הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

6.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60043

⸱

25 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.

תקציר

הדלקת צהבת B וירוס (HBV) היא בעיה בריאותית גלובלית. עם מעל 350,000,000 אנשים מושפעים ברחבי העולם, זיהום HBV נשאר הגורם המוביל של סרטן הכבד. זוהי דאגה גדולה, במיוחד במדינות מתפתחות. כישלון של מערכת החיסון לטעון תגובה יעילה נגד HBV מוביל לזיהום כרוני. למרות חיסון HBV נוכח ותרופות אנטי ויראליות הרומן נוצרות, מיגור של תאים מאגר הווירוסים נשאר נושא בריאות מרכזי. מתוארים כאן היא שיטה עבור הדור של אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי CD8+ ציטוטוקסיים T לימפוציטים (ctls) נגזר בתאי גזע המושרה pluripotent (iPSCs) (כלומר, ipsc-ctls), אשר יש את היכולת לדכא את שכפול hbv. שכפול HBV הוא המושרה ביעילות בעכברים באמצעות הזרקה הידרודינמית של ביטוי HBV ביטויים, pAAV/HBV 1.2, לתוך הכבד. לאחר מכן, HBV לפני השטח של העכבר הספציפי Ag-iPSC-CTLs הועברו באופן מאמצים, אשר מדכא במידה ניכרת שכפול HBV בכבד ודם, כמו גם מונע ביטוי השטח HBV Ag החרופציטים. שיטה זו מדגימה שכפול HBV בעכברים לאחר הזרקת הידרודינמית והגזע הנגזר של תאים מבוססי Ag האנטי-ויראלי מאפשר לדכא שכפול HBV. פרוטוקול זה מספק שיטה שימושית לטיפול חיסוני HBV.

מבוא

בעקבות זיהום אקוטי, מערכת החיסון האדפטיבית (כלומר, חסינות מוסרית ותאית) שולטת בכמויות הכבד הקשורות ל-HBV. עדיין, מספר אנשים באזורים HBV-אנדמיים לא יכולים לחסל את וירוסים ולאחר מכן להמיר כאנשים כרוניים. יותר מ -25% של חולים כרוניים (> 250 מיליון אנשים) ברחבי העולם לפתח מחלת כבד מתקדמת, וכתוצאה מכך שחמת הכבד ו/או קרצינומה hepatocellular (HCC)1. כתוצאה מכך, מיגור של תאים נגועים בעקשנות נשאר בעיה כללית הבריאות, אף על פי שיש חיסון זמין2 ותרופות אנטי ויראליות רבים נמצאים בשלבי פיתוח. טיפול סטנדרטי עבור זיהום HBV כולל IFN-α, נוקלאוטיד, ונוקלאוטידים אנגיים. לסוכנים אלה יש פעילות אנטי-ויראלית. ישירה ומודולקקים חיסוניים עם זאת, המרה של אנטיגן HBe (Ag)+ מנשאים עם נוגדן נגד Hbe (Ab) ואובדן של סרום hbe deoxyribonucleic חומצה (DNA) להופיע בנפרד כ 20% של חולים מטופלים, ואת כל השליטה החיסונית של הנגיף אומת על ידי מניעת HBsAg הוא לא יותר 5%3. יתר על כן, התגובה לטיפול הוא לעתים קרובות לא עמיד. חיסון נגד רקומביננטי HBs Ag הוא יעיל מאוד במניעת זיהום, אבל החיסון HBs Ag טיפולית אינה יעילה. ברור, תא T בתיווך התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי בשליטה הזיהום HBV ליקוי בכבד; עם זאת, בחולים כרוניים צהבת, hbv-מגיבים תאים T נמחקים לעתים קרובות, לקוי, או להמיר4,5,6. כתוצאה מכך, אצל אנשים עם זיהום HBV מתמשך, אין ניסיונות לשחזר את החסינות הספציפית HBV (כלומר, החסינות המבוססת על תא T) באמצעות תרופה אנטי ויראלית, ציטוקינים מאפקקים, או חיסון מרפא השיגו הצלחה.

העברת תא המאמצת (פעולה) של תאים T ספציפיים של hbv Ag הוא טיפול יעיל בבימויו של בסופו של דבר לבער את הנותרים hepatocytes wih7,8. פעולה של hbv-ctls ספציפי לתוך העכברים הנגועים hbv הוכח לגרום ארעי, הפטיטיס מתון, וירידה דרמטית של חומצה hbv ריבונוקלאית (RNA) התעתיקים ב hepatocytes. במחקרים אלה, CTLs לא לעכב את שעתוק הגנים HBV אבל הגדילו את השפלה של התעתיקים HBV9. ה-CTLs הספציפי של HBV חשוב למנוע זיהום נגיפי ולתווך את הסיווג של HBV10,11. עבור תרופות מבוססות מעשה, בהרחבת מבחנה של תאים T הספציפי hbv עם פעילות מחודשת גבוהה עבור vivo החדש הוצע להיות שיטה אידיאלית12,13,14; אף על פי כן, הגישות הקיימות מוגבלות לגבי יכולותיהם להפקת, להפריד ולגדול כמויות ואיכויות המתאימות של תאים T HBV ספציפיים מחולים עבור טיפולים פוטנציאליים.

למרות ניסויים קליניים הנוכחי בטיחות, יכולת מעשית, ופעילות טיפולית פוטנציאליים של טיפולים מבוססי תאים באמצעות תאי T מהונדסים הינם ספציפיים HBV וירוס נגוע הנגיף, יש דאגות על ההשפעות שלילי המתרחשים מתוך תגובות אוטואימוניות בגלל החוצה פעילות מניעת קולטן תא T (tcr)15,16, off-היעד הכרה Ag ידי לא ספציפי tcr17 ו על-היעד off-רעילות על-ידי קולטן Ag אריק (רכב) מיכל בן 18 , 19 עם רקמות בריאות. כיום, תאי T ששונו גנטית, אשר יש רק התמדה לטווח קצר ב vivo, הם בדרך כלל ביניים או מאוחר יותר בתאי T. עד כה, בתאי גזע פלוריפוטנטי (PSCs) הם המקור היחיד הזמין להפקת מספרים גבוהים של תאי T חד-מסוגים בעלי סוג מסוים של ליחיד,20,21,22,23. המושרה PSCs (iPSCs) הם פשוט מומרים מתוך התאים הסומטיים של המטופל באמצעות שימוש התמרה גנטית של מספר גורמים שעתוק. כתוצאה מכך, iPSCs יש מאפיינים דומים כמו אלה של תאי גזע עובריים (ESCs)24. בשל הגמישות והאפשרות ליכולת אינסופית לחדש את העצמי, בנוסף להחלפת רקמות, טיפולים מבוססי iPSC עשוי להיות נרחב להחיל רפואה רגנרטיבית. יתר על כן, הגדודים הבסיסיים iPSCs עשויים לשפר באופן משמעותי את הטיפולים הנוכחיים התא.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפיק כמות גדולה של CTLs ספציפיים ל-HBV מiPSCs (כלומר, iPSC-CTLs) עבור טיפול חיסוני מבוסס-ACT. היתרונות על טכניקות חלופיות הן ש-iPSC-CTLs ספציפי ל-HBV יש מסוג TCR ופנוטיפים תמימים, שתוצאתו היא פיתוח תאים יותר של זיכרון לאחר הפעולה. הוא הוכיח כי ACT של iPSC ספציפי HBV-CTLs מגביר את הגירה של תאים CD8+ T פונקציונלי בכבד ומפחית את שכפול hbv הן בכבד והן בדם של עכברים מנוהלים. שיטה זו מגלה שימוש פוטנציאלי של אנטי ויראלי iPSC-CTLs הספציפי עבור טיפול חיסוני HBV ניתן להתאים כדי ליצור ויראלי אחרים הספציפי Ag-T תאים לטיפול חיסוני נגיפי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טקסס A & M באוניברסיטת בעלי חיים טיפול ועדת הבריאות (IACUC; #2018-0006) והם מתנהלים בהתאם להנחיות של האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה. משתמשים בעכברים בגיל 6 עד 9 שבועות.

1. הדור של CD8+ t ספציפי לiPSCs התאים הספציפיים (IPSC-CD8+ t תאים)

  1. יצירת המבנים הרטרונגיליים
    הערה: TCR α ו β גנים מקושרים עם 2A ברצף היציאה עצמית. הווקטור הרטרויראלי mscv-IRES-dsred (midr) הוא dsred+ 23.
    1. Sub-שיבוט HBs183-191 (flltrilti)-ספציפי A2-מוגבלת האדם-murine היברידית tcr (S183 tcr) גנים (vα 34 ו Vβ28) לתוך midr כדי ליצור את S183 midr לבנות (איור 1A)25.
  2. התמרה רטרונגיפית
    הערה: התאים פלטינום-E (מתחת לשמש) משמשים לאריזת כרטרוירוסים (הנושאים גנים s183 TCR), אשר ישמשו עבור התמרה רטרונגיזציה. התאים שלהם-E הם בתאי האריזה וירוס יעיל בבסיס התאים 293T, אשר פותחו באמצעות מבנים אריזה ייחודי דרך היזם EF1α לבטא חלבון מבנה retroviral יעיל, כולל מחסום, פול, ו ecotropic env.
    1. על צלחת תרבות 100 מ"מ, זרע 3 x 106 כדוריות-E ב 8 מ ל של מדיום התרבות dmem המכיל 10% סרום העוברי (fcs) בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2, 1 יום לפני התפתחות.
    2. ביום 0, העברה של s183 MiDR לבנות לתוך התאים שלהם-E באמצעות הזיהום DNA מגיב25.
    3. ביום 1, זרע 1 x 106 IPSCS (gfp+) לתוך לוחית לפני מצופה ג'לטין התרבות.
    4. בימים 2 – 3, לאסוף המכילים וירוסים-המכיל supernatant מתרבות התאים של שלישי-E כדי לשנות iPSCs עם s183 TCR בנוכחות של 1, 6-dibromohexane פתרון25.
    5. ביום 4, טריזיסיזציה s183 TCR ג'ין-התמרה iPSCs, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ו-seed 3 × 105 iPSCs בצלחת תרבות 100 מ"מ מצופה מראש עם 3 x 106 הקרינה לפני השיא SNL76/7 (irSNL76/7) המזין התאים25.
    6. ביום 5 או 6 של המפגש, טריזיסיזציה של התאים, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ותהליך עבור מיון התא. מיון על תאים חיים, למיין GFP ו-DsRED תאים כפולים-חיוביים (s183 TCR גן התמרה iPSCs) באמצעות סדרן תאים במהירות גבוהה. בדומה לשלב ה1.2.5, התרבות השיתוף משותפת לתאים הממויינים בתאי המזין irSNL76/7 לשימוש עתידי25.
  3. הבידול בתאי iPSC-CD8+ T ייחודיים של hbv
    הערה: התאים OP9-DL1/DL4 סטרומה גם הם משני החריץ DL1 ו-DL4, ושיתוף iPSCs עם הiPSCs יכול לקדם בידול תא מתווך של איתות מדרגה26.
    1. לגדול s183 TCR גנים-התמרה iPSCs (s183/iPSCs) ב OP9-DL1-DL4 תא מונאולייר ב α-בינוני חיוני מינימלי (הגברת) מדיה המכילה 20% סרום בפרה עוברית (FBS)27. כלול murine Flt3 ליגנד (mflt-3l; ריכוז סופי = 5 ng/mL) בתרבות.
    2. ביום 0, seed 0.5 – 1.0 x 105 S183/iPSCs בצלחת התרבות 10 ס"מ שגדלו בעבר עם OP9-DL1-DL4 תאים. ודא שהתאים OP9-DL1-DL4 נמצאים במצב של 80%-90% שליטה.
    3. ביום 5, לשטוף את iPSCs עם 10 מ ל של פוספט מואגור פוספטים (PBS), להוריד את ה-PBS, להוסיף את זה ל-4 מ ל 0.25% טריפסין, ו דגירה בחממה 37 ° c עבור 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 8 מ ל של מדיה iPSC לסיים את העיכול טריפסין. לצבור את כל פתרונות העיכול המכיל את התאים ואת צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 15 – 30 ° c.
    4. משף את התאים האלה ומשהה מחדש ב -10 מ ל של מדיה iPSC. העבר את ההשעיה התא לצלחת חדשה 10 ס מ פטרי ומודטה בחממה עבור 30 דקות ב 37 ° c.
    5. לאחר 30 דקות, לאסוף את המדיה iPSC המכילה את התאים צף. להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר ולחשב את מספר התא.
    6. זרעים 5 x 105 תאים בצלחת התרבות גדל בעבר OP9-DL1-DL4 תאים עם מצב של 80% – 90% confluent כמתואר בשלב 1.3.1.
      הערה: לגבי בידול תא T, כל 2 – 3 ימים, התאים הנגזרים iPSC צריך לחדש את הזרע עם שכבה טרייה של OP9-DL1-DL4 תאים.
  4. ערכה
    1. שינויים מורפולוגיים בהבחנה iPSCs
      1. צפו בתאים תחת מיקרוסקופ. בימים שונים
        הערה: ביום 5, מושבות יש מאפיינים דמוי עור, המציגות מורפולוגיה קלאסית בצורת ציר הדומה לפיברוזופי העור האנושית וצמיחה מתמשכת בתוך מבחנה. ביום 8, אשכולות עגולים קטנים של תאים מתחילים להופיע.
    2. ניתוח של הבחנה iPSCs על ידי הטקימטריה של זרימה
      1. בימים שונים של תרבות שיתוף, לנתח תאים שנגזרו iPSC כמתואר בעבר25 (איור 1B, ג).
    3. אנליזה פונקציונלית של ההבחנה iPSCs
      1. ביום 28 של שיתוף התרבות, לאסוף את התאים iPSC-CD8+ T מתרבויות דרך לקצור את התאים צף, טריסיזציה שאריות התאים עם 0.25% טריפסין, להשעות מחדש 8 מ ל של ipsc מדיה, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g ב 15 – 30 ° צ', להסיר את המדיה, לאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-10 מ ל של מדיה.
      2. שמור את התאים מחדש מושעה בצלחת 10 ס"מ טריים בחממה 37 ° c עבור 30 דקות ולהרכיב את התאים צף. ואז לשטוף את התאים פעם אחת עם מקור הצטננות.
      3. מודקון 3 x 106 תא T מרוקן הטחול (CD4-CD8-) מ טחולים של H-2 מחלקה אני נוק אאוט, hla-a 2.1-transgenic (hla) עכברים עם 5 μm s183 פפטיד (flltrilti) ב 200 μl של מדיה ב 4 ° c עבור 30 דקות.
      4. הפקת תערובת של תאים iPSC-CD8+ T עם הטחול פעמו עם s183 פפטיד (T תאים: הטחול = 1:4; השתמש 0.75 x 106 תאים T). מודטה את התערובת של תאים ב 37 ° c באינקובטור2 CO עבור 40 h. במהלך האחרון 7 h, להוסיף 4 μL של brefeldin מדולל A לתוך התרבות (הריכוז הסופי של 1, 000x, אשר יהיה מדולל ב-1x מדיה תרבות) כדי לחסום את תהליכי התחבורה במהלך הפעלת התא.
      5. כתם את התאים ולבצע ניתוח ציטומטלי הזרימה של התאיים IFN-γ כפי שמתואר בעבר (איור 2).

2. אינדוקציה של שכפול HBV באמצעות משלוח הידרודינמי של HBV פלסמיד

הערה: המבנה של pAAV/HBV 1.2 נוצר כמתואר לפני9. HBV 1.2 DNA להשלים משולבים pAAV וקטור.

  1. משלוחים הידרודינמיים של HBV פלסמיד דרך וריד הזנב
    1. חום HHD עכברים באמצעות מנורת חום עבור 5 דקות בכלוב כדי להתרחב הווריד הזנב.
    2. לעכב את החיה באמצעות הרחקה, זנבות עכבר נקי עם 70% תרסיס אתנול.
    3. . משלוח פלסאמצע לכבד
    4. מדוד את משקל גוף העכבר באמצעות קנה מידה מדידה.
    5. לדלל 10 μg של HBV פלבאמצע ב 8% המקבילה של מסת הגוף PBS (למשל, 1.6 mL עבור 20 g העכבר). טען מדולל פלמיד ב 3 מ"ל מזרק עם a 26 G × 1⁄2" (0.45 × 12 מ"מ) מחט תת-עורית.
    6. אתר אחד משני ורידים הזנב הרוחבי בשליש האמצעי של הזנב ומקמו את המחט לתוך הווריד לרוחב. ניהול הזריקה המכילה HBV פלבאמצע דרך וריד הזנב בתוך 3-5 s.
  2. קוונפיקציה של viremia מ סרום דם של עכברים נגועים
    הערה: שכפול HBV מתרחש מיום 3 – 35 בנסיוב העכבר. שכפול ה-DNA פסגות ביום 7 ומפחית בהדרגה. ה-DNA HBV אינו מתנקה מהנסיוב עד היום 35.
    1. אוסף של נסיוב דם מעכברים נגועים
      1. לאסוף כ 0.1 mL של דם בצינור מיקרוצנטריפוגה מכל עכבר על 3, 5, 7, ו 10 ימים לאחר זיהום על-ידי דימום מסלולית רטרו ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, לאחר מכן דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 20 דקות.
      2. צנטריפוגה את המדגם ב 6,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את הסרום supernatant לאחר צנטריפוגה.
    2. לטהר את הדנ א מנסיוב הדם באמצעות ערכת החילוץ הזמין מסחרית DNA לאחר ההמלצות של היצרן. בקצרה, lyse את התאים בעמודה מבוססת סיליקה, לבצע את שוטף, ולחלץ DNA על ידי הוספת 100% אתנול לעמודה להתחמק ו תפרידו ב 6000 x g עבור 1 דקות. elute ה-DNA ב 50 μl של מים חינם RNase.
    3. השתמש 100 ng של ה-DNA HBV מ הימנעות עבור ניתוח PCR בזמן אמת. השתמש בצבעי היסוד ובבדיקות הבאות: קדימה 5 ' טאגגונגג 3 '; הפוך 5 ' GCACAGCGCTTGT 3 '; . בדיקת מלאי 5
      1. השתמש הגנום HBV המכיל פלפמיד (pAAV/HBV 1.2) עבור עקומת רגיל לבצע PCR בזמן אמת בנפח כולל של 10 μL (איור 3).
    4. הגדר את תגובת ה-PCR בנפח כולל של 10 μL כפי שמוצג בטבלה 1.
    5. הגדר את התוכנית ה-PCR בתוך הציקלמטרנר כפי שמוצג בטבלה 2. שיעור המעבר לטמפרטורה מתוכנת הוא 20 ° צ'/s לדנטורציה/ריפוי ו-5 ° צ'/s עבור סיומת. מדוד את הזריחה בסוף שלב הריפוי עבור כל מחזור לניטור PCR בזמן אמת.

3. הפחתת שכפול HBV על-ידי פעולה של ויראלי-iPSC-CD8+ T מיוחדים בתאי

  1. העברת תאים המאמצת (ACT)
    1. להבדיל s183/iPSCs (1.3.7) על התאים OP9-DL1-DL4 מסטרומה בנוכחות mFlt-3L ו מיל -7 עבור 8 ימים כמתואר בסעיף 1.3.
    2. ביום 22, לאסוף את התאים iPSC-CD8+ T מלוחית 10 ס מ עם טריפסין, ולאחר מכן לשטוף ולהשעות מחדש כל צלחת 10 ס מ ב 10 mL של מדיה חדשה. הוסיפו את התאים לצלחת טרייה בגודל 10 ס מ וחזרו לחממה למשך 30 דקות כאשר נעשה זאת בסעיף 1.3. לאחר 30 דקות, לאסוף תאים צף.
    3. השתמש מסננת ניילון 70 יקרומטר כדי לעבור תאים כדי למנוע אשכולות תאים ולספור את מספר התא. להתאים את התאים לריכוז של 1.5 x 107 תאים/mL בתמיסה הקרה PBS ולהשתמש 70 יקרומטר ניילון מסננת לעבור תאים כדי למנוע אשכולות תא שוב אם יש צורך. שמור על התאים בקרח עד לפעולה.
    4. הכנס את השעיית התאים 200 μL (3 x 106 תאים) לתוך 4 – 6 עכברי השבוע בני hhd דרך הווריד הזנב.
  2. אינדוקציה של שכפול HBV
    1. ביום 14 לאחר העברת התא, לבצע את המסירה הידרודינמית של HBV פלבאמצע דרך הווריד הזנב כפי שמתואר בסעיף 2.1.
  3. חלבון וירוס זיהוי מהכבד הנגוע
    1. הקריבו עכברים בימים 3, 5, 7, 14, ו -21 לאחר ההדבקה. עבור המתת חסד, בכל כלוב, להשתמש 1 – 2 L של פחמן דו חמצני (CO2) בשלב הראשון. כאשר בעל החיים מפתח את אובדן התודעה, השג את שיעור הזרימה2 בסביבות 4 – 5 L/Min. בצע המתת חסד באמצעות שאיפת CO2 .
    2. הפרד את הכבד על ידי חיתוך העור פני השטח של צפק ניצול מספריים מלקחיים וקצת גרירת הכבד בחזרה כדי לחשוף את העור הפנימי רירית חלל הצפק. לאסוף ולגזור דגימות כבד (אורך x רוחב x גובה = 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ x 0.3 ס"מ) של העכברים הנגועים כדי להתאים בקלות לתוך הקלטת הטבעה לחסום בתוך 10% המאגר ניטרלי פורמלין עבור 4 – 24 h.
    3. Decalcify הכבד סמלסוססינג 2.5 M של חומצה פורמית; לשטוף את קסילן עבור 3 דקות, לשטוף 2x ב 100% אתנול, לשטוף 2x ב 95% אתנול, לשטוף 2x במים מיוים (די) עבור 2 דקות, ואז decalcify דגימות הכבד ב 1 מ"מ חומצה ethylenediאצטט (edta) בהתאמה. טיפול בטמפרטורה תת-רותחת (90 ° c) למשך 20 דקות.
    4. לצנן את רקמות הכבד קבוע עבור 30 דקות. לשטוף את הרקמות עם 1x PBS עבור 4 דקות ולהטביע את הרקמות ב פרפין. מייבשים את הרקמות בסדרה של ריכוזים גוברת של אתנול להחליף את המים, ולאחר מכן לטבול בטבילה קסילן להטביע את הרקמות חדרו לתוך גושי שעווה. הפוך שינוי אנכי ואופקי אחיד עבור כתמים. הכן 4 מקטעי יקרומטר עם מיקרוטומה הזזה.
    5. העבירו את הקטעים דרך המעבר החוצה ומעבר המים בעזרת קסילן ואתנול, ולאחר מכן בצעו כתמים אימונולוקסילאוריזציה של הסעיפים.
    6. כתם את הסעיפים עם 200 μL של משטח HBV נוגדן ספציפי ל-Ag (1:100 דילול בפתרון חסימת). מודיית את הסעיפים עם הנוגדן עבור 2 h ב RT ב 75% – 100% החדר מחולל לחות, ולשטוף 5x ב-1x PBS עבור 5 דקות.
    7. השתמש מגיב אנטי לדעוך המכיל 4 ', 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים כדי להכתים את השקופיות. להוסיף את coverslip עם כ 300 μL של פתרון DAPI מדולל מכתים (300 nM ב-1x PBS) ולאמת את כל coverslip מכוסה. שמרו את השקופיות בחשכה ב -4 ° צ' עד לבדיקה תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
  4. הסתננות תאים דלקתיים עכברים נגועים
    1. הקרבת עכברים כמתואר בשלב 3.3.1. לאסוף את הכבד ולעשות סעיפים כמתואר בשלב 3.3.4.
    2. הכתם את המקטע עם המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) כדי להעריך חדירה של תאים דלקתיים לתוך הכבד.
    3. אחסן שקופיות בחשכה ב-4 ° צ' עד לניתוח נוסף במיקרוסקופ פלורסנט.
    4. הדמיה השקופיות תחת מיקרוסקופ זריחה כדי לזהות חדירה של תאים דלקתיים לתוך הכבד (איור 4).
  5. DNA HBV זיהוי של הכבד הנגוע
    1. בידוד של דנ א נגיפי.
    2. המתת חסד עכברים לאסוף את דגימות הכבד לפי סעיף 3.3.
    3. Lyse את רקמות הכבד ב-Nonindet P-40 (NP-40) מאגר לליזה (50 mM טריס-HCL, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40) המכיל קוקטייל פרוטאז מעכבי.
    4. צנטריפוגה בקצרה ב 16,000 x g כדי להסיר את גרעיני ופסולת התא.
    5. מודקת cytoplasmic ליפוסט with מmicrococcal נוקלאז (נוקלאז S7; 150 יחידות/mL) ו-cacl2 (5 מ"מ) ב 37 ° צ' עבור 90 דקות כדי לבזות את חומצת הגרעין מחוץ נוקלאואואפידים (ncs).
    6. הפוך את נוקלאז S7 על ידי תוספת של 10 מ"מ edta.
    7. מזרז את נוקלאואוקאפסידים עם פוליאתילן גליקול (יתד), לשבש על ידי 0.5% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ולעכל עם 0.6 mg/mL פרוטטינואז K (PK) ב 37 ° צ' עבור 1 h.
    8. לשחזר את חומצות גרעין נגיפי ידי כלורופורם פנול החילוץ משקעים אתנול.
    9. לפתור את ה-DNA נגיפי שחולצו על 1.2% agarose ג'ל ולזהות לפי תקן כתמי הדרומי סטנדרטי באמצעות32 P-התווית hbv בדיקה DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמוצג כאן, HBV נגיפי ה-iPSC-CD8+ T תאים שנוצרו על ידי מערכת תרבות מבחנה. לאחר הפעולה של אלה ויראלי מסוג iPSC-CD8+ T תאים באופן משמעותי לדכא את שכפול hbv במודל Murine (קובץ משלים 1). העכבר iPSC הם התמרה עם המבנה של MIDR retroviral יעיל קידוד היברידית של העכבר האנושי HBV (Hbv183-191-ספציפי, s183), לאחר מכן iPSCs גנים המ בשיתוף עם OP9-DL1/DL4 תאים המבטא ליגניות (הן DL1 ו DL4) מולקולות בנוכחות rFlt3L ו-rIL-7. ביום 28 של תרבות שיתוף חוץ-גופית, התאים הנגזרים iPSC באופן משמע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מציג שיטה להפקת ה-iPSC-CTLs הנגיפי הספציפי לשימוש ב-ACT כדי לדכא שכפול HBV במודל מורין. בזיהום HBV כרונית, הגנום הנגיפי צורות כרומוזום מיני יציבה, ה-DNA סגור מעגלי מעגלית (cccDNA) זה יכול להימשך לאורך כל תוחלת החיים של hepatocyte. פילוח הסיווג של כרומוזום מיני נגיפי עלול לגרום לתרופה של זיהום HBV כרונית. הטיפול האנטי ויראלי מטרות ההמרה הפוכה הווירוס, אך לעתים רחוקות יוצר שליטה חיסונית על שכפול HBV מונע על ידי cccDNA. CD8+ ctls ספציפי ל-hbv יכול לתווך את הריגת החלציטים הנגועים ולהאיץ את הסיווג של cc...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מודים ד ר אדם J Gehring מבית החולים הכללי של טורונטו המכון למתן cDNA עבור HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-הספציפי A2-מוגבל אנושי היברידית TCR, וד ר. פיי-ג'ר צ'ן מאוניברסיטת טייוואן הלאומית למתן המבנה של pAAV/HBV 1.2. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק בריאות R01AI121180, R01CA221867 ו R21AI109239 לג. ס. י.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברי HHDInstitut Pasteur, פריז, צרפתנוקאאוט H-2 Class I, עכברי HLA-A2.1-טרנסגניים (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17RIKEN Cell BankAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
pAAV / HBV1.2 פלסמידד"ר פיי-ג'ר צ'ן (בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן, טייוואן)HBV DNA construct
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) - גנים TCR ספציפייםד"ר אדם ג'יי גרינג (מכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו, טורונטו, קנדה)גנים TCR היברידיים של אדם-עכבר מוגבלים A2 ספציפיים ל- FLLTRILTI (Vα 34 ו-Vβ 28)
OVA257– 264 גנים ספציפיים ל-TCRד"ר דריו א. ויניאלי (אוניברסיטת פיטסבורג, פנסילבניה)נוגדן TCR מוגבל H-2Kb ספציפי ל-SIINFEKL
נוגדן Anti-CD3 (17A2)נוגדן Biolegend100236
נוגדן נגד CD44 (IM7)BD נוגדן Pharmingen103012
Anti-CD4 (GK1.5) נוגדןBiolegend100408
Anti-CD8 (53-6.7) Biolegend
אנטי-IFN-&גמא; (XMG1.2) נוגדןBiolegend505810
נוגדן Anti-TNF-a (MP6-XT22) Biolegend506306
α-MEMInvitrogenA10490-01
נוגדן Anti-HBsThermo FisherMA5-13059
ACK מאגר ליזהLonza10-548E
Brefeldin ASigmaB7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBSHycloneSH3007.01
FACSAria Fusion תאים סדרןBD656700
ג'לטיןMilliporeSigmaG9391
GeneJammerAgilent204130
HLA-A201-HBs183-91-PE פנטמרProimmuneF027-4A - 27
HRP נוגדן משני נגד עכברInvitrogenA27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nuclease S7Roche10107921001
ParaformaldehydeMilliporeSigmaP6148-500Gזהירות: אלרגני, מסרטן,
מאגר חדירותBiolegend421002
פוליברן, MilliporeSigma107689
ProLong™ תושבת זהב Antifade עם DAPIInvitrogenP36931
QIAamp MinElute וירוס ספיןקיט Qiagen57704
100732 רעיל

מקורות

  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
  3. Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
  4. Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
  5. Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
  6. Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208(2013).
  7. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  8. Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
  9. Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
  10. Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
  11. Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
  12. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  13. Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
  14. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
  15. Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
  16. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
  17. Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
  18. Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
  19. Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
  20. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
  21. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  22. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  23. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  24. Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
  25. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986(2012).
  26. Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
  27. Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
  28. Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
  29. Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
  30. Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
  31. Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
  32. Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TTHBVT CD8 iPSCHBVT
גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.