מאמר שיטה

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

DOI:

10.3791/60056

⸱

16 בספטמבר 2019

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של RNAs קטן (sRNAs) לפי רצף הדור הבא (NGS) הוא מאותגר על ידי בעיות הטיה במהלך הכנת הספרייה. מספר סוגים של sRNA כגון צמח microRNAs (miRNAs) לשאת 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי ב 3 ' מסופים שלהם שלהם. שינוי זה מוסיף קושי נוסף כאשר הוא מעכב את החיבור של 3 מתאמים. בעבר הדגמנו שלגירסאות ששונו של פרוטוקול TruSeq (TS) יש פחות הטיה וזיהוי משופר של 2 ' מוכן '. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פירוט ' TS5 ', אשר הראה את הביצועים הכוללים הטוב ביותר. TS5 ניתן לעקוב גם באמצעות ריאגנטים תוצרת בית או ריאגנטים מערכת TS, עם ביצועים שווים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAs קטנים (sRNAs) מעורבים בשליטה של מגוון תהליכים ביולוגיים1. התקנות הרגולטוריות של eukaryotic הן בדרך כלל בין 20 ל-30 nt; שלושת הסוגים העיקריים הם microRNAs (miRNA), piwi-אינטראקציה RNAs (piRNA) ו-RNAs מתערב קטן (siRNA). רמות הביטוי המוטעות היו מעורבים במגוון מחלות2. זה מדגיש את החשיבות של miRNAs בריאות ומחלות והדרישה לכלי מחקר מדויקים, כמותיים כדי לזהות sRNAs בכלל.

רצף הדור הבא (NGS) הוא שיטה נפוצה ללימוד sRNAs. היתרונות העיקריים של ngs לעומת גישות אחרות, כגון ה-PCR כמותי או טכניקות microarray (qpcr), הם שהוא אינו זקוק לידע פריורי של רצפי srna ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לגלות rnas הרומן, ובנוסף הוא סובל פחות מ אותות רקע ואפקטי רוויה. עוד, הוא יכול לזהות הבדלים נוקלאוטיד יחיד ויש לו תפוקה גבוהה יותר מאשר מיקרו מערכים. עם זאת, NGS יש גם כמה החסרונות; העלות של הפעלה ברצף נותרת גבוהה יחסית ותהליך רב הנדרש כדי להמיר מדגם לספריה לרצף עשוי להציג הטיות. בתהליך ההכנה האופייני של ספריית srna, מתאם 3 מגיע לראשונה ל-srna (לעתים קרובות ג'ל מזוקק מ-rna הכולל) בגרסה קטומה של rna ליגאז 2 (RNL2) ומתאם 3 מקדים (איור 1) בהיעדר ATP. הדבר מגביר את היעילות של הקשר המתאם של sRNA ומפחית את היווצרות התגובות הצדדיות כדוגמת sRNA circularization או קונקטאריזציה. לאחר מכן, 5 ' מתאם הוא ליגיום על ידי RNA ליגאז 1 (RNL1), ואחריו תמלול הפוכה (RT) ו-PCR הגברה. כל השלבים הללו עשויים להציג הטיה3,4. כתוצאה מכך, קריאת מספרים עשויה שלא לשקף רמות ביטוי בפועל של sRNA המובילות לתבניות ביטוי מלאכותיות התלויות בשיטה. SRNAs ספציפיים עשוי להיות מוגדר או לא מיוצג בספריה, ומאוד מיוצגת על-ידי sRNAs שעשוי להימלט מזיהוי. המצב מורכב במיוחד עם mirnas צמחים, sirnas בחרקים וצמחים, ו pirnas בחרקים, נמטודות ויונקים, שבו 3 ' מסוף נוקלאוטיד יש 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי1. שינוי זה מעכב בחוזקה 3 ' מתאם התאמה5, ביצוע הכנה ספריה עבור סוגים אלה של RNA משימה קשה.

העבודה הקודמת הוכיחה שלקשר מתאם מציג הטיה רצינית, עקב השפעות רצף/מבנה RNA6,7,8,9,10,11. מדרגות במורד הזרם של המתאם כגון תעתיק הפוך ו-PCR לא תורמים באופן משמעותי להטיה6,11,12. הטיה ליפטיים היא כנראה בשל העובדה כי מולקולות מתאם עם רצף נתון יהיה אינטראקציה עם מולקולות sRNA בתערובת התגובה לטופס מקפלים שכונתיות, כי יכול להוביל תצורות חיוביות או שלילי לצורך הארכה (איור 2). נתונים מsorefan ואח '7 מראים כי RNL1 מעדיף הקשר נטוש יחיד, בעוד RNL2 מעדיף סטרנד כפול לצורך הארכה. העובדה שמבני הקיפול המשותף של המתאם/sRNA נקבעים על-ידי המתאם הספציפי ורצפי sRNA מסביר מדוע sRNA ספציפי מיוצג באמצעות ערכת מתאם נתונה. חשוב גם לציין שבתוך סדרה של ספריות sRNA שיש להשוותו, יש להשתמש באותם רצפי מתאמים. אכן, זה בעבר נצפתה כי שינוי מתאמים על ידי המבוא של רצפי ברקוד שונים משנה את פרופילי mirna ב רצף ספריות9,13.

אקראיות של רצפי מתאמים ליד צומת החיבור עלולה להקטין את הביסים האלה. Sorefan ועמיתיו7 מתאמים משומשים עם 4 נוקלאוטידים אקראיים בגפיים שלהם, המיועדים "high Definition" (HD) מתאמים, והראו כי השימוש במתאמים אלה מוביל לספריות שמשקפות טוב יותר את רמות הביטוי srna אמיתי. עבודה עדכנית יותר אישרה תצפיות אלה וחשף כי האזור האקראי אינו צריך להיות סמוך לצומת החיבור11. סוג זה של המתאמים נקרא "MidRand" מתאמים. יחד, תוצאות אלה מדגימות כי עיצוב מתאם משופר יכול להפחית את ההטיה.

במקום לשנות את המתאמים, הטיה ניתן לדכא דרך האופטימיזציה של תנאי התגובה. פוליאתילן גליקול (יתד), סוכן macromolecular צפיפות הידוע כדי להגדיל את יעילות לקצץ14, הוכח להפחית באופן משמעותי הטיה15,16. מבוסס על תוצאות אלה, כמה "נמוך הטיה" ערכות הופיעו בשוק. אלה כוללים ערכות המשתמשות ב-יתד בתגובות הקשר, או בשילוב עם מתאמים קלאסיים או מתאמי HD. ערכות אחרות להימנע לחלוטין, ולהשתמש 3 ' פוליאדלציה ומיתוג תבנית עבור 3 ' ו 5 ' מתאם התוספת, בהתאמה12. בעוד אסטרטגיה אחרת, הארכה של 3 מתאמים מלווה בצעד מעגלי, ובכך משמיט את החוגה של 5 מתאמים17.

במחקר קודם חיפשנו פרוטוקול הכנה של ספריית sRNA עם הרמות הנמוכות ביותר של הטיה ואת הזיהוי הטוב ביותר של 2 '-OMe RNAs12. בדקנו כמה מהעירייה ' הטיה נמוכה ' ערכות, אשר היה זיהוי טוב יותר של 2 '-OMe RNAs מאשר פרוטוקול רגיל (TS). באופן מפתיע עם זאת, עם השינוי (השימוש של מתאמים אקראיים, פג בתגובות לתיקון והסרה של עודף 3 ' מתאם על ידי טיהור) האחרון ביצע את הפרוטוקולים האחרים לאיתור של 2 '-OMe RNAs. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול מבוסס על פרוטוקול TS, ' TS5 ', אשר היה הזיהוי הכללי הטוב ביותר של 2 '-כולל RNAs. הפרוטוקול יכול להיות בעקבות באמצעות ריאגנטים מערכת ה-TS ומגיב אחד מן הקיט ' Nf ' או, כדי לחסוך כסף, באמצעות ריאגנטים תוצרת בית, עם ביצועים שווים. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט לטיהור של sRNA מ-RNA הכולל והכנת מתאם 3 מראש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד של RNAs קטנים

  1. לחלץ כולל RNA בעזרת ריאגנטים מבוססי פנול או כל שיטה אחרת. ודא אם ה-RNA הוא באיכות טובה.
  2. הפעלה מראש של 15% TBE-אוריאה ג'ל (ראה טבלת חומרים) עבור 15 דקות ב 200 V.
  3. בעוד הג הוא מראש ריצה, לערבב 5-20 μg של RNA סה כ 5-15 בנפח μl עם נפח שווה של שוויון הטעינה צבע ( לראות את טבלת חומרים; 95% לאחר העדכון, 0.025% ברומאופנול כחול, 0.025% קסילן, 5 מ"מ מתחת pH 8) בתוך 200 μl PCR הצינור. כמו כן, לערבב 10 μL (200 ng) של סולם קטן-RNA (ראה טבלת חומרים) עם נפח שווה של שוויון הטעינה צבע. מודטה עבור 5 דקות ב 65 ° c ב מכסה התרמי עם המכסה מחומם, ואז למקם את הצינורות מיד על הקרח.
  4. טען את הסולם ואת המדגם על אותו ג'ל עם נתיב אחד לפחות ביניהם לרוץ ב 200 V עד ברומאופנול כחול (כחול כהה) היגרו כשני שליש של אורך ג'ל (כ 40 דקות).
  5. להכין מערכת כדי elute RNA מ ג'ל כדלקמן: ניקוב התחתון של nuclease-חינם 0.5 mL מיקרו צנטריפוגה שפופרת עם מחט 21 מד. מניחים את הצינור 0.5 mL מנוקב ב nuclease ללא שפופרת מיקרו-התחתון 2 mL.
  6. להסיר את הג, ו דגירה בטמפרטורת החדר עם 3 μL חומצה גרעין כתם ג'ל (10,000 x להתרכז; ראה טבלה של חומרים) ב 30 מ"ל מים עבור 10-15 דקות.
  7. הצגת ג'ל על ממאיר טרנס הקורא כהה (מומלץ מאוד להימנע UV כמו זה עלול לגרום נזק RNA) ולגזור את המדגם RNA בין 17 nt ו 29 nt הסולם להקות. העבר את פיסת ג'ל לצינור 0.5 mL משלב 1.5.
  8. צנטריפוגה את שפופרת 0.5 mL בצינור 2 mL ב צנטריפוגה מיקרו במהירות מקסימלית עבור 2 דקות. הסר 0.5 את צינור ה-mL, אשר אמור להיות ריק כעת.
  9. הוסף 300 μL של nuclease-חינם 0.3 M המשך לצינור 2 מ"ל המכיל את ג'ל מעוך ולסובב לפחות 2 h בטמפרטורת החדר או ב 4 ° צלזיוס לילה (16 h).
  10. להעביר את ההשעיה של חתיכות ג'ל כתוש לטור ספין (ראה טבלת חומרים) ו צנטריפוגה עבור 2 דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה מיקרו.
  11. הוסף 1 μL (20 μg/μL) של גליקוגן (ראה טבלת חומרים) ו-950 μl של טמפרטורת החדר 100% אתנול. מודטה לפחות 30 דקות ב-80 ° c.
  12. צנטריפוגה עבור 20 דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה מיקרו ב 4 ° c. הסר את supernatant, לשטוף את הגלולה עם 800 μL של קר 80% אתנול. צנטריפוגה שוב עבור 5 דקות ב-4 ° c, ובזהירות להסיר את כל supernatant. השהה מחדש את גלולה RNA ב 15 μl של מים חופשיים נוקלאז. בדרך כלל, ~ 5-20 ng של RNA קטן צריך להיות התאושש, בהתאם כמות של קלט RNA הכולל (~ 1 ng של RNA קטן לכל 1 μg של קלט RNA סה כ).
  13. צעד נוסף מומלץ: בדוק את הכמות והאיכות של sRNA התאושש (למשל, על ידי האלקטרופורזה ג'ל קפילר באמצעות ערכת RNA קטנה; ראה לוח חומרים).

2. הכנת מתאם HD 3 מקדים

הערה: באופן דומה לפרוטוקול המתואר על ידי חן ואח ', בוצע מתאם מסוג3-HD מראש. שים לב כי ניתן להזמין מתאם מראש ישירות (/5d/שינוי), אך זה יקר למדי.

  1. "הזמנה של 5" שלושה מתאמים. " ראה טבלה 1 עבור רצף ושינויים. שים לב כי ' 3AmMO ' הוא 3 ' קבוצה משנה אמינית, רוב הספקים יכולים לייצר olig, הגאות עם שינוי זה. לדלל ב נוקלאז מים ללא תשלום כדי 100 μm.
  2. הגדר תגובה 100 μl המכילה את הריאגנטים הבאים: 10 μl של oligo (100 μm), 10 μl של T4 מאגר ליגאז של RNA (10x), 10 μl של ATP (10 מ"מ), 40 μl של 50% PEG8000, 5 μl של T4 לליגאז 1 (50 יחידות), 25 μl של nuclease-מים ללא תשלום. המלון משלב בין לילה ב -20 ° c.
  3. בצע הפקת כלורופורם-פנול קלאסית של מחלת החמצן המוקדמת ואחריו משקעים של אתנול. הוסף 100 μL של חומצה (pH 4.5) פנול: כלורופורם ומערבולת. מסתובב 5 דקות בטמפרטורת החדר, מהירות מקסימלית. העבר בזהירות 90 μL של השלב העליון לשפופרת חדשה; להוסיף 10 μL של 3 M סודיום אצטט pH 5.2, 1 μL של הגליקוגן אולטרה טהורה ו 250 μL של הצטננות 100% אתנול.
  4. המשיכו במהירות של 20 ° c במשך 30 דקות לפחות. צנטריפוגה עבור 30 דקות ב -4 ° c מהירות מקסימלית. הסר את supernatant, לשטוף את הגלולה פעם אחת עם 500 μL קר 80% אתנול. כחלופה לחילוץ פנול-כלורופורם ומשקעים אתנול, ניתן להשתמש בערכת הסרת נוקלאוטיד (ראה טבלת חומרים). . השעיה מחדש ב -25 מיים Μi
  5. למדוד את הריכוז של המתאם באמצעות ערכה עבור זיהוי ספציפי של DNA אחד תקוע (ראה טבלת חומרים). דלל ל 80 ng/μL (10 μM).
  6. צעד נוסף מומלץ: לאמת את היעילות של פראדלציה על-ידי העברת 1 μL של 10 מתאם μM על 15% TBE-אוריאה ג'ל (טבלת חומרים) יחד עם מחלת היתר מטופל. המתאם הטרום-מעבר אמור להעביר מעט לאט יותר מאשר מחלת החמצן לא מטופלת. במידת הצורך, ניתן לטהר את המתאם הקדם-מקדים; להמשיך כמתואר לעיל (שלבים 1.2-1.12).

3. הכנת הספרייה-פרוטוקול TS5

הערה: אנו מציגים כאן את פרוטוקול TS שונה ' TS5 ' שתיארנו בעבר12 , כי ניתן לבצע גם עם ריאגנטים מן הערכה או עם ריאגנטים שסופקו עצמית. יצוין כי הצלחנו להשיג תוצאות דומות או אפילו מעט יותר טוב עם פרוטוקול שונה, ' TS7 '. עם זאת, עם TS7 קשה יותר לחסל את המתאם. לפיכך העדפת לתאר TS5 בפרוטרוט, אך ניתן לאחר מכן להחליף את המתאמים רק בTS7. עבור TS7 השתמש ברצפי המתאם ' MidRand כמו (MRI) ' (טבלה 1). שים לב שהאזורים האקראיים נמצאים באמצע המתאמים. התחל עבור תמלול הפוכה ו-PCR יהיה hybridize לרצפים במורד האזור אקראי במתאם 3 ' ובמעלה הזרם של האזור אקראי במתאם 5 '. רצף יתחיל מהנוקלאוטיד האקראי הראשון במתאם 5.

  1. . הארכה של 3 מתאמים
    1. שילוב 1 μL של מתאם HD מסוג 3 אינץ ' (10 μM) עם 1 μL של רנ א קטן מטוהרים (~ 0.1-1 μM) בשפופרת מיקרו של 0.2 mL. מודטה עבור 2 דקות ב 72 ° c ב הציקלונט תרמו, ואז לשים ישירות על הקרח.
    2. הוסף 4 μl של 50% יתד 8000 (פתרון צמיגי; pipet לאט), 1 μl של מאגר ליגאז rna (10x), 1 μl של H2O, 1 μl של T4 rna ligase2 נחתך, ו-1 μl של מעכב rnase. המשך הלילה ב -16 ° c.
  2. חיסול מתאם בלתי מנוכה 3
    1. הוסף 10 μL של nuclease-מים חינם ומערבבים היטב. הוסף 6 μL של 3 M NaOAc pH 5.2 או מתאם פתרון מחסור מערכת Nf (טבלת חומרים) ומערבבים היטב. הוסף 40 μL של חרוזי טיהור מגנטיים (טבלת חומרים) ו 60 μl של איזופנול ו מערבבים היטב. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הניחו את הדגימה בארון תקשורת מגנטי עד שהפתרון מופיע ברור. הסר והשמט את הסופרנטאנט.
    3. הוסף 180 μL של המוכן טרי 80% אתנול. . ולאחר מכן להסיר לשמור על השימוש טרי מוכן 80% אתנול ולא מווסת עם 80% אתנול לתקופות ממושכות.
    4. בקצרה לסובב את הצינור ולהסיר נוזל שיורית כי ייתכן שנאספו בתחתית הבאר. תן את החרוזים יבשים עבור 2 דקות, ואז להשעות מחדש ב 22 μL של 10 מ"מ מילימטר טריס pH 8 או מאגר resuspend מן הערכה Nf. דגירה עבור 2 דקות, ולאחר מכן מגנט המדגם עד הפתרון מופיע ברור.
    5. הוסף 6 μL של 3 M NaOAc pH 5.2 או מתאם פתרון מחסור מערכת Nf (טבלת חומרים) לצינור חדש. העבר 20 μL של supernatant מהשלב הקודם לצינור החדש הזה ולערבב על ידי ליטוף. הוסף 40 μL של חרוזים מגנטיים ו 60 μL של 100% איזופנול ו מערבבים היטב על ידי ליטוף. דגירה של 5 דקות.
    6. מגנזיום את המדגם עד הפתרון מופיע ברור, ואז להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט.
    7. הוסף 180 μL של המוכן טרי 80% אתנול. . ולאחר מכן להסיר טיטאק להשתמש טרי 80% אתנול מוכן לא לווסת עבור עם 80% אתנול לתקופות ממושכות.
    8. בקצרה לסובב את הצינור ולהסיר נוזל שיורית כי ייתכן שנאספו בתחתית הבאר. תן את החרוזים יבשים עבור 2 דקות, ולהשעות מחדש ב 10 μL של מים ללא החכירה. דגירה עבור 2 דקות, ולאחר מכן מגנט המדגם עד הפתרון מופיע ברור.
    9. העבר 9 μL של סופרנט לשפופרת חדשה. הוסף 1 μl של T4 לליגאז מאגר (10x) ו 1 μl של מים. לחלופין, הוסף 2 μl של מאגר ליגאז מערכת ה-TS.
  3. הארכה של מתאם 5.
    1. הוסף 1 μL של מתאם 5 ' HD (10 μM; שולחן 1) לצינור מ200 μL של שפופרת עם מכסה מחומם. דגירה עבור 2 דקות ב 70 ° c, ואז לשים את הצינור ישירות על הקרח.
    2. הוסף 1 μl של 10 מ"מ מ-ATP ו-1 μl של T4 לליגאז 1. מערבבים היטב על ידי ליטוף בעדינות. הוסף 3 μL של תערובת זו ל-RNA שלושה ליגבטים משלב 3.2.9 ומערבבים באמצעות ליטוף. המשך 1 h ב -28 ° c.
  4. תעתיק הפוך (RT)
    1. העברה 6 μL של 3 ' ו-5 ' מתאם RNA לצינור חדש 200 μL PCR (לשמור את הנותרים ~ 8 μL ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר במידת הצורך). הוסף 1 μL של התחל (10 μM; שולחן 1) ומערבבים באמצעות ליטוף. דגירה עבור 2 דקות ב 70 ° c, ואז לשים את הצינור ישירות על הקרח.
    2. הוסף את הריאגנטים הבאים עבור RT: 2 μL של מאגר הגדיל הראשון 5x, 0.5 μL של 12.5 מ"מ מיקס dNTP, 1 μL של 100 מ"מ DNTP, 1 μL של מעכבי RNase, ו-1 μL של היפוך הטרנסקריפטאז (טבלת חומרים). מיכל הדגירה 1 h ב 50 ° c.
  5. הגברה הPCR
    1. הוסף את הריאגנטים הבאים כדי 12.5 μL של תערובת התגובה RT: 10 μL של מאגר PCR פולימראז, 2 μL של אוניברסלי P5 פריימר (10 μM; טבלה 1), 2 μl של P7-מדד פריימר (10 μm; טבלה 1), 1 μl של 12.5 MM dNTPs, 0.5 ΜL של DNA פולימראז (טבלת חומרים), ו 22 μl של מים. . שמור על התגובה על הקרח עד השימוש
    2. הפעל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 98 ° צ' למשך 30 ס מ, 11 מחזורים (98 ° c עבור 10, 60 ° צ' לשלושים 72 וחמישה ° c) ו-72 ° c במשך 10 דקות. שמרו על התגובה ב -4 ° c כשתסיים.
      הערה: בנוגע למספר מחזורי ה-PCR: אנחנו בדרך כלל מבצעים 11 מחזורים, אבל זה צריך להיות ממוטב על ידי המשתמש. נסה לבצע את המספר הקטן ביותר האפשרי של מחזורי PCR.
  6. ג'ל לטיהור
    1. הפעל 5, 10 ו 20 μL של מוצר PCR על יליד 6% TBE ג'ל (ראה טבלת חומרים) יחד עם סולם מתאים (ראה לוח חומרים). הפעל את ג'ל עבור כ 1 h ב 145 V (עד כחול ברומנול מגיע לתחתית; הצבע הזה נודד בתנוחת 65 bp).
    2. להסיר את הג, ו דגירה עם כתם חומצה הגרעין ג'ל (ראה טבלת חומרים) במים עבור 10-15 דקות.
    3. הצגת ג'ל על "קורא כהה" ממאיר טרנס (מומלץ מאוד להימנע UV כמו זה עלול לגרום נזק RNA) ולגזור את להקת הספרייה ב 150 bp. הכינו מערכת כדי להכין את ה-RNA מ-ג'ל כמתואר בשלב 1.5 והעבר את החלק ג'ל לצינור ה-mL של 0.5.
    4. צנטריפוגה בצנטריפוגה מיקרו במהירות מקסימלית עבור 2 דקות. הסר את צינור 0.5 mL, אשר אמור להיות ריק עכשיו.
    5. הוסף 300 μL של nuclease-מים ללא שפופרת 2 mL המכילה את ג'ל מעוך ולסובב עבור לפחות 2 h בטמפרטורת החדר או ב 4 ° c בלילה.
    6. להעביר את ההשעיה של חתיכות ג'ל כתוש במים לטור ספין צנטריפוגה עבור 2 דקות במהירות מקסימלית.
    7. להוסיף 1 μL של (20 μg/μL) גליקוגן, 30 μL של 3 M NaOAc ו 975 μL של קרח קר 100% אתנול. צנטריפוגה עבור 20 דקות במהירות מקסימלית ב -4 ° c.
    8. השהה מחדש את הגלולה ב 20 μL של 10 מ"מ Tris pH8. השתמש 1 μL עבור מדידת ריכוז 1 μL עבור בקרת איכות.

4. ניתוח נתונים

הערה: הליך ניתוח נתונים המתואר להלן מבוסס על מערכת ההפעלה Linux אובונטו 16.04 הארה.

  1. טיפול בקבצי רצף גולמי
    1. הורד את קובץ הרצף של FASTQ שנוצר במהלך הפעלת רצף. אם נדרש, לבצע deריבוב עם bcl2fastq2 (גירסה V 2.2.18.12; ניתן להוריד ידנית מהקישור הבא: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      השתמש בפקודה הבאה:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/b cl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --התעלם-חסר-bcl-פלט-dir Pathway_of_Output_Directory -ברקוד-אי-התאמות 1--צבור-אריחים אוטומטי-r 16-d 16-p 16-w 16
    2. הסר רצפי מתאם באמצעות התאמת הקיצוץ19 גירסה 1.15. מדריך ניתן להוריד כאן: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      השתמש בפקודה הבאה:
      Pathway_to_cutadapt/ הסתגלות-כמוסות-משחק 4-m 10-j 0--לקצץ 10-o Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz (...)
      שים לב כי הרצף בפקודה מתאים למתאם 3 ' HD ללא 4 נוקלאוטידים אקראיים; לפיכך לא יוסרו במהלך שלב זה.
    3. השתמש seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) להסרת מסופים אקראיים נוקלאוטידים בקריאות הרצף. השתמש בפקודה הבאה (שמות משתנים בהדגשה):
      seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 מיכל כהן . fastq
    4. השתמש בפקודה awk הבאה כדי למחוק את הרצפים הקצרים מ-10 nt:
      awk ' בגין {FS = "\t"; פרסות = "\n"} {כותרת = $0; המשך השורה העליונה; קבל קו כותרת qheader; getline qheader; אם (אורך (seq) > = 10) {כותרת הדפסה, seq, כותרת עליונה, qheader}} ' Output_File_Read1_ גזוז. fastq > Length_Filtered. fastq
  2. מיפוי הרצפים הגזומים
    1. הורד את מסד הנתונים המתאים לאורגניזם של המחקר מ miRBase כדלקמן. עבור לhttp://www.mirbase.org/ftp.shtml והורד את הקובץ ' בוגר. fa '. שים לב שהרצפים מצוינים בסימון RNA. החליפו את השקעים ב-T באמצעות הפקודה הבאה:
      ! > s/U/T/g ' בוגרת. פא
      הערה: זה יהיה להניב רשימה מלאה של כל miRNAs ב Mirnas, שמקורם מגוון של אורגניזמים.
    2. בחר את רצפי miRNA של האורגניזם המעניין בפקודה הבאה:
      awk 'name_of_the_organism{הדפסה; הבאה (nr + 1]; הבא}; ע"נ בוגרת. פא > mature_name_of_the_organism_מירס.
    3. מפה את הקריאות לקובץ שנוצר לעיל באמצעות Bowtie220 (גירסה 2.3.0) ואינה מאפשרת אי התאמות. תחילה, בניית אינדקס עבור הקובץ באמצעות הפקודה הבאה:
      bowtie2-בניית mature_name_of_the_organism_מירס. פא mature_name_of_the_organism_מירס
    4. יישר את שינויים ברצף הקריאות למסד הנתונים, תוך הדרישה שמפות קריאה לחלוטין ל-miRNA של מסד הנתונים, ללא כל התאמות. לשם כך, השתמש בכלי הבא:
      bowtie2-N 0-L 10--ציון-min C, 0, 0--קצה לקצה-זמן-x-mature_name_of_the_organism_מירס-U Length_Filtered. Fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. sam
      הערה: האפשרות:--ציון-מינימום C, 0, 0 מבטיחה שהיישור יהיה ללא כל התאמות. להסבר על הפרמטרים השונים בכלי, בקר באתר האינטרנט הבא: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. כדי למחוק את הקריאות שלא התיייישרו, השתמש בפקודה הבאה:
      samtools תצוגה-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirsסם
      הערה: כתוצאה משלבים אלה, עליך לקבל כעת את הקריאות המיושרות, המתאימות ל-miRNAs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים הם הבידוד של חלק RNA קטן של החומר ההתחלתי RNA הכולל (איור 3) ואת המוצר המבוקש הסופי ספרייה (איור 4). שני השלבים כרוכים בטיהור פוליאקרילאמיד ג'ל; רנ א קטן מבודד מ 15% שתנן TBE ג'ל, בעוד הספריות הסופיות מבודדות מ 6% הילידים TBE ג ' לים. רנ א קטן מבודד ג'ל ניתן לנתח על שבב האלקטרופורזה קטן RNA נימי (טבלת חומרים; איור 3 ב). זה יאפשר למשתמשים להעריך את כמות ה-RNA הקטן התאושש ואת החלק של mir...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנה קטנה של ספריית RNA נותרת מאתגרת עקב הטיה, שהוצגה בעיקר במהלך שלבים להטיות במתאם. Rnas עם 2 '-OMe שינוי ב 3 ' סוף שלהם כגון צמח mirnas, pirna חרקים, נמטודות ויונקים, ו rnas מתערב קטן (sirna) חרקים וצמחים הם קשים במיוחד ללמוד כי 2 '-OMe שינוי מעכב 3 ' מתאם הקשר. מספר פתרונות הוצעו בספרות כדי לשפר את פרוטוקולי ההכנה של הספרייה sRNA, אך רוב הקיטים הזמינים מסחרית עדיין מבוססים על פרוטוקול ה-TS הקלאסי, הכולל הטיה חמורה. כמה ' הטיה נמוכה ' ערכות קיימות, עם זאת, כולל את הקיט Nf עם מתאמים אקראיים ו-פג בתגובות הקשר, וערכות כמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS), האנרגיות החלופיות הצרפתיות והנציבות לאנרגיה אטומית ואוניברסיטת פריס-Sud. כל הכנות הספריה, המאייר רצף וביואינפורמטיקה ניתוחים עבור מחקר זה בוצעו במתקן I2BC הדור הבא (NGS). חברי המתקן I2BC NGS מודעים לקריאה קריטית של כתב היד והצעות מועילות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשיר ביואנלייזר 2100 AgilentG2939BA
חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)ThermoFisherAM9720
אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Agencourt AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63880
ביואנלייזר ערכת DNA ברגישות גבוההAgilent5067-4626
ביו-אנלייזר ערכת RNA קטנהAgilent5067-1548
Corning Costar Spin-X מסנני צינור צנטריפוגהסיגמא אולדריץ'CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminatorספקים
ערכת HotStart PCR, עם dNTPsKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex ערכת RNA-seq V3 קטנהBIOO ScientificNOVA-5132-05ג'לים אופציונליים
של Novex TBE 6%ThermoFisherEC6265BOX
ג'לים של Novex TBE Urea 15%ThermoFisherEC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal KitQiagen 28304
קיוביט 4 ערכת התחלה כימותThermoFisherQ33227
ערכת בדיקת קיוביט ssDNA ThermoFisherQ10212
צבע טעינת ג'ל RNA (2X)ThermoFisherR0641
צבע טעינת ג'ל RNA (2X)ThermoFisherR0641
מעכב RNase, מורין Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV טרנסקריפטאז הפוךThermoFisher18090200
SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהבThermoFisherS11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)Nex England BiolabsM0204S
T4 RNA Ligase 2, קטוםNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 bp DNA סולםThermoFisher10488043
TruSeq ערכת הכנה לספריית RNA קטנהIlluminaRS-200-0012/24/36/48אופציונלי
UltraPure GlycogenThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
ZR סולם RNA קטןZymo ResearchR1090
שני המספרים האחרונים תואמים לקבוצת האינדקסים
שונים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4(2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049(2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118(2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969(2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619(2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109(2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105(2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41(2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25(2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA2 O RNATruSeq TS5RNAmicroRNABowtie2

מאמרים קשורים