetic מודולרי, שבו שילוב מודולים אנזימים שונים לאורך תוכנית משותפת מאפשר היווצרות של מגוון רחב של תרכובות2, 26. התגלית המהירה של אנזימים ברורים מבחינה פונקציונלית הפעלה מסלולים terpenoid מודולרי בשנים האחרונות סיפקה אפשרויות הרחבת לשימוש שלהם כרשימת חלקים תכליתי עבור הנדסת מטבולית של מסלולים חלקיים או מלאים ב פלטפורמות ייצור מבוססות צמחים ומיקרוביאלית. לדוגמה, שמרים (סכביסים cerevisiae ס) הוחל בהצלחה מהנדס multi-אנזים מסלולים לייצור של ביופואיד מלריה, כגון התרופה artemisinin שנת27, הדלק ביולוגי הסנסיטראיד ביאבולפן ו farnesene28, אבל גם לבחור diterpenoids29,30,31. באופן דומה, מהונדסים es, מהונדס בפלטפורמות קולי עבור ייצור בקנה מידה תעשייתי הוקמו עבור כמה מטבוליטים diterpenoid, כולל מיסוי מטקנול מספר המשמש כתרופה נגד סרטן ואת האלכוהול diterpenoid, sclareol , בשימוש בתעשיית הבושם13,32,33,34. התקדמות הנדסה גנטית טכנולוגיות שינוי גם הפכו מערכות מארח הצמח קיימא יותר ויותר להפקת מוצרים טבעיים הצמח9,14,35,36. בפרט, הטבק קרוב יחסית, טבק benthamiana, הפך מארז נרחב בשימוש עבור ניתוח המסלול terpenoid והנדסה, בשל הקלות של Agrobacterium-שינוי מתווך של שילובים גנים מרובים , ביוסינתזה יעילה של סמנים אנדודוגני, וביומסה גבוה14,35,36.

רישום על פלטפורמות אלה הוקמה עבור biopenoid ביוסינתזה, אנו מתארים כאן קל לשימוש וחסכוני שיטות לייצור אנזימטי של diterpenoids וטיהור של תרכובות יחיד. הפרוטוקולים המוצגים מדגימים כיצד E. coli ו -N. benthamiana פלטפורמות הנדסה עבור ביולוגי משופר diterpenoid הביוסינתזה יכול להיות מנוצל עבור הביטוי קומבינטורית של שונים Ditpss ו P450 אנזימים כדי ליצור תרכובות diterpenoid הרצוי. היישום של פרוטוקול זה כדי לייצר ולטהר diterpenoids שונים מבנית מוצג בדוגמה של diterpenoids מיוחדים מ תירס (Zea מייז), כינה dolabralexins, ביודוגני אנדוסינטזה של אשר מגייסים שני P450 ואחד אנזים. טיהור של dolabralexins שונים החל על-ידי אולפינים חמצון מושגת לאחר מכן על ידי שילוב החילוץ משפך הפרדה עם כרומטוגרפיה בקנה מידה גדול של עמוד סיליקה כרומטוגרפיה וכרומטותרפיה בלחץ גבוה נוזלי (בדיקות). הפרוטוקולים המתוארים ממוטבים לייצור diterpenoids, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות עבור מחלקות terpenoid קשור, כמו גם מוצרים טבעיים אחרים שעבורם משאבי אנזימים זמינים. תרכובות המיוצרים באמצעות גישה זו מתאימים ליישומים שונים במורד הזרם, כולל אך לא מוגבל, אפיון מבניים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח, להשתמש בתור מצעים למחקרים ותפקודי אנזימים, ומגוון של בעלי פעילות ביולוגית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התראה: הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שימוש בכימיקלים מסוכנים, חפצים חדים, מכשירי חשמל, חפצים חמים ומפגעים אחרים שעלולים לגרום לפציעה. יש לענוד את ציוד ההגנה האישי המתאים, ואת נוהלי הבטיחות המתאימים, כולל הדרכות בטיחות.

1. הכנת חומרים ופתרונות

  1. הכנת וכלי מעגל הקימוט בינוני (LB) עבור 30 דקות: ל 1 L של בינוני, מערבבים 10 גרם של טריטונים, 5 גרם של תמצית שמרים חיידקית, ו 10 גרם של הנאל ומתמוסס 1 L של מים מוכי (DI).
  2. עבור 1 L שיתוף ביטוי תרבויות, להכין ו החיטוי מרק מצוין (TB) בינונית עבור 30 דקות: ב 2.8 L Erlenmeyer בקבוקון ערבוב 12 גרם של טריטונים, 24 גרם של תמצית שמרים חיידקיים, ו 40 mL של 10% (v/v) גליצרול ו מתמוסס ב 860 mL של מים DI. להכין ו אוטוקלב 1.3 L של מאגר הפוספט 10x (1.3 L של מים DI, 30.03 g של פוספט מונואוטאסייום (KH2PO4), ו 163.02 g של Dipotassium פוספט (K2hpo4)] ולהוסיף למדיום לעיל.
  3. להכין ציר סופר אופטימלי עם מדיה דיכוי Catabolite (SOC).
    1. היכון והאוטוקלב עבור 30 דקות פתרון המכיל 2% (w/v) טריטונים, 0.5% (w/v) תמצית שמרים חיידקיים, 8.5 mM הנאקל, ו 2.5 mM KCl.
    2. הוספת MgSO סטרילי4 ו גלוקוז שניהם עם ריכוז סופי של 20 מ"מ. השתמש 1 M NaOH כדי להתאים ל-pH 7.0. אחסן את מדיית ה-SOC ב-20 ° c.
  4. הכן 1 ליטר של נתרן פירובט של 1 מ'. אוטוקלב במשך 15 דקות והחנות ב -4 ° c.
  5. הכינו 20 מ ל של 1 M איזופרופיל β-D-1-התאיוגלהטויוןסייד (IPTG) במים מעוקרים. מאגר 1 – 2 מ ל בעלות 20 ° c.
  6. הכנת מאגר חדירה: 10 מ"מ MES (1.952 g) ו 10 מ"מ MgCl2 (2.033 g) הומס 1 L של מים DI. חנות ב -4 ° c.
  7. להכין ו האוטוקלב ליברות אגר עבור 30 דקות: לכל 100 mL של מים DI, להוסיף 1 גרם של טריטונים, 0.5 g של תמצית שמרים חיידקיים, 1 גרם של הנאמל, ו 1.5 g של אגר. לאחר LB אגר הוא מגניב מספיק כדי לטפל בבקבוק, להוסיף אנטיביוטיקה כנדרש עבור שילובים הרצוי פלביניים. יוצקים צלחות אגר באמצעות מנות פטרי ולאחסן ב 4 ° c.
    1. ראה שולחן 1 למפרטים בנוגע לייצור מורכב ב -E. Coli ו -N. benthamiana, בהתאמה. לעטוף צלחות המכילות גריסופלובין בנייר כסף כדי למנוע השפלה על האחסון.
ריכוז עבודה (μg/mL)
אנטיביוטיקהמלאי (mg/mL)ממס1 פלמיד2 כונני פלסטיק3 או 4 פלמידים
Carbenicillin50H2O502520
כלורמפניקול30מיכל ברכה302020
קאנאמיצין50H2O502520
Spectinomycin30H2O302520
גנאמיצין50H2O30
גריסופלובין10שבילי10

טבלה 1: ריכוזים אנטיביוטיים עבור ביטוי שיתוף העין ב -E. coli או N. benthamiana.

2. ייצור של diterpenoid מטבוליטים ב -E. coli

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן עבור הפקת מטבוליטים של diterpenoid ב -E. coli הותאמה מפלטפורמה ביטוי שיתוף האנזים שפורסם בעבר, שפותחה על ידי הקבוצה של ד ר ראובן ג'יי פיטרס (אוניברסיטת איווה סטייט, IA, ארה ב)13 ,32

  1. טרנספורמציה של תאים המוסמכים עם שילובים פלביניים.
    1. הפשרת התאים המוסמכים E. coli כימית על קרח (BL21DE3-C41 תאים שימשו פרוטוקול זה).
    2. הוסף 1 μL של פתרון 100 ng/μL של כל אחד מהמבנה המשמש לביטוי משותף ל-25 μL של תאים מוכשרים במיקרו-שפופרת מיקרוצינור 1.5 mL. אל תעשה מערבולת או ערבב באמצעות ליטוף.
      הערה: לקבלת ביטוי אופטימלי ופעילות של מיתאר ואנזימים P450, יש לשקול מספר שינויי רצף. לצורך מיתאר, הסרת פפטיד מסוף N-טרמינל מעבר הפלסטיק הוא לעתים קרובות חיוני. באופן ספציפי, מונו הפלסטיות-והדי-מיתאר בדרך כלל דורשים הסרה של פפטיד המעבר החזוי (באמצעות אלגוריתמים משותפים לחיזוי37), ואילו ציטוטיוג sesqui-המיתאר יכול בדרך כלל לשמש גנים באורך מלא. ביחס P450s, מיטוב קודון כמו גם הסרה או החלפה עם מנהיג רצף makktsskgk של התחום N-טרמינל טרנסרפידת הוכיחה יעיל במקרים רבים38,39. בנוסף, כאשר ביטוי משותף P450 אנזימים ציטוכרום P450 רדוקטאז (החייאה) צריך להיכלל כדי להבטיח מספיק P450 פעילות.
    3. מודקון את התערובת על הקרח 30 דקות. מערבבים כל 10 דקות על ידי שריטה בעדינות את הצינור על גבי מתלה מיקרוצינורית.
    4. Pre-מודטה SOC מדיה לוחות LB אגר ב 37 ° c המכילים אנטיביוטיקה כנדרש עבור השילוב הרצוי של בנייה.
      הערה: כל לבנות להיות שינוי משותף חייב להיות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים, כמו גם מקורות ברורים של השכפול כדי להבטיח ביטוי חלבון אופטימלי.
    5. מחממים את תערובת התאים ב-42 ° c לדקה אחת, ולאחר מכן מודכות על הקרח לפחות 2 דקות.
    6. הוסף 200 μL של מדיית SOC חמה.
    7. לנער את התערובת תא 1 h ב 37 ° צ' ו 200 סל ד.
    8. להוסיף כ 10 חרוזי זכוכית אוטוקלאויים לצלחת ליברות החמם אגר. הוסף 100 μL של תערובת התא והחלף את המכסה. טלטל את הצלחת אופקית כאשר המכסה מופעל כדי לפזר את התאים באופן שווה. להסיר את חרוזי זכוכית על ידי הקשה עליהם לתוך מיכל פסולת. לחלופין, השתמש בשיטות ציפוי מועדפות אחרות.
    9. מודקת צלחת ליברות אגר ב 37 ° c לילה עם פני השטח מצופה למטה. הצלחת עם מושבות E. coli משתנה ניתן להשתמש למחרת או מאוחסן ב 4 ° c אטום בסרט פרפין עד 2 שבועות.
  2. הכנת תרביות חיסונים
    1. ביום למחרת, להכין פתרון של בינונית LB עם אנטיביוטיקה הנדרש עבור שילוב הפלסטיות השתנה באמצעות הריכוזים המסופקים בטבלה 1.
    2. במכסה סטרילי, העברה 5 מ ל של LB בינונית ל 15 mL בדיקת זכוכית סטרילית עם כובע נשימה פלסטיק. הכינו צינור תרבות קטן אחד לכל תרבות גדולה (1 ל).
    3. בחר מושבות E. coli בודדות מלוחית LB אגר באמצעות טיפ פיפטה. האיחסן כל שפופרת של LB עם מושבת E. coli על ידי הוצאת טיפ אחד של פיפטה המכיל מושבה שנבחרה לתוך כל צינור.
    4. . עם כובע פלסטיק לנשימה הציבו את התרבויות הקטנות המושלגות ב - 37 מעלות צלזיוס לטלטול במשך 12 עד 24 שעות.
  3. הכנה ואינדוקציה של תרביות ביטוי שיתוף
    1. ביום למחרת, להוסיף 100 mL של מאגר מוכן 10x פוספט ל 900 mL של מוכן TB עבור ריכוז האחרון פוספט מאגר של 1x. הוסף אנטיביוטיקה הדרושים עם ריכוזים לפי לוח 1.
    2. ללחוץ על 140 סל"ד ב 37 ° צ' עד חם (כ 30 דקות).
    3. האיחסן כל בקבוקון של מדיה עבור תרבויות של L 1 עם 5 מ ל של תרבות החיסון. השתמשו בעצת הפיפטה המשמשת לחיסון החיסון בצינור החיסון, כך שבעת החילוץ עם הממס האורגני בצעדים הבאים, אין מזהמים פלסטיים מחולצים.
    4. דגירה עם טלטול ב 200 סל ד עד הצפיפות האופטית ב 600 nm (OD600) מגיע 0.6, כ 3 h. כדי למדוד את OD600 עם ספקטרוסקופיה, להשתמש תערובת של TB סטרילי עם מאגר פוספט כריק.
    5. ב-OD המבוקש600, קבעו את הגדרות החממה ל -16 ° c.
    6. כאשר שיתוף הביטוי P450s, טרי להכין את הריבופלאווין וחומצה עמינח levulinic, אשר חיוניים מספיק P450 שיתוף גורם הייצור. עבור כל ניסוי, לעשות 4 g/L ריבופלאווין ו 150 g/L עמינח לבנאית חומצה. לשמור על פתרון עטוף בנייר כסף עד השימוש, כמו ריבופלאווין הוא רגיש באור.
    7. לאחר שהאינקובטור הגיע ל-16 ° צ' (כ -30 דקות), הוסיפו 1 מ ל 1 מ-IPTG, 1 מ ל של 4 g/L ריבופלאווין, ו-1 מ ל של חומצה עמינח של 150 g/L לתרבות. עבור ייצור diterpenoid, 25 מ ל של 1 מ ' נתרן פירובט יש להוסיף לכל תרבות כדי להבטיח היווצרות הקודמן מספיק.
      הערה: כל המבנים הנמצאים בשימוש בנתון זה היו תחת אותו מיזם IPTG-inducible. ניתן להשתמש ביזמים שונים כרצונכם.
    8. דגירה ב 16 ° צ' ו 140 סל ד עבור 72 h. הוסף 25 מ ל של נתרן פירובט כל יום לאחר האינדוקציה אם הפקת diterpenoids. להשתמש מיד בתרבויות משמשים מיד להפקת משפך מופרדים של מטבוליטים; לא לקצור או לאחסן תרבויות.

3. הפרדה וטיהור של מטבוליטים

  1. הוצאת משפך מופרדים של מטבוליטים
    הערה: חשוב להשתמש רק כלי זכוכית ופיפטות זכוכית כאשר משתמשים במיסים אורגניים כדי למנוע זהום פלסטיות.
    1. , בתוך מכסה המנוע. אבטח את המשפך הבדלנות לדוכן הטבעות הניחו מיכל פסולת מתחת למשפך הבדלנית.
    2. יוצקים 500 mL של 50/50 (v/v) אתיל אצטט/הקסאנס לתוך משפך מופרדים.
      הערה: התערובת ממיס צריך להיות מותאם על בסיס מסיסות וקוטביות של מטבוליטים ייעודיים. ממיסים miscible מים יש להימנע כדי להבטיח הפרדת הפאזה המתאימה.
    3. הוסף 500 מ ל של התרבות E. coli למשפך מופרדים ומקום על פקק זכוכית.
    4. לטלטל את המשפך כדי לערבב את התרבות עם הממס החילוץ, כ 5-10x. לעתים קרובות דה-גז המשפך על ידי פתיחת הברז בזמן המשפך מוחזק הפוך והצביע על המנוע כדי לשחרר לחץ. חזור על הליך הניעור והדה-גז 2x.
    5. מניחים את המשפך זקוף במעמד הטבעת ומחכים עד ששכבת הממס (למעלה) נפרדה מהשכבה הימית (למטה), כ-1 דקות.
      הערה: כאשר כמות גדולה של בועות היא נצפתה בשלב הפנימי, תוספת של נפח קטן של 5 – 10 mL אטוח ניתן להוסיף כדי לשפר את הפרדת הפאזה.
    6. . הסירו את הפקק לנקז את שכבת ה-coli לתוך גביע פסולת, שמירה על שכבת הממס במשפך.
    7. חזור על ההליך באמצעות הנותרים 500 mL של E. coli התרבות ואת הממס 500 mL זהה בשימוש עבור החילוץ הראשון.
    8. לנקז את הממס המכיל את מטבוליטים מחולץ לתוך בקבוקון נקי. הימנע מזיהום עם התרבות E. coli .
  2. אידוי התאיידות הריכוז
    1. הכינו את ציוד האידוי הרוטרי (rotovap): מלא את אמבט המים והגדר את הטמפרטורה ל -25 ° c. למתחמים רגישים לחום, השתמשו בטמפרטורה נמוכה יותר או הוסיפו קרח לאמבט המים. למלא את התא עיבוי עם קרח יבש להגדיר את המהירות מסתובבת 60 – 80 סל ד.
    2. הוסף כ 700 מ ל של המחולצים מטבוליטים ל 1 L לאדות בקבוקון, לצרף את rotovap, ולהוריד לתוך אמבט מים. הפעל את מחמם המים והגדר ל -25 ° c.
    3. התחל סיבוב של בקבוקון להתאדות, להדליק את מערכת ואקום, ובהדרגה להגדיל את היניקה כדי למנוע רתיחה מהירה של התמיסה מטבוליזם לתוך הבקבוקון פסולת. ממיסים התאדו צריך להתחיל עיבוי לטפטף לתוך העיבוי איסוף (פסולת) בקבוקון.
    4. כאשר רק מספר mL של הפתרון מטבוליזם נשאר בבקבוקון להתאדות, לעצור סיבובים ולכבות את מערכת ואקום. הרימו את בקבוקון התאדות. וסגרו את קו הוואקום שמור על הפתרון המוטבוליט מרוכז נותר בבקבוקון התאדות. . היפטרו מפסולת הבקבוקון
    5. המשך התאיידות רוטרי על ידי הוספת עד 700 mL של פתרון נוסף מטבוליזם לייט לתוך הבקבוקון להתאדות. חזור על התהליך עד שכל פתרון מטבוליט שחולצו התרכז.
    6. להסיר את מטבוליטים מרוכז מן הבקבוקון להתאדות על ידי העברת עם צינור זכוכית למבחנה חדשה. לשטוף בקבוקון התאדות עם 5 מ ל של 50/50 (v/v) אתיל אצטט/הקסנס או תערובת ממיס הרצוי פעמיים, העברת פתרון שטיפה למבחנה הבדיקה.
    7. החנות מרוכזת מטבוליטים ב-20 ° צ' או-80 ° צ' (תלוי ביציבות המוצר) עד לשימוש נוסף.
  3. טיהור עמודות סיליקה
    1. הכנת כלי זכוכית על ידי שטיפה 1 L גביע, משפך זכוכית, 50 mL בדיקת צינורות, ו 3.2 L כרומטוגרפיה עמודה (מצויד עם סריג זכוכית) פעם עם הקסאן ופעם עם אצטט אתיל. תווית 50 mL לבדוק צינורות, אשר ישמשו לאיסוף שברים.
    2. להוסיף 2 L של סיליקה ג'ל (230 – 400 רשת שינוי, כיתה 60) לטור 3.2 L כרומטוגרפיה עם קיבולת מאגר 2 L ו דיסק מטוגן, ואז לטעון חול כדי ליצור שכבה 5 ס מ בחלק העליון של הטור.
    3. הכינו את הטור לכרומטוגרפיה על-ידי שטיפה ביסודיות עם 2 ליטר של הקסאן. בכל עת, צריך להיות דק (~ 0.5 ס מ) שכבה של נוזל הממס מעל שכבת החול של העמודה כדי להבטיח את העמודה לא להתייבש או לרכוש כיסים אוויר. מתאם כניסת זכוכית המחובר לצינור אוויר ניתן להשתמש כדי להגדיל בעדינות את קצב הזרימה דרך הטור ולא כבידה לבד.
    4. טען את תמצית מטבוליט מרוכזת (ראה סעיף 3.2) אל העמודה. לשטוף את הבקבוק כי הכיל את המדגם 3x עם הקסאן ולהוסיף לעמודה כדי להבטיח את כל המדגם הועבר.
    5. באמצעות מעבר הצבע הבא, לטעון 100 mL בכל פעם ולאסוף 50 mL שברים שכותרתו לבדוק צינורות: 100% הקסנס 3x, 10% (v/v) אתיל אצטט ב-3x הקסאנס, 12.5% (v/v) אתיל אצטט ב-3x הקסאנס , 20% (v/v) אתיל אצטט ב 3x, 40% (v/v) אתיל אצטט ב הקסאנס 3x, 60% (v/v) אתיל אצטט ב הקסאנס 3x, ו 100% אתיל אצטט 4x.
      הערה: יש לכוונן את המעבר לפי גודל מורכב וקוטביות והפרדה רצויה.
    6. באמצעות פיפטה זכוכית, להעביר 1 מ ל מכל שבר לתוך בקבוקון GC בתווית. לנתח כל מדגם באמצעות GC-MS כדי לקבוע אילו שברים להכיל את מטבוליטים הרצוי ורמת הטוהר שלהם.
      הערה: השיטה GC-MS מתאים מטבוליטים המיוצרים בשיטה זו תוארה ב Mafu et al. 201839. בקצרה, כל הניתוחים בוצעו על GC עם גלאי MS XL באמצעות העמודה HP-5MS (ראה טבלת חומרים), נפח מדגם של 1 μl, ואת טמפרטורת התנור השיפוע מ 50 ° צ' עד 300 ° צ' ב 20 ° c מינימום-1.
    7. לאחר קביעת השברים המכילים את התרכובת המעניינים, שלב את כל השברים המכילים את אותו מתחם. היפטר כראוי משברים שאינם מכילים תרכובות למכל פסולת. חזור על הליך אידוי הרוטרי אם יש צורך למקד את מטבוליטים מטוהרים.
    8. אם יש צורך בטיהור נוסף, יש להשתמש (למחצה) באמצעות כיצד לשפר את טוהר המוצר. יש להתאים את פרוטוקולי העיבוד השונים על פי מפרט ציוד פרטני ותרכובות עניין.
      1. השהה מחדש סיליקה מיובשים כרומטוגרפיה דגימות ב 1 mL הקסאן (diterpene פחמימנים) או acetonitrile (diterpene), ולסנן דרך מזרק מסנן כדי למנוע זיהום עם חלקיקים קטנים.
      2. עבור diterpenoids לא קוטבי, השתמש בעמודת CN (ראה טבלת חומרים) עם קצב זרימה מומלץ של 1 מ"ל/min ו-hexane: אתיל אצטט הדרגתי, עם שברים שנאספו כל 1 דקה.
      3. עבור diterpenoids הקוטב, השתמש בעמודה סי18 (ראה טבלת חומרים) עם קצב זרימה מומלץ של 3 מ"ל/min ו acetonitrile: הדרגתי מים, עם שברים שנאספו כל 1 דקה.
      4. יבש כל כרומטוגרפיה שברים מטוהרים תחת זרם חנקן ולהשעות מחדש 1 mL הקסאן לפני ניתוח GC-MS כדי להעריך את שפע המוצרים וטוהר.

4. ייצור של דיטרפנאיד מטבוליטים באמצעות N. benthamiana

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן להפקת diterpenoid מטבוליטים ב N. benthamiana הותאמה ממחקרים שדווחו בעבר35,36,40,41. הפרוטוקול להלן הוא ספציפי הסתננות מזרק של N. benthamiana עלים. שיטות חדירה אחרות, כגון הסתננות ואקום מתאימים באותה מידה. מערכות וקטוריות בינאריות מסוג T-DNA, כגון pCAMBIA130035Su (pLIFE33) או peaq-HT40,41,42, המאפשרות הפצה ב- E. coli ו -tumefaciens וביטוי גנטי במארחים הצמח הם מתאים לפרוטוקול זה.

  1. נטיעות טבק benthamiana
    1. מילוי 1 750 mL עם קרקע השתילה ומים הסיר. הוסף 20 זרעי טבק והקש בעדינות עם האצבע כך שהם באדמה. . אל תכסה באדמה
      הערה: ניתן ליצור זרעים באמצעות האבקה עצמית לצורך הפצת זרעים. זרעים לניסוי זה הושגו ממחלקת הביולוגיה של משרד החקלאות דיוויס, והם זמינים באופן פומבי באמצעות מאגר המעברה (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450).
    2. השאירו את הסיר בחדר גידול עם התנאים הבאים, משקה כל יום אחר כדי להבטיח את הקרקע לא להתייבש. לגדל צמחים ב 26 ° צ' ו 60% לחות עם 16:8 h יום: מחזור הלילה עבור כל השלבים בפרוטוקול זה.
    3. לאחר 1 שבוע, למלא ~ 20 סירים עם קרקע השתילה מים סירים. באמצעות מלקחיים, לתפוס שתיל טבק על ידי גבעול ולהסיר בעדינות מסיר המקור, הצבת שתיל אחד בכל סיר חדש ובזהירות burring את השורשים. אין לפגוע בעלים או בשורשים.
    4. מים את הצמחים בכל יום אחר על ידי הצבת מים במגש הסירים נמצאים (נקרא גם "השקיית התחתון"). כל השקיה רביעית, לכלול דשן גנרי במים לפי הוראות החבילה.
  2. הקפאת הפשרת הטרנספורמציה של Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 תאים מוכשרים
    1. הפשרת Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 (או זן מועדף אחר) תאים המוסמכת על קרח (~ 1 h). לפני הצינה 0.2 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות על הקרח. מדיית SOC חמה ב -28 ° c.
    2. בעדינות לערבב תאים עם עצה pipet (לא pipet למעלה ולמטה) ו סדרת מחלקים 15 μl של תאים עבור כל שינוי לתוך מקורר 1.5 mL מיקרו צינורות.
    3. הוסף 1-5 μL (~ 400 ng) של ה-DNA לכל שפופרת של תאים מוכשרים ולערבב בעדינות על ידי שפופרת מגרדים לאורך מתלה צינורית.
      הערה: המבנים הרצויים לא צריך להיות שונה התנוחות אנטיביוטי כי הם כל אחד משתנה בנפרד יהיה מעורב לפני הסתננות.
    4. מניחים מיקרוצינורות בחנקן נוזלי למשך 5 דקות.
    5. הסירו מיקרוצינוריות מחנקן נוזלי והניחו את הצינורות על מדף החדר הזמני. הפשרת שפופרות עבור 5 דקות בחממה 37 ° c.
    6. הוסף 250 μL של SOC מחומם מראש (28 ° c) לכל מיקרוצינורית. לנער ב 28 – 30 ° צ', 225 סל ד, עבור 3 שעות.
    7. צלחת 50 μL של תאים שהפכו אל LB אגר לוחות המכילים את אנטיביוטיקה הדרושים בטבלה 1 באמצעות חרוזי זכוכית סטרילית, כפי שמתואר בשלב 2.1.8.
    8. הצלחות דגירה הפוכה 28 – 30 ° צ' עבור 48 h. צמיחה בתוךיום 1 של דגירה עשוי להיות סימן לזיהום. ניתן להשתמש ב -tumifaciens בעקבות הדגירה של 2 ימים או מאוחסן ב 4 ° c אטום בסרט פרפין עד 2 שבועות.
  3. Agrobacterium-מתווך האנזים ארעי שיתוף הביטוי ב טבק benthamiana
    1. שזיף 4-שבוע-הצמחים טבק benthamiana 2 ימים לפני הסתננות על ידי הסרת עלים תחתונים. השאר 4 עלים. . המים את הצמחים אין להשקות את הצמחים 24 שעות לפני הסתננות כדי לאפשר שיניים פתוחות וחדירה קלה יותר.
    2. הוסף 10 מ ל LB עם ריכוזי עבודה של אנטיביוטיקה המתאים עבור המבנים שנבחרו ו Agrobacterium זן (המתואר בטבלה 1) לצינור בדיקת זכוכית סטרילית 50 mL עם מכסה רדיד אלומיניום.
    3. איחסן באמצעות מפית של פיפטה כדי לנקות מושבה אחת של Agrobacterium ולהוציא את הקצה לתוך מדיה ליברות. . לפחות 2 תרבויות קטנות
    4. דגירה הלילה ב 28 ° צ' ו 220 סל ד.
    5. מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) של התרבויות לילה באמצעות ספקטרוסקופיה. לדלל את התרבויות לילה כדי OD600 של 1.
      הערה: הערכים האופטימליים של OD600 הינם עשויים להשתנות בעת שימוש בזני Agrobacterium אחרים.
    6. הפץ 10 מ ל של תרבות לילה מדוללת לתוך 50 מ"ל שפופרות חרוט.
    7. לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 3500 סל ד עבור 15 דקות על החדר temp. . שפוך והשמט את הסופרנטאנט
    8. להשעות מחדש את התרבויות במאגר הסתננות של 10 מ ל על ידי טלטול בעדינות את הצינור ומתגלגל על מדף צינורית. ה-OD600 אמור להיות שווה 1 עבור כל מבנה.
    9. צור את השילובים הרצויים לחדירות על-ידי שילוב של כמויות שוות של כל קו תאים שעבר טרנספורמציה. OD600 צריך להיות שווה 1 עבור כל חדירה. הערכה 5 מ ל של פתרון הסתננות לכל עלה, 2 עלים לכל צמח.
    10. הצמד צינורות אופקית לנדנדה ורוק בעדינות עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    11. לחדור ~ 2 עלים לכל N. מפעל benthamiana באמצעות כ 5 מ ל של תערובת הסתננות לכל עלה. לחדור עלים בריאים עם מזרק בלתי מפותח על החלק התחתון של העלים תוך הפעלת לחץ נגד עם אצבע בצד העליון של העלה כדי להבטיח פתרון הסתננות מפזרת את רקמת העלה.
    12. סמן את כל העלים החדרו עם סמן שחור או אינדיקטור אחר. בחדר הגידול למשך 5 ימים. לשמור על הצמחים ההשקות היטב.
      הערה: זמן דגירה של חמישה ימים הוכיחה מספיק להגיע רמות diterpenoid מספיק עבור ניתוחים במורד הזרם, תוך שמירה על יעילות הזמן של היווצרות המוצר. ניתן לבדוק תקופות דגירה ארוכות יותר, בהן נדרשים סכומי מוצרים גבוהים יותר.
  4. מטבוליט מיצוי וטיהור מטבק benthamiana
    1. הקציר הסתנן עלים מצמחים על ידי לגזור אותם מן הצמח. להוסיף ~ 100 mL של חנקן נוזלי ועלה אחד לחומר מליטה, ולאחר מכן לטחון באמצעות מרגמה או מטחנת רקמה או רקמות עד קבלת אבקה משובחת.
    2. הוסף אבקה בבקבוקון של GC-MS לתיחום 500 μL. הוסף 1.5 mL של 50/50 (v/v) אתיל אצטט/הקסאן או הצורך תערובת הממס למבחנה וכובע הדוק.
      1. עבור ביטויים שנבדקו כדי לספק את המוצרים הרצויים, רקמת הקרקע הבריכה לתוך בקבוקון גדול יותר או מבחנה, ואז להוסיף ~ 2x את כמות הממס מאשר נפח הרקמה ולנער לילה. המשך לשלב 4.4.5 לטיהור.
    3. מניחים את כל הבקבוקונים במתלה מיקרוצינורית ומדביק את הנייר בחוזקה כדי לאבטח. מחלץ תחת טלטול נמרץ לילה בטמפרטורת החדר.
    4. העבר 400 μL של חילוץ ו 600 μL של הקסאן לתוך בקבוקון חדש GC-MS. . אל תעשה שום רקמת עלים לנתח דגימות באמצעות GC-MS באמצעות השיטה המתוארת בשלב 3.3.6.1.
    5. לאחר ניתוח באמצעות GC-MS עבור נוכחות של מטבוליטים הרצוי, עלה הבריכה תמציות יחד ולהמשיך דרך אידוי רוטרי, כרומטוגרפיה של העמודה סיליקה, ו-ובדיקות כדי להשיג תרכובות טהור כמתואר סעיפים 3.2 ו 3.3.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה סכמטית עבור ייצור diterpenoid באמצעות E. coli
איור 1 ממחיש את זרימת העבודה המתוארת עבור ייצור diterpenoid. הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מפלטפורמת E. coli בעבר שתוארה לביוסינתזה diterpenoid13,32 לשימוש בתרבויות נפח גדול יותר וטיהור של מוצרים diterpenoid הרצוי באמצעות סיליקה כרומטוגרפיה. כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה, השתמשנו מסלול dolabralexin שזוהו לאחרונה מ תירס המהווה שני מדיטגים, ZmAN2 (Zm00001d029648) ו ZmKSL4 (Zm00001d032858), רב תפקודי P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), ו ציטוכרום P450 רדוקטאז (ZmCPR2, Zm00001d026483) (איור 2). בקצרה, E. coli BL21DE3-C41 תאים המוסמכים השתנו מראש עם pcdfduet: IRS ו-pacyc-דואט: ggpps/ZmAN2 פלמידים13,32. PCDFDuet: הIRS הכנסה מכיל אנזימים מפתח עבור הייצור הקודמי diterpenoid, כולל 1-deoxy-d-xylulose-5-פוספט סטנדרטים (dxs), 1-deoxy-d-xylulose-5-פוספט רדוקטאז (dxs), ו isopentenyl diphosphate איזומראז (אידי), והוכח להגדיל את היווצרות diterpenoid ב -E. coli13. PACYC-דואט: GGPPS/ZmAN2 פלאבין מכיל את תירסלהיות-copalyl Diphosphate סטנדרטים ZmAN2 ו-ggpps סינתאז מ abies grandis. אנזימים מעודדים את התגובות מחויבות בביוסינתזה dolabralexin היו אז שינו שינוי כמו פלמידס pET28b: ZmKSL4 ו pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. לפרטים על רצפים ובנייה פלסטלינה לראות Mafu et al. 201839.

GC-MS chromatogram של מוצרי האנזים המחולצים מוצג באיור 3A, הממחישות את היווצרות של שלושה תרכובות דולאבalexin, כלומר dolabralexin (1.2 ± 0.25 Mg/l תרבות), אפוקסי (0.65 ± 0.2 Mg/l), ואפוקסידולרן (11.4 ± 1.1 mg/L תרבות) ככמת בהתבסס על עקומת תקן באמצעות sclareol diterpenoid. Sclareol שימש כתקן התייחסות, בשל מבנה דומה ותכונות כימיות לעומת dolabralexins. בדרך כלל נצפו לוואי משנית כוללים כלוראמננול, האינדול נגזרות אוקדול ו אינדול 5-אלדהיד, ו-geranylgeranyl diphosphate (באיור 3). אינדול מייצג בדרך כלל את התוצר הראשי העיקרי, אך אינו מוצג כאן, עקב זמן ההחזקה קצר יותר מאשר ההשהיה הממיסים של 7 דקות כדי לשמר את שלמות הכלי של GC-MS.

מבנה סכימטי של ייצור דיטרפנאיד באמצעות N. benthamiana
איור 4 מתאר סקירה של הביטוי של השביל dolabralexin ב N. benthamiana. עבור המוצרים המתוארים כאן, המבנים הבאים השתנו בנפרד לתוך מאמץ GV3101: pLife33: p19 (ביטוי את הגן p19 השתקה חלבון מדכא ), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. רצפי מקורי באורך מלא של תירס dolabralexin מסלול גנים שימשו בינארי T-DNA וקטור pLife3341 עם התנגדות kanamycin להפצה ב -E. coli ו . tumefaciens. שיתוף ביטוי של הגנים מסלול טרפנאיד במעלה הזרם הוא אופציונלי, מאז geranylgeranyl בראש diphosphate נוצר באופן שורש ב N. benthamiana. עם זאת, מספר מחקרים המועסקים בהצלחה גישות כאלה כדי להגדיל את היווצרות diterpenoid ב N. benthamiana14,36,41. כפי שמודגם באיור 3, ביטוי משותף הפיק בהצלחה dolabradiene ו 15, 16-שמנת שמנת. שלא כמו ביטוי האנזים שיתוף ב- E. coli, 15, 16-האפוקסי שמלא זוהה בתמציות מטבוליט.

הנוכחות של 15, 16-שמני שמנת בתמציות עלים הפגינו את הפעילות של CYP71Z18 ב- N. benthamiana. כמו 15, 16-באפוקסי שקילה הוכח להיות יציב לאחר החילוץ מתרבויות מיקרוביאלית (איור 3), כמו גם לאחר בידוד מרקמות שורש תירס במחקרים קודמים39, נראה סביר כי המוצר הידרולכללי הוא גליסיליס על-ידי הגלימטיות אנדוגני ולאחר מכן בהפרדה בתוך החללים, עיבוד זה אינו נגיש לחילוץ עם תערובות ממיסים אורגני המשמשים כאן לחילוץ36,43,44,45 ,46. דומה שינויי מוצר בלתי רצויים בהקשר של הנדסת מסלול ב -N. benthamiana דווחו במחקרים קודמים47. כפי שמוצג לגבי ביטוי משותף ב -E. coli, ביטוי חולף ב-N. benthamiana התוצאות בהפקת של מספר לוואי, כולל alkanes ליניארי של שרשרת שונים כפי שהוא מבוסס על התייחסות למסדי נתונים ספקטרום מסה. מגדל תרכובת שחולצו מן החומר עלה נמצאו בממוצע 2.4 +/-0.5 mg dolabradiene ו 0.9 +/-0.3 mg 15, 16-באפוקסי לגרם ברקמת עלה יבש. מגדל אלה לא ניתן להשוות ישירות למערכת E. coli שיתוף ביטוי בהינתן מערכת ניסיוני שונים.

טיהור דיטרפנאיד
טיהור diterpenoid הושג באמצעות כרומטוגרפיה של העמודה סיליקה ולאחר מכן למחצה הסדר. מטבוליט תמציות מ 12 ליטר של תרבויות E. coli במאגר היו מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה של העמודה סיליקה להפריד את שלושת תרכובות dolabralexin מוקד (איור 3a). סיליקה כרומטוגרפיה הוא אידיאלי להשגת טוהר גבוה של תרכובות היעד, כיוון שהוא מאפשר הפרדה פשוטה של הנגזרות של diterpene אולפינים ו חמצן, ובקלות מסיר את הזיהום העיקרי, oxindole, אשר נשמר על מטריצה סיליקה ( איור 3A).

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה עבור ייצור diterpenoid ב -E. coli וטיהור מטבוליט מתרבויות בקטריאלי נוזלי. תיבות מקווקוות מתארות שלבים אופציונליים שבהם נדרש טיהור נוסף. (א) דמות ייצוגית של תרבות ה-coli המחולצות באמצעות משפך מופרדים. (ב) דמות מייצגת של טיהור מטבוליזם לחלץ באמצעות כרומטוגרפיה סיליקה.   אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: המסלול הביוסינתטי Dolabralexin ו בנייה גנים המשמשים במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: התוצאות של GC-MS. המוצג הם מייצגים GC-MS כרומאטוגרמות של מוצרי diterpenoid מטוהרים המתקבלים באמצעות אנזים שיתוף הביטוי בחני ב (א) E. coli ו (ב) נ. בנאמיאנה. שמות המוצרים מבוססים על השוואות לתקנים אותנטיים והתייחסות לספקטרום המסה של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (נשים). 1, אוקדול; 2, אינדול 5-אלדהיד; 3, פירולו [1, 2-a] משושה-1, 4-dione, הקסהיהידרו-3-(2-מתילפרופיל)-; 4, 6-O-מרחריל -1-[4-ברומרופריל] thio]-א-ד-גלוקוסייד, S-דו-חמצני; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-אפוקסי; 7, פירולו [1, 2-a] משושה-1, 4-dione, הקסהיהידרו-3-(פנילמתיל)-; 8, 15, 16-אפוקסי-דולאבראנל; 9 ו -12, לא ידוע; 10, כלורמפאנקול; 11, 3, 7, 11, 15-טטרמתיל -2-hexadecen-1-ol; .13-16, אלקאנס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ייצור דיטרפנאיד ב -N. benthamiana. (א) זרימת עבודה של ייצור diterpenoid ב N. benthamiana וטיהור מטבוליט מחומר עלה. (ב) דמות ייצוגית של N. benthamiana צמחים מוכן לניסויים חדירה, לפני גיזום. (ג) תמונות מייצגות של הצמחים של N. benthamiana לאחר גיזום. (ד) תמונה של מזרק-לחדור עלים. . אזורים אפלים החדרנו לחדרו אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירה רחבה ויישום של מוצרים טבעיים diterpenoid מחייבת פשוט, פרוטוקולים זולים לסנתז ולטהר כמויות מספיקות של תרכובות הרצוי. העלייה המהירה של מספר diterpenoid-אנזימים מטבולית ממגוון רחב של מינים מספקת כעת מלאי ולקיבולת עבור הייצור האנזימטי של diterpenoid באמצעות מערכות מארח מבוססות צמחים וחומרים מארחים. בנוסף, הארכיטקטורה המודולארית של מסלולים diterpenoid רבים מאפשר את השימוש באנזימים מאותם מינים או שונים בתוך ' הכנס & שחק ' קומבינטורית הנדסה גישות לייצר מערך טבעי וחדש כמו הטבע diterpenoid טבעי . מוצרים2,14,26,35

E. coli הוא מארח חיידקים מועדף עבור יוסינטזה מוצר טבעי בשל החוסן שלה, קלות מדרגיות, מורכבות כימית מוגבלת לזיהום התוצר לוואי מופחת, ואת העושר של כלים זמינים עבור הרכבה וביטוי DNA אופטימיזציה. בניסיון שלנו, הפלטפורמה המתוארת כאן הוא מתאים היטב להפקת תשואות המוצר של עד כמה מאות מ"ג diterpene אולפינים ו אלכוהול, אשר מתאים ליישומים רבים במורד הזרם כולל אלה המוצעים כאן. בעוד לא להיפגש בקנה מידה תעשייתי, פלטפורמת הייצור המתוארת כאן יכול לשמש כבסיס עבור מסלול נוסף, מארח, ומיטוב התסיסה כפי שכבר הפגינו בהצלחה עבור diterpenoids קשורים כגון מיסוי sclareol33 ,34. ביטוי יתר של הגבלת קצב MVA או מסלול MEP הגנים כבר הוקמה בהצלחה כדי להתגבר על תשואה הגבלת גורמים לביוסינתזה diterpenoid, כגון אספקה קודמן מספיק השטף הקודמי לתוך מסלולים מתחרים13, 32,33,39. למרות מוכח מוצלח במחקרים מספר, הביטוי המסכן ופעילות קטליטי של terpenoid-מטבולית איקריוטית P450s ואנזימים מאוגד ממברנה אחרים E. coli הוא גורם מגביל סביר33,39 ,48,49,50,51,52. שימוש ברצפים ממוטבים של codon ושינויי חלבונים, כגון הסרת האות פפטיד בתדר רשתית פלזמית או מבוא של פפטיד האות הפלסטיות, הוכיחו שימושי כדי להגדיל P450 ביטוי מסיסים14,38 ,49,50,53. שינויים כאלה היו גם מועסק עבור מיקרוביאלית ביטוי של תירס CYP71Z1839 משמש כמסלול לדוגמה במחקר זה. הפרוטוקולים המתוארים מבוססים על שימוש בפלמידים הנושאים גנים אחד או שניים לכל מבנה, כולם תחת אותו מקדם inducible. היכן שילובי גנים בקנה מידה גדול יותר רצוי, מומלץ להשתמש בקלטות מרובות גנים מסוגים שונים או לערום מערכות גנים כדי להמתיק את יעילות השינוי הנמוכה ואת צמיחת התרבות עקב שימוש בפלמידים מרובים ואנטיביוטיקה13 .

עם זמינות רחבה יותר של גנטיקה משאבים גנומיקה, מערכות מארח הצמח גם להיות מתאים יותר ויותר לייצור של מוצרים טבעיים. היתרונות כוללים את היכולת של צמחים לייצר את הסמנים הטבעיים הדרושים מופעל על ידי הפוטוסינתזה, ובכך מאפשר היווצרות המוצר ללא צורך להשלים מולקולות קודמן54,55. N. benthamiana כבר בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי vivo וביטוי קומבינטורית של terpenoid ומסלולים אחרים מוצר טבעי14,35,36,40 . היתרונות הבולטים של שימוש ב -N. benthamiana כמערכת מארח כוללים את הייצור האנדוגניים של מקדים diterpenoid, השימוש ברצפי גנים יליד, ביטוי מפושט של איקריוטית P450s, קלות של שינוי גנים קומבינטורית (כמו אנטיביוטיקה נפרדת אינם נדרשים עבור שיתוף משותף ארעי), והפקת פשוטה של מוצרי יעד מחומר עלה. במידת הצורך, ייצור diterpenoid יכול להיות משופר באמצעות שיתוף ביטוי של גנים מסלול mep מפתח כדי להגדיל את האספקה הקודמן36,41. אילוצים עבור ייצור diterpenoid מדרגי ב -N. benthamiana הם מורכבים יותר לעומת תרבויות מיקרוביאלית נוזלי בשל הצורך ביצירת ביומסה צמח מספיק, טיהור עבודה אינטנסיבית יותר מוצר מקומפלקס כימית רקמת הצמח, והאפשרי בלתי רצויות של מוצרי היעד דרך, למשל, חמצון, גליקוזילציה או dephosphorylation על ידי אנזימים אנדוגני36,43,44,45 ,46,47. עם זאת, הליך זה ניתן לשנות עד כמויות המוצר של mg על ידי הגדלת מספר הצמחים המשמשים לחדירה56.

הפקת המוצר ופרוטוקולי הטיהור המתוארים כאן תואמים ל -E. coli ו -N. benthamiana, כמו גם S. cerevisiae ס ומערכות אחרות של צמחים או חיידקים, ולספק גישה חסכונית קל ל הקים מעבדות ביולוגיה וכימיה ואינו דורש ציוד טיהור יקר. מטבוליזם מטבוליט באמצעות משפך מופרדים הוא מתאים היטב לחילוץ יעיל והפרדת הפאזה לפני טיהור כרומאטוגרפי. ניתן לכוונן בקלות את גודל המשפך כדי לאפשר כמויות גדולות יותר של התרבות ולהקטין את הזמן הנסיוני הדרוש לחילוץ מתרבויות גדולות. מצאנו את השימוש של hexane/אתיל אצטט מעבר להיות אידיאלי לחילוץ diterpenoids של קוטביות שונים כפי שניתן להדגים כאן לקבוצה של dolabralexins המהווים הן חומרים פחמימנים ו חמצון (איור 3). בהתאם למאפיינים של מוצרי היעד, תערובות ממיסים אחרים עשויים להיות יתרון. עם זאת, אין לmiscible ממיסים במים על מנת להבטיח הוצאה מוצלחת והפרדת פאזה באמצעות טכניקת המשפך הבדלנית. בנוסף, אובדן המוצר באמצעות התאיידות יש לקחת בחשבון בעת שימוש בגישה זו להפקת תרכובות אורגניות נדיף (וכדומה), כגון משקל מולקולרי נמוך מונו-ו sesqui-terpenoids ו-ווקנואידים אחרים. הפרדה כרומאטוגרפית של דיטרפננואידים של רמות שונות של חמצון באמצעות בקנה מידה גדול יותר (~ 2 L) בטור סיליקה היה יתרון על הניסיון שלנו, שכן הוא מספק הפרדה מוצר משופר וממזער את הצורך טיהור איטרטיבי שלבים בעת שימוש באמצעי אחסון קטנים יותר של עמודות. ניתן לכוונן אמצעי אחסון ומטריצות של עמודות לפי הצורך עבור אמצעי האחסון הרצוי לתרבות ולסוג המוצר הטבעי. הטוהר של מוצרי היעד, כי ניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה מתאים ליישומים רבים במורד הזרם, כגון בחני פעילות ביולוגית או לשימוש ניתוחים אנזימים הפעילות. עם זאת, כאשר רמות טוהר גבוהות יותר נדרשים, כגון ניתוחים מבניים באמצעות NMR, טוהר המוצר יכול להיות משופר ביעילות על ידי טיהור נוסף באמצעות (חצי)-הייצור הניתנים.

פרוטוקול זה תיאר כאן כבר אופטימיזציה לייצור מוצרים טבעיים diterpenoid, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות הקשורים מונו-, sesqui-ו tri-terpenoid, כמו גם מחלקות מוצרים טבעיים אחרים פשוט על ידי יצירת האנזים הרצוי מודולים עבור קומבינטורית ביטוי14,57. עם זאת, שינויים של ההליכים להפקת מוצר וטיהור חייב להילקח בחשבון עבור תרכובות עם תנודתיות גבוהה יותר, כגון מונו ו sesqui-terpenoids, או קוטביות גבוהה שינוי פונקציונלי כפי שניתן למשל גליקוזילציה של טריטרפננואידים רבים, פנילפרופננואידים, ושיעורי מוצרים טבעיים אחרים.

למרות פלטפורמות בקנה מידה תעשייתי לייצור מוצרים טבעיים זמינים, הפרוטוקולים המתוארים כאן מציעים זול, כלי להתאמה אישית שניתן להגדיר בקלות ברוב המעבדות. כפי שמתואר על ידי ייצור של תירס dolabralexins כאן ובמקומות אחרים39, כמויות המוצר וטוהר כי ניתן להשיג באמצעות גישה זו מספיקים בדרך כלל כדי להקל על ניתוח שונים במורד הזרם ושימושים, כולל, אבל לא מוגבל, למחקרים ביולוגיים שונים, ניתוח של אינטראקציות בין אורגניזמים, כמו גם לשימוש כמו מצעים אנזימים או כחומר התחלתי עבור הגישות למחצה סינתזה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בהכרת ד ר ראובן פיטרס (אוניברסיטת איווה סטייט, ארה ב) למתן מבנים pIRS ו pGGxZmAN2. תמיכה פיננסית עבור עבודה זו על ידי NSF צמח-ביוטי אינטראקציות התוכנית (גרנט 1758976 כדי P.Z.), DOE מוקדם מחקר הקריירה התוכנית (גרנט DE-SC0019178 P.Z.), DOE משותף הגנום מכון הקהילה המדע (גרנט CSP2568 ל P.Z.), NSF מלגת מחקר מוסמכים (ל-K.M.M.), ומלגת פרס מנטורה של אוניברסיטת דיוויס (ל-K.M.M.) מוכרת בהכרת תודה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1020 מגשיםחממה MegastoreCN-FLHD
2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפוניתSigmaM8250-500gMES
4 "Tech Square PotMcConkey סיטונאי אספקת מגדלJMCTS4
5977 חולץ XL MS
GC
Sigma271004
AgarFisherBP1423-2
תמצית שמרים חיידקייםFisherBP9727-2
CTechGlassBK-2001-015B
מכסה, בורג כחול 9 מ"מ, PFTEAgilent5185-5820GC פקק בקבוקון
קרבניציליןGenesee25-532פחמימות
כלורמפניקולפישר50247423
כלור כרומטוגרפיה עמודCTechGlassCL-0015-022
כיפת לחות ברורהחממהMegastore CN-DOME
ColiRollers חרוזי ציפויSigma71013חרוזי זכוכית
CoorsTek מרגמות חרסינהפישר12-961Aמרגמה
CoorsTek פורצלן עליפישר12-961-5Aעלי
דלתא-אמינולוולינית חומצה הידרוכלורידסיגמא50981039חומצה אמינובולינית
אתנולפישרA962-4EtOH
אתיל אצטטפישרE1454
פלקון 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפישר14-432-22צינורות פלקון
פישרברנד חד פעמי קובטפישר14-955-127קובטה
פישרברנד פטרי כלים עם מכסה ברורפישרFB0875713צלחת פטרי
פישרברנד פוליפרופילן מיקרו צינורות אחסוןפישר05-541מתלה מיקרו
צינורות גלוקוזסיגמאG7021
גליצרולפישר G33-500
הקסנספישרH292-4 (CS)
HP-5MSAgilent19091S-433מתאם כניסת עמודה
GC CTechGlassAD-0006-003מתאם כניסת זכוכית
איזופרופיל & beta;-D-1-thiogalactopyranosideפישרBP1755-100IPTG
KanamycinFisherBP9065Kan
KIM-KAP כובעים, חד פעמי, פוליפרופילן, קימבל צ'ייסVWR60825-798מכסי מבחנה נושמים
מגנזיום כלורידאקרוס223210010MgCl2
מגנזיום סולפטסיגמאM7506-500gMgSO4
Miracle-Gro מסיס במים לכל מטרה מזון צמחיMiracle-Gro2756810
מיקסר טחנת MM 200Retsch20.746.0001רקמה טחנה
Nalgene Fernbach תרביתבקבוק SigmaZ3602362.8 ליטר בקבוק
ניו ברונסוויק I26EppendorfM1324-0000חממת טלטול
Nicotiana benthamiana seedUSDA Germplasm RepositoryAccession TW16N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) תאים מוכשרים כימיתLucigen60442תאי C41-DE3
סרט עטיפה Parafilm MFisherS37440Parafilm
אשלגן כלוריSigmaP-9541KCl
אשלגן פוספט דו-בסיסי נטול מיםFisherP288-3דיפוטסיום פוספט
אשלגן פוספט מונו-בסיסימונופוטסיום פוספט
צינורות תרבית חד פעמיים Pyrex, CLS9944516 סיגמא ללא שולייםמבחנות
חומצה פירובט נתרן מלחפישר501368477מעמדי טבעת רטרט נתרן פירובט
CTechGlassST00מעמד טבעת
ריבופלביןאמרסקו0744-250 גרם
ריפמפיציןסיגמאR7382ריף
רוטובאפ
חול, 50-70 גודל חלקיקי רשתסיגמא274739-1 ק"ג
סיליקהפישרAC241660010סיליקה ג'ל
נתרן כלוריפישר5271-3NaCl
סודום הידרוקסידפישרSS266-1NaOH
ספקטינומיציןפישר501368607מפרט
Squibb משפך הפרדהCTechGlassFN-1060-006משפך הפרדה
Sunshine Mix #1Sungro גננותעציצים אדמה
תרמו מדעי הצמד כובע נמוך שימור צינורות מיקרוצנטריפוגהפישר21-402-902מיקרו-צינור
משפך משולשCTechGlassFN-0035משפך
טריפטוןפישרBP14212
בקבוקון, בורג, 2 מ"ל, ענבר, WrtOnAgilent5182-0716בקבוקון GC
גלוי ספקטרופוטומטר, V-1200VWR634-6000Pספקטרופוטומטר
ZORBAX Eclipse XDB-C18Agilent990967-202עמודת HPLC
ZORBAX Eclipse XDB-CNAgilent990967-905עמודת HPLC
Agilent-7890B Agilent-Acetonitrile

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128(2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006(2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426(2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001(2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46(2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290(2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255(2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114(2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24(2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647(2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPLC preparativeEscherichia coliNicotiana benthamianaP450

מאמרים קשורים