פעילות נוקלאז שונה היתה קשורה לתנאים אנושיים שונים, המשמש כבסיס הפוטנציאל שלה כמו סמנים. מודולרי וקל ליישם את מתודולוגיית ההקרנה הציג בנייר זה מאפשר את הבחירה של חומצות גרעין ספציפיים בדיקה לרתימת פעילות נוקלאז כמו סמנים של מחלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הנוקלאוסים הם מעמד של אנזימים הנשברים חומצות גרעין על ידי מזרז את ההידרוליזה של איגרות הזרחן המקשרות בין סוכרים מריבוז. הנוקלאוטיות מציגות מגוון תפקידים פיזיולוגיים חיוניים באורגניזמים prokaryotic ו איקריוטית, החל לשמור על יציבות הגנום כדי לספק הגנה מפני פתוגנים. השתנה פעילות נוקלאז כבר שויך עם מספר תנאים פתולוגיים כולל זיהומים חיידקיים וסרטן. למטרה זו, פעילות נוקלאז הראתה פוטנציאל גדול להיות מנוצלת כמו סמנים ספציפיים. עם זאת, שיטת סינון איתנה המבוססת על פעילות זו נותרה רצויה מאוד.
בזאת, אנו מציגים שיטה המאפשרת הקרנה לפעילות נוקלאז באמצעות חומצות גרעין בדיקה כמו מצעים, עם היקף ההבחנה בין תנאים פתולוגיים ובריאים. שיטה זו מציעה את האפשרות לעצב ספריות בדיקה חדשות, עם הגדלת הספציפיות, באופן איטרטיבי. כך, סיבובים מרובים של הקרנה נחוצים כדי לחדד את עיצוב הבדיקות עם תכונות משופרות, ניצול הזמינות של חומצות גרעין כימית שונה. הפוטנציאל הניכר של הטכנולוגיה המוצעת טמון בגמישות שלה, ביכולת הגבוהה ביותר, ורב-תכליתיות עבור הקרנת פעילות נוקלאז הקשורה לתנאי מחלה. צפוי כי טכנולוגיה זו תאפשר פיתוח של כלי אבחון מבטיח עם פוטנציאל גדול במרפאה.
מבוא
הנוקלאוסים הם מחלקה של אנזימים המסוגלים לעזוב את איגרות הזרחן היוצרות את המבנה העמוד השדרה של מולקולות חומצות גרעין. הגיוון העצום של הנוקלאוסים הופך את הסיווג שלהם לקשה למדי. עם זאת, ישנם מספר קריטריונים נפוצים המשמשים לתיאור נוקלאוסים, כגון העדפה מצע (חומצה deoxyribonucleic (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA)), אתר המחשוף (לאנונוקלאוסים או אקסקליסים), או תלות יון מתכת, בין השאר1. הנוקלאוסים הם בעלי שימור מאוד אנזימים קטליטי שיש להם תפקידים בסיסיים הן, prokaryotic ואורגניזמים איקריוטית ושימשו, ולהמשיך לשמש, כמו כלים לעריכת גנים2. הם גם שחקנים בסיסיים בתחזוקת DNA ושכפול, עוזר לשמור על יציבות הגנום והשתתפות בתהליכי קריאה-הוכח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. העיצוב וההכנה של הספרייה לאוסיונומן
- עיצוב ספריה
- בהתבסס על הקריטריונים הבאים לעצב ספרייה של פלורסנט המאובתים בדיקה בדיקה בין 8 ו 12-מר ארוך כדי למנוע היווצרות מבנה משני, עם אורך שווה עבור כל הבדיקות.
- כלול לפחות דנ א אחד ורצף RNA אחד אקראי המכיל שילוב של אדנין (א), גואנין (G), ציטוסין (C) ו תימין (T)/uracil (U) (ה-DNA ו-RNA בדיקות בטבלה 1).
הערה: ה-DNA ו רצפי RNA המתוארים בטבלה 1 היו שימושיים כמו מצעים הראשונית לסיווג סוג לא ידוע של פעילות נוקלאז, או dnase או rnase. שני רצפים אלה מומלצים כנקודת המוצא עבור כל הקרנה, כפי שהם הראו יכולת רחבה כדי לזהות הפרופילים של פעילות נוקלאז בחיידקים ודגימות רקמות. אם הפע....
- כלול לפחות דנ א אחד ורצף RNA אחד אקראי המכיל שילוב של אדנין (א), גואנין (G), ציטוסין (C) ו תימין (T)/uracil (U) (ה-DNA ו-RNA בדיקות בטבלה 1).
- בהתבסס על הקריטריונים הבאים לעצב ספרייה של פלורסנט המאובתים בדיקה בדיקה בין 8 ו 12-מר ארוך כדי למנוע היווצרות מבנה משני, עם אורך שווה עבור כל הבדיקות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג את זרימת העבודה של מתודולוגיה זו, אשר מחולקת לשני סיבובים הקרנה. בסיבוב הראשון של ההקרנה, השתמשנו 5 בדיקות DNA (DNA, ה-dna פולי, DNA פולי, dna פולי ו-DNA פולי G) וכן גם 5 בדיקות RNA (RNA, RNA פולי A, RNA פולי rna ו-rna פולי). את הנתונים הגולמיים של סיבוב ההקרנה ניתן למצוא בטבלה השלמה 1. בסיבוב השני, בדיקה כימית שונה היו מסונתז על ידי החלפת רצף ה-RNA עם נוקלאוטידים ששונו כימית (כל 2 '-Fluoro וכל 2 '-OMethyl) או על ידי שילוב של RNA ו purines או pyrimidines כימית שו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שינויים של פעילות נוקלאז היו קשורים עם מגוון רחב של פנוטיפים למחלות, כולל סוגים שונים של סרטן וזיהומים חיידקיים. שינויים אלה מוצעים להיות סוכן סיבתי של מצב14, ואילו במקרים אחרים הם תוצאה של האירוע הפיזיולוגי המזיק20 או סוכן פתוגניים16,26. לא באופן מפתיע, ניסיונות להשתמש בנוקלאוסים ובפעילות נוקלאז כפי שתוארה ביואריקר אבחון15,22,23.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים רוצים להכיר בלוסה הרננדז (אוניברסיטת ליניפינג) על התיקון הקפדני של כתב היד והעצות החשובות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן קנוט ואליס ולנברג ובאזור המחקר האסטרטגי של הממשלה השבדית במדעי החומרים על חומרים פונקציונליים מתקדמים באוניברסיטת Linköping (גרנט הפקולטה SFO-Mat-ליו No. 2009-00971).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תחתית שחורה, לא מטופלת 96 צלחת באר | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| צינורות Eppendorf | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| בקבוקון אחסון קריוגני Microbank המכיל חרוזים | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| בדיקות חומצות גרעין | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline המכיל MgCl2 ו-CaCl2 | Gibco™ | ||
| סלמונלה אנטריקה. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| טריפטון סויה אגר עם דם כבשים דפיברין | תרמו פישר סיינטיפיק | 10362223 | |
| מרק סויה טריפטי | סיגמא אולדריץ' | 22092 |
מקורות
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911(2018).
- Mason, P. A., Cox,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
