Method Article

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ' טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב המיטו, כמה תעתיקים של מדינה יציבה יש 5 ' טריפוספט נגזר תעתיק שעתוק (התעתיקים העיקריים), בעוד האחרים מכילים 5 ' monophosphate שנוצרו לאחר ההמרה (תעתיקים מעובד). כדי להפלות בין שני סוגי התעתיקים, פותחו מספר אסטרטגיות, ורובן תלויות בנוכחות/העדר של 5 טריפוספט. עם זאת, טריפוספט ב 5 ' termini העיקרי הוא לא יציב, והיא מעכבת אפליה ברורה של שני סוגים של תעתיקים. כדי להבדיל באופן שיטתי ולמפות את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מספק תירס המיטו, פיתחנו מעגלי RT-PCR (cRT-PCR) מבוססי אסטרטגיה על ידי שילוב cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהופטואז טיפול, כמותי הכתם הצפוני (RT-qPCR). כשיפור, אסטרטגיה זו כוללת צעד נורמליזציה של RNA כדי למזער את ההשפעה של 5 ' טריפוספט לא יציב.

בפרוטוקול זה, רנ א מיטוכונדריאלי מועשר מטופל מראש על ידי RNA 5 ' פוליפהוספטאז, אשר ממיר 5 ' triphsophate נאה monophosphate. לאחר שעתוק מעגלי ותמלול הפוכה, שני הcdnas הנגזרים מ-5 ' פוליפהוספטאז ' והוא לא מטופל, הם מנורמתים על-ידי ממגורות של תירס 26S בוגרת rRNA, שהיא בעלת מעבד 5 מעובד ואינה רגישה לתוך 5 ' פוליפהוספטאז. לאחר הנורמליזציה, התעתיקים הראשוניים והמעובדים מפלים בהשוואת מוצרי cRT-PCR ו-RT-qPCR המתקבלים מתוך RNAs המטופל ושאינו מטופל. התמליל נקבע על ידי שיבוט ורצף של מוצרי cRT-PCR, ולאחר מכן מאומת על ידי הכתם הצפוני.

על ידי שימוש באסטרטגיה זו, רוב התעתיקים של המצב היציב ביותר של תירס מיטוכונטרלון נקבעו. בשל דפוס התעתיק המסובך של כמה גנים מיטוכונדריאלי, לא הובחנו ו/או מופו מספר תעתיקים של מצבים יציבים, למרות שזוהו בכתם הצפוני. אנחנו לא בטוחים אם אסטרטגיה זו מתאימה להפלות ולמפות את התעתיקים של המצב היציב במיטוהצמחים או בפלסטלינה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במפעל המיטומטר, rnas רבים מבוגרים ומקודחים נצברים כמו מספר isoforms, ואת התעתיקים של מצב יציב ניתן לחלק לשתי קבוצות מבוסס על ההבדל ב 5 ' הקצוות שלהם1,2,3, ד. התעתיקים העיקריים יש 5 ' טריפוספט קצוות, אשר נגזר שעתוק חניכה. לעומת זאת, לתעתיקים המעובדים יש 5 ' monophosphate שנוצרו על-ידי עיבוד פוסט-טרנססקריפט. אפליה ומיפוי של שני הסוגים של התעתיקים חשובים כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תעתיק וההבשלה של תעתיק.

כדי להבחין בין התעתיקים העיקריים והמעובדים במפעל המיטומטר, פותחו ארבע אסטרטגיות עיקריות. הא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פריימר עיצוב

  1. עיצוב בצבעי יסוד ספציפיים לשימוש בתעתיק הפוך (RT) באמצעות תוכנת עיצוב PCR (טבלת חומרים) המבוססת על הכללים הכלליים של העיצוב הכללי17.
    הערה: RT התחל הם ספציפיים מאוד את התעתיקים היעד, והם מעוגנים בדרך כלל על 5 ' החלק של רצפי קידוד (mRNAs מבוגרים ו RNAs מקודמן), או ~ 500 – 600 nt במורד של הצפוי 5 ' סוף (18S ו-26S rRNAs).
  2. להגביר את התעתיקים המפוצלים. של הדגם cRT-PCR
    הערה: התחל המיועד לזווג את הצומת 5 ' -3 של התעתיקים המעגליות, ומיקומם משתנה בין התעתיקים של המטרה שנותחו (איור S1). לחלק מתעתיקים יש UTRs ארוכים; לדוגמה, nad2-1 5 ' ut....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה של יעילות מיטוכונדריזה של RNA

במחקר קודם, שניהם RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי שימשו עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי termini ב arabidopsis (arabidopsis thaliana), ושני סוגים של rnas נתן תוצאות מיפוי דומה12. בתחילה, השתמשנו גם RNAs הכולל עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי בשנת תירס. לאחר ניסויים רבים, מצאנו את. התעתיקים של המטרה היו קשים לזיהוי כשיפור, א.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר קודם, RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי מתרבות ההשעיה של התאים של Arabidopsis שימשו כדי למפות תעתיק מיטוכונדריאלי termini על ידי CRT-PCR, ותוצאות דומות הושגו12. עם זאת, רק RNA מיטוכונדריאלי מועשר שימש למיפוי תעתיק מיטוכונדריאלי טרמיני במחקרים רבים אחרים1,2,3,9. מצאנו כי העשרה של RNA מיטוכונדריאלי הוא צעד חשוב עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי בשנת תירס. לא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (להעניק no. 31600250, Y.Z.), פרויקטים של מדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג'ואו (להעניק no. 201804020015, ח), ואת מערכת המחקר החקלאי סין (להעניק לא. מכוניות-04-PS09, ח).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה אצטיתאלאדין, סיןA112880להכנת מאגר 1x TAE
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific, ארה"ב4359659מחזור תרמי להגברת PCR
חומצה אסקורביתSigma-aldrich, ארה"בV900134להכנת מאגר מיצוי
Biowest AgaroseBiowest, ספרד9012-36-6לפתרון PCR מוצרים ו-RNAs
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ', ארה"בA1933להכנת מאגר מיצוי
ברומופנול כחולסיגמא-אולדריך, ארה"בB8026להכנת מאגר העמסה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וכתם צפוני
DEPCסיגמא-אולדריץ', ארה"בV900882השבתה של ערכת
ההתחלה הצפוניתרוש, ארה"ב12039672910לתיוג DIG-RNA וכתם צפוני. ערכה זו מכילה את הריאגנטים לתיוג שעתוק של RNA עם DIG ו-T7 RNA פולימראז, הכלאה וזיהוי כימילומינסנטי.
EDTASigma-aldrich, ארה"בV900106להכנת מאגר מיצוי ומאגר 1x TAE
EGTASigma-aldrich, ארה"בE3889להכנת מאגר כביסה
מערכת תיעוד ג'לBio-Rad, ארה"בGel Doc XR+להדמיית ג'ל האגרוז
גליצרולסיגמא-אולדריץ', ארה"בG5516להכנת מאגר העמסה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
GoldView II (פי 5,000)Solarbio,. סיןG8142צביעת DNA
Hybond-N+, קרום ניילוןAmersham Biosciences, ארה"בRPN119עבור Northern Blot
Image LabBio-Rad, USAImage Lab 3.0Image Gel, והשווה את השפע של מוצרי PCR.
KH2PO4Sigma-aldrich, ארה"בV900041להכנת מאגר מיצוי
KOHAladdin, סיןP112284להכנת מאגר מיצוי
L-cysteineSigma-aldrich, ארה"בV900399להכנת מאגר מיצוי
MillexMillipore, ארה"בSLHP033RBלמיצוי סטרילי ו לשטוף חוצצים על ידי סינון
MiraclothCalbiochem, ארה"ב475855-1Rלסינון רקמות גרעין הקרקע
MOPSSigma-aldrich, ארה"בV900306להכנת מאגר רץ לכתם צפוני
NanoDropThermo Fisher Scientific, ארה"ב2000Cלבדיקת ריכוז וטוהר RNA
NaOHSigma-aldrich, ארה"בV900797עבור הכנת מאגר כביסה
pEASY-Blunt וקטור שיבוט פשוטTransGen Biotech, סיןCB111שיבוט של הלהקה המשוחזרת בג'ל. הוא מכיל מקדם T7 מספר bps במעלה הזרם של אתר ההחדרה.
Phanta max סופר-נאמנות DNA פולימראזVazyme, סיןP505DNA פולימראז להגברת PCR
פוליוויניל פירולידון 40סיגמא-אולדריץ', ארה"בV900008להכנת מאגר מיצוי
פריימר פרמייר 6.24PREMIER Biosoft, ארה"בפריימר פרמייר 6.24לתכנון פריימרים לשעתוק הפוך והגברת PCR
PrimeScript II טרנסקריפטאז הפוךטאקרה, יפן2690כדי לסנתז את הגדיל הראשון cDNA
PureLink RNA מיני ערכתThermo Fisher Scientific, ארה"ב12183025לטיהור RNA
5' פוליפוספטאזEpicentre, ארה"בRP8092Hלהמיר טריפוספט 5' למעכב RNase מונופוספט
ניו אינגלנד ביולאבס, בריטניהM0314מרכיב של קשירה עצמית של RNA ותגובות טיפול בפוליפוספטאז 5', והוא משמש לעיכוב הפעילות של RNase.
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ', ארה"בV900212להכנת מאגר רץ לכתם צפוני
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ', ארה"בV900058להכנת 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad, ארה"ב1725202עבור RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs, UKM0437למעגל RNA
טטרסודיום פירופוספטסיגמא-אולדריץ', ארה"ב221368להכנת מאגר מיצוי
ערכת טיהור מידי TIANgelTiangen Biotech, סיןDP209לטיהור שברי DNA מג'ל אגרוז
טריסאלאדין, סיןT110601להכנת 1x מאגר TAE
מגיב TRIzolInvitrogen, ארה"ב15596026לחילוץ RNA מיטוכונדירלי.
ערכת טיהור DNA אוניברסליתTiangen Biotech, סיןDP214לשחזור פלסטמידים ליניאריים מתגובת העיכול של אנזים ההגבלה
קסילן ציאנול FFSigma-aldrich, ארה"בX4126להכנת מאגר טעינה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז
RNase DIG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular RT PCRRNA 5 PolyphosphataseMitochondrial RNA ExtractionQuantitative RT PCRNorthern BlotMaize MitochondrionTermini MappingPrimary Processed TranscriptsRNA NormalizationDivergent Primers

Related Articles