הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60019

⸱

29 ביולי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ' טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.

תקציר

ב המיטו, כמה תעתיקים של מדינה יציבה יש 5 ' טריפוספט נגזר תעתיק שעתוק (התעתיקים העיקריים), בעוד האחרים מכילים 5 ' monophosphate שנוצרו לאחר ההמרה (תעתיקים מעובד). כדי להפלות בין שני סוגי התעתיקים, פותחו מספר אסטרטגיות, ורובן תלויות בנוכחות/העדר של 5 טריפוספט. עם זאת, טריפוספט ב 5 ' termini העיקרי הוא לא יציב, והיא מעכבת אפליה ברורה של שני סוגים של תעתיקים. כדי להבדיל באופן שיטתי ולמפות את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מספק תירס המיטו, פיתחנו מעגלי RT-PCR (cRT-PCR) מבוססי אסטרטגיה על ידי שילוב cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהופטואז טיפול, כמותי הכתם הצפוני (RT-qPCR). כשיפור, אסטרטגיה זו כוללת צעד נורמליזציה של RNA כדי למזער את ההשפעה של 5 ' טריפוספט לא יציב.

בפרוטוקול זה, רנ א מיטוכונדריאלי מועשר מטופל מראש על ידי RNA 5 ' פוליפהוספטאז, אשר ממיר 5 ' triphsophate נאה monophosphate. לאחר שעתוק מעגלי ותמלול הפוכה, שני הcdnas הנגזרים מ-5 ' פוליפהוספטאז ' והוא לא מטופל, הם מנורמתים על-ידי ממגורות של תירס 26S בוגרת rRNA, שהיא בעלת מעבד 5 מעובד ואינה רגישה לתוך 5 ' פוליפהוספטאז. לאחר הנורמליזציה, התעתיקים הראשוניים והמעובדים מפלים בהשוואת מוצרי cRT-PCR ו-RT-qPCR המתקבלים מתוך RNAs המטופל ושאינו מטופל. התמליל נקבע על ידי שיבוט ורצף של מוצרי cRT-PCR, ולאחר מכן מאומת על ידי הכתם הצפוני.

על ידי שימוש באסטרטגיה זו, רוב התעתיקים של המצב היציב ביותר של תירס מיטוכונטרלון נקבעו. בשל דפוס התעתיק המסובך של כמה גנים מיטוכונדריאלי, לא הובחנו ו/או מופו מספר תעתיקים של מצבים יציבים, למרות שזוהו בכתם הצפוני. אנחנו לא בטוחים אם אסטרטגיה זו מתאימה להפלות ולמפות את התעתיקים של המצב היציב במיטוהצמחים או בפלסטלינה.

מבוא

במפעל המיטומטר, rnas רבים מבוגרים ומקודחים נצברים כמו מספר isoforms, ואת התעתיקים של מצב יציב ניתן לחלק לשתי קבוצות מבוסס על ההבדל ב 5 ' הקצוות שלהם1,2,3, ד. התעתיקים העיקריים יש 5 ' טריפוספט קצוות, אשר נגזר שעתוק חניכה. לעומת זאת, לתעתיקים המעובדים יש 5 ' monophosphate שנוצרו על-ידי עיבוד פוסט-טרנססקריפט. אפליה ומיפוי של שני הסוגים של התעתיקים חשובים כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תעתיק וההבשלה של תעתיק.

כדי להבחין בין התעתיקים העיקריים והמעובדים במפעל המיטומטר, פותחו ארבע אסטרטגיות עיקריות. האסטרטגיה הראשונה היא לטפל מראש עם rnas מיטוכונדריאלי עם חומצת טבק פירופוספאטאז (ברז), אשר ממיר 5 ' טריפוספט כדי monophosphate ומאפשר התעתיקים העיקריים להיות מעגלי על ידי RNA ligase. התעתיק מריקודי ה-RNA שטופלו בסטפס ושאינם מטופלים מושווים באמצעות הגברה מהירה של קצוות cdna (מרוץ) או מעגלי RT-pcr (cRT-pcr)2,3,4. באסטרטגיה השנייה, התעתיקים המעובדים הם ראשית לרוקן rnas מיטוכונדריאלי באמצעות שליחות קטלנית 5 '-פוספט תלוי-החכירה (TEX), ואת התעתיקים העיקריים שמאל ממופים מכן על ידי פריימר הארכה ניתוח5,6 . האסטרטגיה השלישית היא טרום המכסה את התעתיקים העיקריים באמצעות guanylyl transferase, ולאחר מכן את המיקום של triphosphated 5 ' termini נקבע על ידי פריימר הארכה יחד עם ריבונוקלאז או S1 הגנה ההגנה מפני שכירות7,8 ,9. שונה מאלה בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט, האסטרטגיה הרביעית משלבת בתמלול מחוץ למבחנה, מוטזיס מונחה אתרים וניתוח הארכה כדי לאפיין את היזמים ולקבוע את התמלול . מקומות החניכה8,10,11 על-ידי שימוש באסטרטגיות אלה, תעתיקים ראשוניים ומעובדים רבים נקבעו ב המיטו, הצמח.

עם זאת, מספר מחקרים דיווחו כי 5 ' הטריפוספט של התעתיקים העיקריים היו יציבים, והם הומרו בקלות monophosphate מסיבה לא ידוע2,4,12,13. בעיה זו מעכבת אפליה ברורה של שני סוגי התעתיקים באמצעות טכניקות בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט, ומאמצים קודמים להפלות באופן שיטתי בין התעתיקים הראשוניים והמעובדים במפעל מיטוכונמיטוa נכשל2,12.

בפרוטוקול זה, אנו משלבים cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז הטיפול, RT-qPCR, והצפוני כתם כדי להבדיל באופן שיטתי את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מאוד תירס (Zea מייז) המיטורציה (איור 1). cRT-PCR מאפשר מיפוי סימולטני של 5 ' ו-3 ' הגפיים של מולקולת RNA, והוא מותאם בדרך כלל למפות את המפה לתוך מפעלים2,12,14,15. רנ א 5 ' פוליפהוספטאז יכול להסיר שני פוספטים מן triphosphated 5 ' termini, מה שהופך את התעתיקים העיקריים זמין לצורך הפצה עצמית על ידי RNA ligase. מחקרים קודמים הראו כי 26 בוגרים rrna ב תירס עיבד 5 ' הטרמינוס, וזה היה חסר רגישות RNA 5 ' פוליפהוספטאז1,16. כדי למזער את ההשפעה של טריפוספט יציב בראשית 5 ' termini, the 5 ' פוליפהוספטאז-טיפל ושאינם מטופלים rnas הם מנורמל על ידי rrna בוגרת, ואת התעתיקים העיקרי ומעובד הם הבדיל מכן על ידי השוואת ה מוצרי cRT-PCR המתקבלים משתי דגימות ה-RNA. המיפוי של ה-cRT-PCR ותוצאות האפליה מאומתים על-ידי הכתם הצפוני ו-RT-qPCR, בהתאמה. בסופו של דבר, משתמשים בצבעי יסוד חלופיים כדי להגביר את התעתיקים שאותרו באבן החשופה בצפון, אך לא באמצעות cRT-PCR. על-ידי שימוש באסטרטגיה זו מבוססת cRT-PCR, התעתיקים הקבועים ביותר במיטוכונטריום בתירס הובלו ומופו1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פריימר עיצוב

  1. עיצוב בצבעי יסוד ספציפיים לשימוש בתעתיק הפוך (RT) באמצעות תוכנת עיצוב PCR (טבלת חומרים) המבוססת על הכללים הכלליים של העיצוב הכללי17.
    הערה: RT התחל הם ספציפיים מאוד את התעתיקים היעד, והם מעוגנים בדרך כלל על 5 ' החלק של רצפי קידוד (mRNAs מבוגרים ו RNAs מקודמן), או ~ 500 – 600 nt במורד של הצפוי 5 ' סוף (18S ו-26S rRNAs).
  2. להגביר את התעתיקים המפוצלים. של הדגם cRT-PCR
    הערה: התחל המיועד לזווג את הצומת 5 ' -3 של התעתיקים המעגליות, ומיקומם משתנה בין התעתיקים של המטרה שנותחו (איור S1). לחלק מתעתיקים יש UTRs ארוכים; לדוגמה, nad2-1 5 ' utr ו- rps4-1 3 ' utr הם 1,985 ו-1826/1834, בהתאמה1. יהיה קשה להגביר את. התעתיקים של המטרה לעומת זאת, כמה UTRs הם קצרים; לדוגמה, 3 ' UTRs של nad2-1 ו- nad4-1 הם 34/35 ו -29 – 31 nt, בהתאמה1. אם התחל הזווג ממוקם הרחק מרצפי הקידוד, ה-PCR ייכשל. באופן כללי, שני זוגות של תחל מפוצלים מיועדים עבור כל תעתיקים של יעד, בעוד זוגות מרובים עשויים להיות נחוצים כדי למפות את אלה שדפוסי התעתיק שלהם הם מסובכים ו/או UTRs הם ארוכים מאוד.
  3. עיצוב זוגות של התחל מתכנסת כדי להכין בדים של RNA עבור הכתם הצפוני.
    הערה: התחל לזווג ממוקמים על אזור קידוד של הגן היעד, ואת גודל המוצר PCR צריך להיות בטווח של 100 כדי 1,000 bp. כל פריימר קדימה צריך להכיל אתר אנזים הגבלה כדי למזער רצפים וקטוריים בבדיקות שהתקבל.

2. הכנת מיטוכונמיטו, מ תירס פיתוח גרעינים

  1. לחטא את הקוצים, מרגמות, זכוכית funnels, צינורות, וטיפים על ידי החיטוי, ולייבש אותם בתנור.
  2. בצע את כל ההליכים ב-4 ° צ' או על הקרח, ולפני הגניבה כל הפתרונות.
  3. להכין 100 mL של מאגר החילוץ (EB), מורכב 0.3 M סוכרוז, 5 מ"מ הטטרפוספט מילימטר, 10 מ"מ KH2PO4, 2 מ"מ edta, 1% [w/v] polyvinylפירוסיים 40, 1% [w/v] הסרום הבקר, 5 מ"מ L-cysteine, ו 20 מ"מ חומצה אסקורבית. להתאים ל-pH 7.3 עם KOH ולעקר על ידי סינון.
  4. להכין 100 mL של מאגר לשטוף (WB) המורכב 0.3 M סוכרוז, 1 מ"מ EGTA, ו 10 מ"מ מנקה (3-(N-שורגואולנו) חומצה propanesulfonic). להתאים ל-pH 7.2 עם NaOH ולעקר על ידי סינון.
    הערה: היא הציעה להכין EB ו-WB באמצעות DEPC מטופלים התייחס H2O.
  5. לאסוף 20 g לפתח גרעינים ב 11 – 20 ימים לאחר האבקה (DAP) כדי שפופרת 50-mL ממוקם על הקרח, ולאחר מכן להעביר את הגרעינים כדי מקורר מקורלים.
    הערה: השתמש ביחס של 100 mL של EB כדי 20 גרם של גרעינים תירס.
  6. הוסיפו 10 – 20 מ ל לחומר מליטה, וטוחנים את הגרעינים לחלוטין.
  7. להוסיף EB, ולסנן את רקמות הקרקע דרך שתי שכבות של בד סינון (טבלת חומרים).
  8. צנטריפוגה את פילטרט ב 8,000 x g עבור 10 דקות, ולמחוק את הגלולה.
  9. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש, וצנטריפוגה אותו ב 20,000 x g עבור 10 דקות.
  10. שפוך את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-6 מ ל WB.
  11. מחלקים את ההשעיה לחמש 1.5 mL RNase-שפופרות חינם, ו צנטריפוגה אותם ב 14,000 x g עבור 5 דקות.
  12. השמט את הסופרנטאנט, הקפא את הגלולה היטוכונדריטית בחנקן נוזלי, ואחסן ב-80 ° c.

3. הוצאת רנ א מיטוכונדריאלי

  1. לחלץ RNA מיטוכונדריאלי עם מגיב מסחרי (טבלת חומרים) על פי הוראות הייצור.
    זהירות: מגיב זה מכיל פנול ו guanidine isothiocyanate. , תעבוד עם זה בתוך מכסה המנוע. ותלבש חלוק וכפפות מעבדה
  2. לפזר את ה-RNA מיטוכונדריאלי מבודד ב-DEPC, שטופלו ב-H2O, ולאמוד ריכוז RNA וטוהר עם ספקטרוסקופיה (שולחן חומרים).
    הערה: באופן כללי, ~ 250 μg RNA מיטוכונדריאלי מתקבל מ-20 גר' גרעינים של 15-DAP תירס.
  3. הכינו ג'ל אחד מורכב של 1 x טה מאגר (40 mM טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית, 1X EDTA), 1.5% agarose (טבלת חומרים), ו-1x צבע גרעיני מכתים (טבלת חומרים).
  4. הוסף נפח מתאים של מאגר טעינת 10x (0.5% ברומאופנול כחול, 0.5% קסילן FF, ו 50% גליצרול), ו טען מיטוכונדרימי RNA/טעינת מאגר העמסה ב 1.5% agarose ג'ל.
  5. הפעל את ג'ל ב 1 x טה מאגר ב 5 – 6 V/cm עבור 20 – 25 דקות, ולהעריך את שלמות RNA מיטוכונדריאלי על ידי דימות ג'ל עם מערכת התיעוד ג'ל (טבלת חומרים).
    הערה: הנוכחות של שתי להקות נפרדות (~ 3,510 ו-~ 1,970 nt עבור תירס מיטוכונדריאלי 26S ו 18S rRNAs, בהתאמה) הוא תקן מקובל עבור RNA מיטוכונדריאלי שלם. כדי לא לכלול השפלה אפשרית, שלמות RNA יש לחקור במהלך השלבים המרובים של הכנה מעגלי RNA (איור 2).

4. רנ א 5 ' פוליפהוספטאז טיפול

  1. הגדר את ה-RNA 5 ' פוליפהוספטאז (טבלה וחומרים) טיפול (שולחן 1), ו דגירה ב 37 ° c עבור 30 – 60 דקות.
  2. לשחזר את 5 ' פוליפהוספטאז התייחסו RNA עם ערכת טיהור RNA (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
  3. חזור על שלבים 3.3 עד 3.5.

5. רנ א הסיקולריזציה

  1. הכינו שתי תגובות מעגליות תוך שימוש באותם כמויות של 5 ' פוליפהוספטאז-שטופלו ומיטוכונדריאלי שאינם מטופלים (שולחן 2), ו דגירה שתי התגובות ב 16 ° c עבור 12-16 h.
  2. שחזר את שתי הערכות של RNAs באופן עצמאי באמצעות אותה ערכה כמו בשלב 4.2.
    הערה: יצוין כי רק חלקיק של RNA מיטוכונדריאלי יהיה עצמית ליגולי, ו-RNA התאושש יהיה תערובת של תעתיקים ליניארי ומעגליות.
  3. חזור על שלבים 3.3 עד 3.5.

6. תמלול הפוכה

  1. סנתז שני סטים של cDNAs מאותם כמויות של 5 ' פוליפהוספטאז שטופלו ולא מטופלים RNAs (200 ng).
  2. הכינו את התערובת על ידי הוספת יחס שווה של 26S-CRT ועד 7 התחל של שונים.
    הערה: הריכוז הסופי של התערובת התחל. צריך להיות 1 μM
  3. הכינו שני תערובות מראש על ידי שילוב הריאגנטים המפורטים בטבלה 3, הדגירה ב 65 ° c עבור 5 דקות, ולאחר מכן להירגע על קרח עבור 2 דקות.
  4. להרכיב שתי מערכות התגובה RT (שולחן 4), ו הדגירה אותם ב 42 ° צ' עבור 50 דקות.
  5. החום הן תגובות RT ב 70 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן לצנן אותם על קרח.

7. נורמליזציה

  1. הכינו שתי תגובות PCR על ידי הוספת אותו נפח של התבנית cDNAs שנגזר 5 ' פוליפהוספטאז-מטופלים או RNAs שאינם מטופלים, מפוצלים בתוך מבנה של 5 '-3 ' הצומת של מעגלי 26S rRNA (כלומר 26S-CF1 ו-CR1), וכו ' (טבלה 5).
  2. הפעל את שתי התגובות בציקלנר תרמי (טבלת חומרים) בתנאים המתוארים בטבלה 6.
  3. הכינו ג'ל אחד שמורכב מ-1 x מאגר טה, 1.0% agarose, ו-1x צבע גרעיני מכתים.
  4. הוסף 2 μl 10x טעינת המאגר (0.5% ברומאופנול כחול, 0.5% קסילן FF, ו 50% גליצרול) לכל אחד משני מוצרי ה-PCR, ולטעון אותם על ג'ל.
  5. הפעל את ג'ל ב-1 x טה מאגר ב 5 – 6 V/cm עבור 30-40 דקות, והתמונה היא באמצעות מערכת התיעוד ג'ל אותו כמו שלב 3.5.
  6. השווה את השפע של שני מוצרי ה-PCR באמצעות תוכנת מחשב (טבלת חומרים, איור 4a) ומיטוב הנורמליזציה על-ידי שינוי כמויות ה-cdnas של תבניות במידת הצורך.

8. הגברה של הPCR

  1. הכינו זוגות של תגובות ה-PCR על-ידי הוספת נפח מתאים של cDNAs מנורמל וזוג משני האגפים המפוצלים של 5 ' -3 ' של התעתיקים של היעד (שולחן 7).
    הערה: כמות התבניות של cDNAs המשמשת להגברה של ה-PCR של תעתיקים של היעד נקבעת על-ידי תוצאות הנורמליזציה של 26 rRNA.
  2. בצע את תגובות ה-PCR לפי התוכנית המתוארת בטבלה 8.
  3. חזור על שלבים 7.3 עד 7.5.
  4. שנה לצבעי ההתחלה המפוצלים ואמת את התוצאות העגולות של ה-PCR על-ידי שלבים חוזרים 8.1 ו-8.2.
  5. חזור על שלבים 7.3 עד 7.5.
  6. לשחזר את הלהקות הבולטות שניתן לחזור בשני סיבובים של הגברה PCR באמצעות ערכת ה-DNA ג'ל התאוששות (לוח חומרים).

9. קביעת תעתיק טרמיני

  1. שיבוט מוצרי ה-PCR מטוהרים לתוך וקטור בוטה-סוף (טבלת חומרים) באמצעות טכניקות סטנדרטיות.
  2. לבצע את ה-PCR המושבה כדי לבחור שכפולים חיוביים המכילים את מוסיף היעד, ולסדר אותם באופן מסחרי.
    הערה: שיבוטים חיוביים המכילים מוסיף עם גודל משתנה מזוהים בדרך כלל מלהקה אחת התאושש בגלל הרבה המדינה יציבה התעתיקים של מיטוכונדריאלי צמח הטרוגנית 5 ' ו/או 3 ' מסתיים1,12.
  3. יישר את הנתונים ברצף עם גנום מיטוכונדריאלי באמצעות היישור המקומי הבסיסי כלי חיפוש (הפיצוץ) של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI). בחר אורגניזם "תירס (מטקת: 4577)", וחפש במאגר המידע "אוסף נוקלאוטיד (nr/nt)".
  4. מצא את הצומת 5 ' 3 ' של תעתיק מעגלי, וקבע את מיקומם של 5 ' ו-3 ' תעתיק termini.
  5. לחשב את הגודל של התעתיקים היעד.

10. אימות התוצאות של מיפוי ה-cRT-PCR על-ידי כתמי היברידיזציה

הערה: רנ א ג'ל אבן היברידיזציה מבוצעת באמצעות ערכה מסחרית (טבלה של חומרים), אשר מכיל את הריאגנטים עבור תמלול-תיוג של RNA עם digoxigenin (לחפור) ו T7 RNA פולימראז, היברידיזציה, וזיהוי חיסולוגי. נא עיין בפרוטוקולים המסופקים בערכה זו לקבלת פרטים נוספים. ודא שרק RNase ציוד חופשי משמש עבור ההליך כולו.

  1. הגבר את קטע ה-DNA המשמש להכנת בדיקה RNA, ושיבוט אותו לאותו וקטור כמו בשלב 9.1, אשר מכיל את היזם T7 17 bp במעלה הזרם של אתר הכניסה.
  2. Linearize המבנה באמצעות אנזים הגבלה נאותה, לשחזר את פלדמיד לינארי על ידי ערכת טיהור DNA (טבלה של חומרים), ולפזר אותו ב-depc התייחס H2O.
  3. תווית RNA בדים עם לחפור -11-UTP על ידי ערכת מסחרית (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
  4. להכין 500 mL של מאגר מגבים 10x (0.2 M מגבים, 50 mM אצטט נתרן, ו 10 מ"מ EDTA) באמצעות DEPC מטופל H2O. התאם ל-pH 7.0 על ידי naoh, ולעקר על ידי סינון.
  5. הוסף 2 – 3 כרכים של העמסה מאגר (50% הטופס1, 6.2% פורמלדהיד, 1x מאגרים, 10% גליצרול, ו 0.1% ברומאופנול כחול) אל RNA מיטוכונדריאלי מוכן בשלבים 3.1 – 3.3.
  6. הספרות הראשונה לדגם RNA/טעינת מאגר ההעמסה ב-65 ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן להירגע על הקרח במשך 1 דקות.
  7. הכינו ג'ל שאינו מבוקר (2% פורמלדהיד, 1.2% agarose, ו-1x מגבים), וטען את התערובת RNA לדוגמה/טעינת מאגר לג (1 – 2 μg RNA מיטוכונדריאלי לכל טוב).
  8. הפעל את ג'ל ב-1x מגבים ב 3 – 4 V/cm עבור ~ 4 h.
  9. הכינו 2 ליטר של היחידה למען המאה ה -20 (3 מ7.0 0.3). לטפל בזה עם 0.1% DEPC לילה, ולעקר על ידי החיטוי.
  10. לשטוף את הג פעמיים ב-20x למטה (15 דקות בכל פעם), ולהעביר ג'ל RNA לקרום ניילון (טבלה של חומרים) על ידי העברת קפילר עם 20x למעלה במשך 10 – 16 h.
  11. תקן את ה-RNA לממברנה על ידי אפייה ב 120 ° c עבור 30 דקות.
  12. בצע היברידיזציה של RNA וזיהוי אימונוולוגי עם ערכת מסחרית (טבלת חומרים) לפי הוראת היצרן.

11. אפליה של מסתיים ראשי ומעובד 5

  1. להפלות את הקצוות הראשוניים והמעובדים של 5 באמצעות השוואת מוצרי cRT-PCR המתקבלים מתוך המערכת המנורמלת והבלתי-מטופלת מסוג 5 המנורמל.
    הערה: לתעתיקים העיקריים, השפע של מוצרי ה-PCR מתוך 5 ' פוליפהוספטאז-RNA מטופל הרבה יותר גבוה מאשר מעמיתו שאינו מטופל (איור 1, ' גן א, ' ואיור 4a). עם זאת, כדי לעבד את התעתיקים, רמה דומה של מוצרי PCR תהיה מוגברת משתי קבוצות של RNAs מיטוכונדריאלי (איור 1, ' ג'ין B ').
  2. . מבוסס על תוצאות מיפוי ה-cRT-PCR
  3. בדוק את תוצאות האפליה של ה-cRT-PCR על-ידי RT-qPCR.
    הערה: שני דגימות ה-Dna הנגזרות 5 ' פוליפהוספטאז, RNAs מטופלים שאינם מטופלים הם מנורמל על ידי מוצרים RT-qPCR של 26S בוגרת rRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכה של יעילות מיטוכונדריזה של RNA

במחקר קודם, שניהם RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי שימשו עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי termini ב arabidopsis (arabidopsis thaliana), ושני סוגים של rnas נתן תוצאות מיפוי דומה12. בתחילה, השתמשנו גם RNAs הכולל עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי בשנת תירס. לאחר ניסויים רבים, מצאנו את. התעתיקים של המטרה היו קשים לזיהוי כשיפור, א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר קודם, RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי מתרבות ההשעיה של התאים של Arabidopsis שימשו כדי למפות תעתיק מיטוכונדריאלי termini על ידי CRT-PCR, ותוצאות דומות הושגו12. עם זאת, רק RNA מיטוכונדריאלי מועשר שימש למיפוי תעתיק מיטוכונדריאלי טרמיני במחקרים רבים אחרים1,2,3,9. מצאנו כי העשרה של RNA מיטוכונדריאלי הוא צעד חשוב עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי בשנת תירס. לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (להעניק no. 31600250, Y.Z.), פרויקטים של מדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג'ואו (להעניק no. 201804020015, ח), ואת מערכת המחקר החקלאי סין (להעניק לא. מכוניות-04-PS09, ח).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתאלאדין, סיןA112880להכנת מאגר 1x TAE
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific, ארה"ב4359659מחזור תרמי להגברת PCR
חומצה אסקורביתSigma-aldrich, ארה"בV900134להכנת מאגר מיצוי
Biowest AgaroseBiowest, ספרד9012-36-6לפתרון PCR מוצרים ו-RNAs
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ', ארה"בA1933להכנת מאגר מיצוי
ברומופנול כחולסיגמא-אולדריך, ארה"בB8026להכנת מאגר העמסה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וכתם צפוני
DEPCסיגמא-אולדריץ', ארה"בV900882השבתה של ערכת
ההתחלה הצפוניתרוש, ארה"ב12039672910לתיוג DIG-RNA וכתם צפוני. ערכה זו מכילה את הריאגנטים לתיוג שעתוק של RNA עם DIG ו-T7 RNA פולימראז, הכלאה וזיהוי כימילומינסנטי.
EDTASigma-aldrich, ארה"בV900106להכנת מאגר מיצוי ומאגר 1x TAE
EGTASigma-aldrich, ארה"בE3889להכנת מאגר כביסה
מערכת תיעוד ג'לBio-Rad, ארה"בGel Doc XR+להדמיית ג'ל האגרוז
גליצרולסיגמא-אולדריץ', ארה"בG5516להכנת מאגר העמסה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
GoldView II (פי 5,000)Solarbio,. סיןG8142צביעת DNA
Hybond-N+, קרום ניילוןAmersham Biosciences, ארה"בRPN119עבור Northern Blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image Gel, והשווה את השפע של מוצרי PCR.
KH2PO4Sigma-aldrich, ארה"בV900041להכנת מאגר מיצוי
KOHAladdin, סיןP112284להכנת מאגר מיצוי
L-cysteineSigma-aldrich, ארה"בV900399להכנת מאגר מיצוי
MillexMillipore, ארה"בSLHP033RBלמיצוי סטרילי ו לשטוף חוצצים על ידי סינון
MiraclothCalbiochem, ארה"ב475855-1Rלסינון רקמות גרעין הקרקע
MOPSSigma-aldrich, ארה"בV900306להכנת מאגר רץ לכתם צפוני
NanoDropThermo Fisher Scientific, ארה"ב2000Cלבדיקת ריכוז וטוהר RNA
NaOHSigma-aldrich, ארה"בV900797עבור הכנת מאגר כביסה
pEASY-Blunt וקטור שיבוט פשוטTransGen Biotech, סיןCB111שיבוט של הלהקה המשוחזרת בג'ל. הוא מכיל מקדם T7 מספר bps במעלה הזרם של אתר ההחדרה.
Phanta max סופר-נאמנות DNA פולימראזVazyme, סיןP505DNA פולימראז להגברת PCR
פוליוויניל פירולידון 40סיגמא-אולדריץ', ארה"בV900008להכנת מאגר מיצוי
פריימר פרמייר 6.24PREMIER Biosoft, ארה"בפריימר פרמייר 6.24לתכנון פריימרים לשעתוק הפוך והגברת PCR
PrimeScript II טרנסקריפטאז הפוךטאקרה, יפן2690כדי לסנתז את הגדיל הראשון cDNA
PureLink RNA מיני ערכתThermo Fisher Scientific, ארה"ב12183025לטיהור RNA
5' פוליפוספטאזEpicentre, ארה"בRP8092Hלהמיר טריפוספט 5' למעכב RNase מונופוספט
ניו אינגלנד ביולאבס, בריטניהM0314מרכיב של קשירה עצמית של RNA ותגובות טיפול בפוליפוספטאז 5', והוא משמש לעיכוב הפעילות של RNase.
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ', ארה"בV900212להכנת מאגר רץ לכתם צפוני
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ', ארה"בV900058להכנת 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, ארה"ב1725202עבור RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437למעגל RNA
טטרסודיום פירופוספטסיגמא-אולדריץ', ארה"ב221368להכנת מאגר מיצוי
ערכת טיהור מידי TIANgelTiangen Biotech, סיןDP209לטיהור שברי DNA מג'ל אגרוז
טריסאלאדין, סיןT110601להכנת 1x מאגר TAE
מגיב TRIzolInvitrogen, ארה"ב15596026לחילוץ RNA מיטוכונדירלי.
ערכת טיהור DNA אוניברסליתTiangen Biotech, סיןDP214לשחזור פלסטמידים ליניאריים מתגובת העיכול של אנזים ההגבלה
קסילן ציאנול FFSigma-aldrich, ארה"בX4126להכנת מאגר טעינה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
RNase DIG

מקורות

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA 5' Polyphosphataseמיצוי RNA מיטוכונדריאליRT-PCR כמותינורת'רן בלוטמיפוי קצות התמליליםתמלילים ראשוניים מעובדיםנורמליזציה של RNAפריימרים מגוונים
דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.