הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60066

⸱

13 בספטמבר 2019

 , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, 2Graduate School of Systemic Neurosciences, Ludwig Maximilian University, 3Department of Cell Biology and Anatomy, Biomedical Center, Ludwig Maximilian University, 4Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.

תקציר

אלקטרופורציה היא שיטת המשך החצייה שבה שדה חשמלי מוחל על תאים כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום התא ולהגדיל את החדירות שלה, ובכך לאפשר למולקולות שונות להיות מוצגים לתא. במאמר זה, אלקטרופורציה משמש כדי להחדיר פלמידים כדי ependymoglial תאים, אשר קו האזור החדרית של המבוגר ביותר הדגים telencephalon. חלק של תאים אלה מראה מאפייני תא גזע ומייצר נוירונים חדשים במוח דג זברה; לכן, לימוד התנהגותם חיוני כדי לקבוע את תפקידם בנוירוגנזה והתחדשות. הקדמה של פלסטלינה באמצעות אלקטרופורציה מאפשרת תיוג לטווח ארוך ומעקב אחר תא ependymoglial יחיד. יתר על כן, פלמידים כגון היצורים recombinase או Cas9 יכולים להיות מועברים לתאים בודדים ependymoglial, אשר מאפשר שילוב גנים או לערוך גנים ומספק הזדמנות ייחודית להעריך את פונקציית הגן האוטונומית של התא בשליטה, טבעי סביבה. בסופו של דבר, פרוטוקול האלקטרופורציה המפורט, שלב-אחר-שלב משמש להשגת הקדמה מוצלחת של פלמידים למספר רב של תאים ependymoglial בודדים.

מבוא

בכדי לבחון התחדשות מוחית. לאחר פציעה בפצע דקירה בהשוואה ליונקים, על הסולם האבולוציוני, מינים מפותחים פחות כגון דג זברה בדרך כלל להציג שיעורי גבוה יותר של נוירוגנזה ואזורים נרחבים של מגורים מבוגרים תא גזע עצבי, המוביל לדור קבוע של נוירונים חדשים ברחבי רוב אזורי המוח בחיים הבוגרים. תכונה זו מופיעה בתיאום עם קיבולת משובי גבוהה באופן משמעותי של דג דג זברה בהשוואה ליונקים1, כמו דג זברה יש פוטנציאל מדהים ליצור ביעילות נוירונים חדשים ברוב מודלים של פגיעה במוח למדו2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה כאן מחקר הדגים הזינצאלון נלמד, שכן הוא אזור מוחי עם נוירוגנזה בולטת בבגרות. אזורים אלה של נוירוגנזה למבוגרים הם הומוולוגי לאזורים נוירוגניים במוח היונקים הבוגרים9,10,11.

שופע באזורים נוירוגניים ב-דג זברה telencephalon נוכחים בשל קיומו של הרדיאלי glia כמו תאים או תאים ependymoglia. Ependymoglial תאים לפעול כתושב תאי גזע עצביים למבוגרים ואחראים על הדור של נוירונים חדשים במוח שלמים ומתחדשות3,5. ניסויים מעקב השושלת הראו כי ependymoglia חדרית להגיב לפציעה, לאחר מכן מתרבים וליצור חדש neuroblasts נמשך להגר לאתר הנגע5. בשל טבעו הטבעי של הדגים הזינצאלון, תאים ependymoglial קו המשטח החדרית ולבנות את הקיר החדרית הגייתי. הקיר הבין-חדרית נוצר על ידי שכבת תא ependymal (איור 1A). וחשוב מכך, דג זברה ependymoglia לגלם את המאפיינים של שני היונקים הרדיאליים והתאים ependymal. תהליכים רדיאליים ארוכים הם תכונה טיפוסית של תאים הרדיאלי של גליה, ואילו הרחבות סלולר וצמתים הדוקים (כמו גם המיקומים החדרית שלהם) הם תכונות טיפוסיות של ependymal תאים12,13,14. לכן, תאים אלה נחשבים לתאים ependymoglial.

כדי לעקוב אחר התנהגות vivo של תאים בודדים ependymoglial במהלך התחדשות, הם צריכים להיות מתויג באופן אמין. שיטות שונות של vivo תא תיוג עבור מיקרוסקופ פלורסנט תוארו בעבר, כגון כתבים אנדוגני או צבע ליפופילית15. שיטות אלה, בניגוד לאלקטרופורציה, עשויות לדרוש פרקי זמן ארוכים יותר ולעתים קרובות אינן מציעות אפשרות של תיוג תאים בודד או מעקב קבוע לטווח ארוך. אלקטרופורציה, עם זאת (מלבד תוויות תא יחיד), מציעה את האפשרות של החדרת DNA חדש לתא המארח. יתר על כן, לעומת שיטות אחרות של העברת DNA לתוך התאים, אלקטרופורציה הוכח להיות אחת השיטות היעילות ביותר16,17,18,19.

מוצג כאן הוא פרוטוקול אלקטרופורציה כי כבר מעודן לצורך תיוג תאים ependymoglial בודדים בתוך המבוגר הדגים telencephalon. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial יחיד כדי לעקוב אחריהם לאורך תקופה ארוכת טווח20 או לטפל מסלולים ספציפיים באופן אוטונומי התא21,22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החיות המשמשות בפרוטוקול זה נשמרו תחת תנאי גידול סטנדרטיים, וניסויים בוצעו על פי הנחיות הטיפול והתקנות של האיחוד האירופי וממשלת בוואריה עילית (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. הכנת תערובת פלאמיד לאלקטרופורציה

  1. לדלל את הפלסטלינה של העניין במים סטריליים ולהוסיף מהיר הירוק פתרון מלאי הכתם [1 מ"ג/mL]. ודא כי הריכוז הסופי של הפלסמיד הוא ∼ 1 μg/μL. להוסיף את הכתם על ריכוז של לא יותר מ 3%, כמו המטרה היחידה שלה היא צבע את הפתרון ולהמחיש הזרקת חדרית.
  2. לאחר הכנת, לערבב את הפתרון פלמיד על ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים או על ידי הקשה אצבע. אחסן בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש.
    הערה: עבור שיתוף אלקטרופורציה של שני פלמידים לתוך אותו תא, להבטיח את הריכוז של כל מרכז בודד בשימוש בתערובת הוא לפחות 0.8 ng/μL עם יחס טוחנת של 1:1 להשיג 80% – 90% שיתוף היעילות.

2. ההכנות להזרקה ולהליך אלקטרופורציה

  1. הכן את נימי הזכוכית (קוטר חיצוני 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ) הכרחי להזרקה במנגנון מושך המחט.
  2. על מנת להזריק את הכמות הנכונה של פלסמיד (ראה לעיל), משוך את הנימים בטמפרטורה של 68.5 ° c עם שני משקולות אור ושני משקלים כבדים (ראו טבלת חומרים למפרטים).
    הערה: במקרה של שימוש בפולר שונה, כיול הקפילר כדי לספק את הנפח המתאים של ערבוב האלקטרופורציה.
  3. להגדיר באופן ידני את התקן ההזרקה ללחץ הזרקה של 200 hPa (על ידי הפעלת כפתור Pi) ולחץ מתמיד של 0 hPa. הגדר באופן ידני את זמן ההזרקה למצב ידני ושלוט בלחץ עם דוושה ברגל.
  4. הגדר את התקן אלקטרופורציה "במצב LV" עם חמישה פולסים ב 54-57 V (25 ms כל אחד עם מרווחי 1). חבר את האלקטרודות להתקן.
  5. הכינו מיכל דגים אחד עם מי דגים נקיים, שם הדגים יתעוררו מהרדמה לאחר הליך האלקטרופורציה. מאוורר את המים על ידי שמירה על אבן האוויר המצורפת למשאבת האוויר למשך תקופת ההחלמה כולה עד שהדג מתעורר במלואו.
  6. קח ספוג מטבח רגיל ולעשות חתך האורך בספוג להחזיק דגים לתוך במהלך ההזרקה והליך אלקטרופורציה (לראות את הפרסום הקודם3).
    הערה: ספוג מטבח צריך לשטוף או להחליף באופן קבוע כדי להסיר כימיקלים רעילים פוטנציאליים.
  7. מניחים כמות קטנה של ג'ל אולטרא סאונד רב תכליתי במיוחד ליד התקנת הזריקה ואלקטרופורציה.
    הערה: הדבר יבטיח מוליכות חשמלית נאותה, וכתוצאה מכך, הפצת תאים אלקטרופורמים בכל הטלנצלון כולו.

3. דג הרדמה מדגים

  1. לפני ההרדמה, להכין פתרון מניות של הרדמה עם 0.2% MS222 במים מזוקקים ולהתאים את ה-pH כדי 7 עם מאגר Tris-HCl. לדלל את המניה 1:10 (כלומר, כדי 0.02% MS222) באמצעות מי דגים.
  2. הכפיש את הדג על-ידי שמירה על הפתרון העובד הזה עד לתנועת הגוף והזימים (בדרך כלל למספר דקות).

4. פלמיד הזרקת פתרון

  1. למלא את נימי זכוכית מוכן עם 10 μL של פתרון פלבאמצע באמצעות טיפים microloader. הימנע היווצרות בועות אוויר בתוך נימי.
  2. הקש על תפריט/שנה נימי בהתקן ההזרקה. להוסיף ולאבטח את המחט לתוך מחזיק המחט.
  3. תחת stereomicroscope עם הגדלה של 3.2 x או 4x, לחתוך רק את קצה הנימים באמצעות מלקחיים בקצה עדין. החלף את מכשיר ההזרקה ממצב נימי למצב הכנסה , לאחר מכן להחיל לחץ עם דוושת הרגל כדי להבטיח את הפתרון הפלמיד פועל בקלות מתוך המחט ללא הפרעה.
  4. להעביר את הדג ממיכל הגידול אל המיכל (פלסטיק תיבת) עם פתרון הרדמה. חכו כמה דקות עד שהתנועה. של הזימים תהיה משנית
  5. מניחים דגים לתוך הספוג שלפני הציפוי, כאשר הצד השני פונה כלפי מעלה. בצע את כל שלבי ההזרקה הבאים תחת stereomicroscope כדי להבטיח את הדיוק של השגרה.
  6. באמצעות ניתוח מיקרו-סכין מפלדת אל-חלד עם 40 mm חיתוך קצה ו 0.5 מ"מ עובי, ליצור חור קטן בגולגולת הדג בצד האחורי של הטלנצאלון (איור 1B), ממש ליד הגבול עם tectum אופטי.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות, שכן החור צריך להיות מאוד קטן ושטחי, חודר אך ורק את הגולגולת, כדי למנוע נזק מוחי.
  7. להטות את הדג לפי הצורך וכוון את קצה נימי הזכוכית לעבר הגולגולת בזווית הנכונה כדי להקל על חדירת הקצה הנימי דרך החור.
  8. הכנס את קצה הנימים דרך החור בגולגולת בזהירות עד שהוא מגיע החדר telencephalic (ראה איור 1B). זה ידרוש חדירה דרך שכבת התא ependymal. להיות זהירים במיוחד לא להכניס את נימי עמוק מדי כדי למנוע מגע עם רקמת המוח. לשמור על נימי בדיוק בין האונות, נשאר בתוך החדר רק לאחר פירסינג השכבה ependymal.
    הערה: . זה צעד מאוד עדין דיוק של הליך זה משופר באמצעות קווי פיגמנטציה מוטציה כגון חצוף24, המאפשר הדמיה טובה יותר של מיקום נימי זכוכית במהלך ההזרקה.
  9. עם עצה נימי בתוך החדר, להזריק את הפתרון פלבאמצע על ידי הפעלת לחץ עם דוושת הרגל על 10 s, אשר מתאים כ 1 μL של פתרון פלמיד.
    הערה: אם שינוי מחטים המחט, נימים או מזרק, המערכת צריך להיות מכויל כדי לספק תמיד 1 μL של פתרון פלבאמצע. ניתן לבצע כיול על-ידי מדידת קוטר ה-droplet הפלגיאני הנפלט לתוך שמן מינרלי (למשל, שמן פרפין) ולאחר מכן חישוב הנפח של ה-droplet. לאחר 10 s של הזרקה, צריך להיות ~ 1 μL של נוזל פלמיד מגורש לתוך שמן מינרלי.
  10. לאשר הצלחה של השלב הקודם על ידי התבוננות התפשטות של נוזל בכל החדר.

5. אלקטרופורציה

  1. הסר את הדג מתוך הגדרת הזריקה תוך שהוא עדיין מחזיק אותו בספוג.
  2. לטבול את הצד הפנימי של קצה האלקטרודות ג'ל אולטרסאונד.
  3. מכסים את הדג טלנצאלון עם כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד.
  4. מקמו את ראש הדג בין האלקטרודות, ממקמים את האלקטרודה החיובית בצדו הגחוני של ראש הדג ואת האלקטרודה השלילית שבצד השני (איור 1C), תוך שהיא עדיין מחזיקה את גוף הדג בספוג. זה מגדיר את הכיוון של הזרימה הנוכחית של הצורך electroporate ependymoglia ממוקם באזור subventricular.
  5. לחץ על האלקטרודות בעדינות ובדיוק נגד הטלנצאלון (איור 1C). . הזרם עם דוושת הרגל החזיקו את האלקטרודות במקום עד לסיום כל חמשת הפולסים.

6. שחזור דגים

  1. בואו הדג להתאושש במיכל מוכן בעבר, גז ברציפות עד שהוא מתעורר. ג'ל לידוקאין יכול להיות מיושם על הגולגולת כדי להקל על כל כאבים שפותחו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטת האלקטרופורציה המתוארת מאפשרת אספקת דנ א פלמיד לתוך ependymoglial תאים, אשר נמצאים באופן שטחי ביותר בתוך הטלודג הזינצאלון ומתחת לשכבת התא הependymal (איור 1A).

אם תוצאת האלקטרופורציה חיובית, הנקראת ependymoglial תאים בודדים (תאים אדומים באיור 2a, b) ניתן לצפות בין תאים ependymoglial אחרים (לבן באיור 2a, b). בהתאם ליעילות של תהליך האלקטרופורציה, ייתכן שתווית גבוה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול אלקטרופורציה זו הוא שיטה אמינה בvivo לתיוג תאים בודדים ependymoglial. הפרוטוקול עשוי להזדקק לעיבוד נוסף כדי לתייג סוגי תאים אחרים כגון נוירונים או oligodendrocytes הפוך. כדי להשיג תוויות מוצלחות, ניתן להשתמש בפלמידים המכילים היזמים שונים. עוף בטא אקטין מיזם, eF1alpha, cmv ו מקדם אוביקוויב השתמשו בעבר כדי לכונן את הביטוי של טרנסגנים שונים ependymoglia ואת צאצהם23. עם זאת, קינטיקה שונה של ביטוי טרנזגנטי נצפתה אשר יש לקחת לתוך החשבון. לדוגמה, ביטוי טרנזגנטי מונחה של מקדם המקדם של CMV הוא מהי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

תודות מיוחדות לג Copti לעריכת כתב היד. אנו גם מממנים בהכרת תודה ל JN מקרן המחקר הגרמני (DFG) על ידי SFB 870 ו SPP ניתוח אינטגרטיבי של Olfaction "ו SPP 1738" תפקידים מתעוררים RNAs ללא קידוד בפיתוח מערכת העצבים, פלסטיות & מחלה ", SPP1757" Glial טרוגניות ", ואסטרטגיית מצוינות במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה מערכות (EXC 2145 סינרגיה-ID 390857198).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מגיב / חומר< / חזק>
מהירירוק סיגמא-אולדריץ'F7258-25Gלצביעת תמיסת פלסמיד
MS222Sigma-AldrichA5040-25GMS222 יש לאחסן ב- RT (עד שבועיים) ולהגן מפני
אור ג'ל אולטרסאונדSignaGel, מעבדות פרקר בע"מ.15-60אלקטרודה ג'ל
<חזק>ציוד
TetraTec APS 50, 10l-60lניתן לקנות בחנויות לחיות מחמד
BTX פינצטה אלקטרודותפלטינה פינצטה, BTX הרווארד מכשיר45-0486קוטר 1 מ"מ
מכשיר אלקטרופורציהBTX ECM830 גל מרובע, BTX הרווארד מכשיר45-0662
מכשיר הזרקהFemtoJet 4i, Eppendorf5252000013
קיר סטנדרטי זכוכית נימיתWarner Instruments64-0766מספר דגם: G100-4
קצות מיקרו-מטעןEppendorf5242956003
מיקרו-סכיןFine Science Tools10056-12
מיקרומניפולטורג'ויסטיקNarishige JapanMN - מחזיק מחט 151
FemtoJet 4i, מחזיק מחט Eppendorf5252000013מגיע יחד עם מכשיר ההזרקה
מכשיר משיכת מחטNarishige יפןמספר דגם: PC-10ה-PC-10 הופסק על ידי Narishige בשנת 2017 והוחלף על ידי צלחות PC-100
PetriGreiner Bio-One International633161
אוויר חזקה

מקורות

  1. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
  2. Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
  3. Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
  4. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  5. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  6. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
  7. Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
  8. Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
  9. Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
  10. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  11. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
  12. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  13. Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).
  14. Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
  15. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  16. Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
  17. Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
  18. Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
  19. Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
  20. Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
  21. Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
  22. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).
  23. Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
  24. Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
  25. Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
  26. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  27. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
  28. Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

החדרת DNA פלסמיתאי אפנדימוגליאלסימון תאיםעריכה גנטיתהזרקה נימיריתג'ל אולטרסאונדדוושהסטריאומיקרוסקופ
שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.