הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60083

⸱

17 במרץ 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

תקציר

השתלת מח עצם אלוגנאית (BMT) הוא טיפול יעיל עבור ממאירות המטולוגית בשל השפעת השתל נגד לוקמיה (GVL) האפקט לבער גידולים. עם זאת, היישום שלו מוגבל על ידי פיתוח של השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD), סיבוך גדול של BMT. GVHD היא עוררה כאשר T-תאים ב שתלי התורם העצמית המתבטאת באמצעות התאים הנמען ולטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות בריאות הנמען. לפיכך, טיפולים מסורתיים נועדו לדכא את כל פעילות ה-T-cell של התורם. עם זאת, גישות אלה פוגעות באופן משמעותי באפקט GVL כך שהישרדותו של הנמען אינה משופרת. הבנת ההשפעות של גישות טיפוליות על BMT, GVL, ו-GVL, כך חיוני. בגלל האנטיגן-הצגת ו cy, הפרשה יכולות לעורר את התורמים T-תאים, תאים דנדריטים הנמען (DCs) לשחק תפקיד משמעותי אינדוקציה של GVHD. משום כך, מיקוד בקרי תחום של נמענים הופך לגישה פוטנציאלית לשליטה ב-GVHD. עבודה זו מספקת תיאור של פלטפורמת BMT הרומן לחקור כיצד DCs מארחים להסדיר את התגובות גבול ו GVL לאחר ההשתלה. הציג גם מודל BMT יעיל ללמוד את הביולוגיה של GVHD ו GVHD לאחר ההשתלה.

מבוא

שיטת השתלת תא גזע המטמית (bmt) היא טיפול יעיל לטיפול בממאירות המטולוגית1,2 דרך השתל-נגד לוקמיה (gvl) אפקט3. עם זאת, לימפוציטים התורם תמיד לטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות הנמען, תהליך הנקרא השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD)4.

מודלים murine של GVHD הם כלי יעיל כדי ללמוד את הביולוגיה של GVHD ואת תגובת GVHD5. עכברים הם מודל חסכוני בחיות מחקר. הם קטנים וביעילות עם מולקולות ומוצרים ביולוגיים בשלבים מוקדמים של פיתוח6. עכברים הם חיות מחקר אידיאלי למחקרים גנטיים מניפולציה כי הם מוגדרים היטב גנטית, אשר אידיאלי עבור לימוד מסלולים ביולוגיים ומנגנונים6. מספר העכבר הגדול ביותר מורכב היסטולתאימות (mhc) mhc-מודלים לא תואמים של gvhd הוקמה היטב, כגון C57BL/6 (h2ב) כדי balb/c (h2d) ו fvb (h2q) → C57BL/6 (h2ב)5,7. אלה הם דגמים יקרי ערך במיוחד כדי לקבוע את התפקיד של סוגי תאים בודדים, גנים, וגורמים המשפיעים על GVHD. השתלת מ C57/BL/6 (H2ב) תורמים הורים לנמענים עם מוטציות ב mhc I (B6. c-H2bm1) ו/או Mhc II (B6. c-H2bm12) חשף כי אי התאמה הן בכיתה mhc i ו-class ii היא דרישה חשובה להתפתחות של gvhd חריפה. זה מרמז כי הן CD4+ ו CD8+ T-תאים נדרשים להתפתחות המחלה7,8. Gvhd הוא גם מעורב במפל דלקתי המכונה "הפרו-דלקת ציטוקינים" סערה9. שיטת המיזוג הנפוצה ביותר במודלים murine היא הקרנה מוחלטת של הגוף (TBI) על ידי X-ray או 137Cs. הדבר מוביל לאבלציה של המטופל, ובכך מאפשר לתאי גזע של תורם להתחשבן ולמנוע דחייה של השתל. פעולה זו מתבצעת על-ידי הגבלת ההתפשטות של תאי T של הנמען בתגובה לתאי תורם. בנוסף, הפערים הגנטיים ממלאים תפקיד חשוב באינדוקציה למחלות, שתלויה גם באי-התאמה משנית של MHC10. לכן, מינון myeloablative הקרנה משתנה בזנים שונים של העכבר (g., BALB/c → C57BL/6).

הפעלת תאים T-בתאי התורם על ידי מארח אנטיגן הצגת תאים (APCs) חיוני עבור פיתוח GVHD. בין ה-APCs, התאים הדנדריטים (DCs) הם החזקים ביותר. הם בעלי יכולת לספק GVHD בשל ספיגת אנטיגן מעולה שלהם, ביטוי של T-cell שיתוף מולקולות, והפקה של ציטוקינים pro-דלקתיים המיקטט T-תאים לתוך מערכות המשנה הפתוגניים. בקרי תחום של נמענים הם קריטיים להקלה על הטרמה של תא T והשראה לאחר השתלת11,12. בהתאם לכך, DCs הפכו למטרות מעניינות בטיפול ב-GVHD12.

נדרש TBI כדי להגביר את התיאום של תא התורם. עקב האפקט TBI, Dc DCs מופעלים ולשרוד זמן קצר לאחר ההשתלה12. למרות הפיתוחים העיקריים בשימוש בביולומינציה או בזריחה, הקמת מודל אפקטיבי לחקר התפקיד של בקרי התחום של הנמענים ב-GVHD עדיין מאתגרת.

מכיוון T-cell התורם הם כוח המניע של פעילות GVL, אסטרטגיות טיפול באמצעות תרופות מדכאים חיסוני כגון סטרואידים כדי לדכא את הפעילות alloreactivity לעתים קרובות לגרום להישנות הגידול או זיהום13. לכן, בקרי תחום של נמענים עלולים לספק גישה חלופית לטיפול ב-GVHD תוך שמירה על האפקט של GVHD והימנעות מהידבקות.

בקצרה, המחקר הנוכחי מספק פלטפורמה כדי להבין כיצד סוגים שונים של איתות בקרי Dc של נמענים מסדיר פיתוח GVHD והאפקט GVHD לאחר BMT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת מרכז פלורידה.

1. האינדוקציה GVHD

הערה: מח עצם Allogeneic (BM) השתלת תא (שלב 1.2) מבוצעת בתוך 24 שעות לאחר ההקרנה. כל ההליכים המתוארים להלן מתבצעים בסביבה סטרילית. לבצע את ההליך במכסה התרבות רקמה להשתמש ריאגנטים מסוננים.

  1. יום 0: הכן את עכברי הנמען.
    1. השתמש בסוג פראי נקבה (WT) עכברים על רקע BALB/c (CD 45.2+ H2kd +), 10 לפחות 12 שבועות הישנים כנמענים.
    2. תייג את האוזן ושקול את הנמענים לפני TBI. ואז, למקם עד 11 עכברים בחדר ההקרנה ולשמור אותו בתוך הסקה. הקרינים במנה אחת של 700 cGy במשך 10 עד 15 דקות.
    3. החזר בעלי חיים שעברו הקרינה לכלובים והבית אותם במתקנים ללא פתוגן לפני ההשתלה.
      הערה: משקל הגוף המינימלי של הנמענים צריך להיות בסביבות 20 גר'. השתמש במשקל זה כאסמכתא לחישוב אובדן משקל הגוף במהלך התקופה הניסיונית.
  2. יום 1: הכנת מח עצם מרוקן T (TCD-BM) מעכברי התורם.
    1. המתת חסד CD 45.1/Ly 5.1 C57BL/6 עכברים על ידי CO2 חנק ולחכות 2 עד 3 דקות עד שהם מחוסר הכרה. לבצע פריקה צוואר הרחם כמו המתת חסד משנית אם יש צורך.
    2. לשים כל עכבר על לוח עבודה נקייה. בעזרת הפרווה והעור עם 70% איזופנול.
    3. לאסוף את השוקה ואת הירך משתי הרגליים באמצעות מלקחיים ומספריים. שים אותם בקרח קר RPMI המכיל 1% FCS ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ו 2 מ"מ L-גלוטמין (1% RPMI) ב 50 מ"ל צינורות חרוט. נקה את עצם הירך ואת עצמות השוקה ביסודיות על ידי הסרת כל רקמות השריר באמצעות מלקחיים ומספריים. העבר את עצם הירך ואת שוקה מן 50 mL מצינורות חרוט לצלחת פטרי 92 מ"מ המכיל 1% RPMI.
    4. באמצעות מספריים, חותכים את קצות עצם הירך או השוקה. מילוי שפופרת 50 mL עם 25 מ ל של 1% RPMI 1640 בינונית. השתמש באפשרות זו כדי למלא 3 מזרק mL מוצמד מחט G 26 עם 3 מ ל של 1% RPMI. הכנס מזרק זה לתוך העצם ולדחוף את הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם (BM) מתוך חלל לתוך צינור האוסף עם 1% RPMI (~ 3 mL/עצם).
    5. חזור על השלב 1.2.4 עבור כל עצמות שוקה ועצם הירך שנותרו מעכברים תורמים אחרים. לשמור את כל צינורות האוסף על הקרח.
    6. הפוך את התא הבולם היחיד על ידי שטיפה של פיסות מח העצם באמצעות מסננת תא 75 יקרומטר. לאסוף את ההשעיה התא בודד בצינור 50 mL.
    7. צינורות צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מנושף ומוותר על הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב-PBS מאגר המכיל 0.5% בסרום בקון (BSA) ב 20 x 106 תאים/mL. שמור הנורית של 2 x 106 תאים עבור כתמים טוהר.
    8. הוסף את 1 הנוגדן שלך ב 0.05 μg/106 תאים14 ו-דגירה עבור 30 דקות ב 4 ° c. התרחץ פעם אחת עם 25 מ ל בקרח קר. השעיה מחדש ב 20 x 106/ml ב 0.5% bsa/10% ארנב צעיר משלים/2% DNase (10,000 U/mL ב-H סטרילי2O). מודטה עבור 45 דקות ב 37 ° צ' ולשטוף 2x כמו לפני.
      הערה: תאי T מרוקנים באמצעות mAb ספציפי עבור Thy1, חלבון המבוטא על ידי כל T-תאים, אבל לא אחרים לוקיציטים.
    9. השהה מחדש את התאים ב-20 מ ל של מאגר PBS המכיל 0.5% BSA. לספור את התאים מח העצם ב 1% חומצה אצטית באמצעות הומוציטוטומטר. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים עבור בדיקת טוהר ידי הזרמת cy, לאחר טיהור תאים.
      הערה: עכבר תורם אחד בדרך כלל מייצר כ 25 x 106 TCD-BM.
    10. השתמש cy, לנסות לאשר מחסור מוצלח תא T. כתם 1 x 106 תאים, נשמר משלבים 1.2.7 (לפני המחסור t-cell) ו 1.2.9 (tcd-BM לאחר דלדול t-cell) עם נוגדנים הבאים: α-CD3 (17A2), α-CD4 (gk 1.5), ו α-CD8α (53-6.7).
  3. יום 1: הכנת תאי T מעכברי התורם
    1. השתמש ב45.2 CD+ H2kb + C57BL/6 מסוג פראי (WT) כתורמים לתאי T.
    2. המתת חסד C57BL/6 עכברים על ידי פחמן דו חמצני (CO2) חנק כפי שמתואר בשנת 1.2.1.
    3. לנקות את הפרווה ואת העור של העכבר ביסודיות עם 70% אתנול. כבלו טחולים ובלוטות הלימפה ולהפריד אותם לתוך תא אחד הבולם של הטחול באמצעות מזרק במזרק ו 40 יקרומטר רשת שינוי. לשטוף את מסננת ואת המזרק עם 1% RPMI (1% FBS המכיל מדיה RPMI) כדי לאסוף את כל הטחול.
    4. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הוסף 5 מ ל של מאגר ACK ליסינג (1 מ"מ Na2edta, 10 מ"מ khco3, 144 mm NH4Cl, pH 7.2) לאחר מחיקת supernatant. מודקון תא ההשעיה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: מאגר הליזה ACK משמש ללישר כדוריות דם אדומות.
    5. הוסף 5 מ ל של 1% RPMI להפסיק את הליזה. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    6. הכן קרח קר מגנטי המופעל מיון תא (מקינטוש) מאגר (0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ב PBS, pH 7.2). דגה את המאגר לפני השימוש. השהה מחדש את כדורי התא ב-5 מ ל של מאגר מקינטוש.
    7. לספור את הטחול ולבדוק את התאים החיים והמתים באמצעות הומוציטומטר ו 1% טריקון כחול. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים כדי להעריך את תפוקת הטיהור עם הזרימה cy, לנסות לנתח.
    8. השהה מחדש את הטחול בריכוז של 200 x 106/mL במאגר מקינטוש. הוסף 0.03 μl של ביוטין נגד עכבר-Ter-119, 0.03 μl של ביוטין נגד עכבר-CD11b, 0.03 μl של ביוטין נגד העכבר-CD45R, ו-0.03 μl של ביוטין נגד עכבר-DX5לכל 10 תאים . דגירה של 15 דקות ב-4 ° c.
      הערה: ביוטין נגד עכבר-Ter-119, ביוטין נגד עכבר-CD11b, ביוטין נגד עכבר-CD45R, ו ביוטין נגד עכבר-DX5 שימשו כדי להגיב עם אריתרופואיד, גרנולוציטים, B-תאים, ו-NK תאים בהתאמה. לפיכך, ערכות המשנה של תאים אלה מרוקנים את השלב הבא בצעד15.
    9. הוסף 10 מ ל של מאגר מקינטוש קר-קרח להשעיה של התא. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    10. השהה מחדש את כדורי התא במאגר מקינטוש בריכוז של 100 x 106/Ml. הוספת מיקרוחרוזי אנטי-ביוטין (0.22 μL/106 תאים) עד לה, השעיית הטחול. מערבבים היטב ומשלבים תוספת של 15 דקות ב -4 ° c. לשטוף את ההשעיה התא פעם עם 10 מ ל של מאגר מקינטוש קר קרח. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהיפטר supernatant.
    11. שים טור מגנטי מפריד. בשדה המגנטי לשטוף את העמודה עם 3 מ ל של מאגר מקינטוש. שחרר את ההשעיה של התא על העמודה. לאסוף את הזרימה-דרך המורכבת של T מאוגדים, מועשר בתאי טי, בצינור חדש 15 mL חרוט. לשטוף את עמודת MS עם 3 מ ל של מאגר מקינטוש קר קרח.
      הערה: ודא שהעמודה ריקה לפני ביצוע שלבי הכביסה.
    12. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-5 מ ל של מאגר מקינטוש.
    13. ספור את התאים ב-1% טריקון כחול באמצעות הומוציטומטר. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים עבור בדיקת טוהר על ידי הזרימה cy, לנסות.
      הערה: התשואה הממוצעת של תאי T-הטחול מבודדים בשיטה זו היא ~ 20/25 x 106 תאים לכל עכבר.
    14. אשר את התשואה של העשרה תא T על ידי הזרימה cy, לנסות. כתם 1 x 106 תאים, נשמר משלבים 1.3.7 (לפני המחסור t-cell) ו 1.3.13 (tcd-BM לאחר דלדול t-cell), עם נוגדנים הבאים: α-CD3 (17A2), α-CD4 (gk 1.5), ו α-CD8α (53-6.7).
  4. יום 1: הכנס עכברים שעברו הקרינה עם תאי T עם תורם ו-TCD-BM.
    1. שטוף את ה-TCD-BM ו-T-תאים 2x עם PBS (800 x g עבור 5 דקות ב -4 ° c). השהה מחדש את התאים. בערוץ הקרח הקר להזרקה כוונן את ריכוז התא ל-20 x 106/ML עבור TCD BM ו-4 x 106/mL עבור תאי T.
    2. מחממים את החיה באמצעות מנורת חימום כדי להגדיל את הניראות של הורידים הדו. במידת הצורך, הצב את העכבר בתוך הרסן.
    3. נקה את פני השטח של הזנב באמצעות 70% איזופנול. הכנס את TCD-BM (5 x 106 תאים/עכבר) עם או בלי T-תאים (0.75 x 106 תאים/עכבר). להיזהר לא להחדיר שום אוויר לתוך המזרק.
    4. להסיר את המחט ולהחיל משטח חיטוי ישירות לאתר ההזרקה 5-10 על מנת לעצור דימום.
  5. הערכת GVHD בימים 2 עד 80.
    1. . לעקוב אחר הישרדות החיות ניטור הסימנים הקליניים של GVHD מותאם ממערכת הבקיע שהוקמה בעבר על ידי קוק ואח '16 ואת משקל הגוף של עכברי הנמען 2x בשבוע. השתמש במשקל הגוף שנקבע לפני TBI כדי לחשב את אובדן משקל הגוף.
    2. שוקלים כל עכבר בנפרד. ציון ירידה במשקל כדלקמן: כיתה 0 = פחות מ 10%; כיתה 1 = 10%-20%; כיתה 2 = יותר מ 20%.
    3. ציון סימן התנוחה של הנמענים: כיתה 0 = ללא תחושת בטן; כיתה 0.5 = תחושת בטן קלה אך מיישר בעת הליכה; כיתה 1 = בעל חיים נשאר מתחת לרגל; כיתה 1.5 = בעל חיים אינו מתיישר; כיתה 2.0 = בעל חיים לעמוד על הבהונות האחוריות.
    4. ציון הסימן הניידות של הנמענים: כיתה 0 = פעיל מאוד; כיתה 0.5 = איטי יותר מאשר עכברים תמימים; כיתה 1.0 = מהלכים רק בזמן שהוא מתקע; כיתה 1.5 = מהלכים מעט כאשר הם השתקע; כיתה 2.0 = לא זז כאשר התקע.
    5. ציון העור של הנמענים: כיתה 0 = אין שריטות, נגעים או שינוי גודל; כיתה 0.5 = אדמומיות באזור ספציפי אחד; כיתה 1 = שחיקה באזור אחד או שחיקה קלה בשני אזורים; כיתה 1.5 = שריטות חמורות בשני אזורים או יותר; כיתה 2.0 = שריטות חמורות, פיצוח עור, דם יבש.
    6. ציון הפרווה של הנמענים: כיתה 0 = אין סימנים חריגים; כיתה 0.5 = מחפר בצד הבטן או העורף של הצוואר, כיתה 1.0 = מעבר או צד של הבטן והצוואר; כיתה 1.5 = פרווה מוזנחת ומרופאת; כיתה 2.0 = פרווה מלאה בבטן ובגב.
    7. ציון השלשול של הנמענים: כיתה 0 = ללא שלשול; כיתה 0.5 = שרפרף קל ועדין; כיתה 1.0 = מתון (שרפרף צהוב); כיתה 1.5 = מתונה (שרפרף צהוב עם מעט דם); כיתה 2 = חמור (צהוב בהיר שרפרף דמים, "שרפרפים העוגה מיובשים" מופיעים באזור אנאלי).

2. השתלת מודל

  1. יצירת מח עצם הנגזרים הדנדריטים תאים (BM-DCs).
    1. לבודד מח עצם מן המוח ואת tibias של WT או פקטור B (פנסיון מלא)-/- עכברים על רקע B6 כפי שמתואר בשלבים 1.2.3-1.2.4. לסובב את התאים ב 800 x g עבור 5 דקות.
    2. להשעות את הגלולה ב 5 מ ל של מאגר ליסינג ACK לפירוק תא דם אדום. מודקון תא ההשעיה עבור 5 דקות על הקרח. הוסף 10 מ ל של 1% RPMI ההשעיה התא לעצור את הליזה ואת צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    3. השהה מחדש את כדורי התא 10 מ ל של מדיית התרבות (RPMI 1460 המכיל 10% FBS, 100 U/mL של פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ l-גלוטמין, ו 50 mM β-mercaptoethanol) ולהתאים את עוצמת הקול כדי לעמוד בריכוז הסופי של 2 x 106 תאים/mL.
    4. הוסף 20 ng/mL מקרופאג המושבה-מגרה גורם ממריץ (GM-שדרתי) להשעיה התא. התרבות התאים מח העצם ב 100 x 15 מ"מ מנות פטרי ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור 6 ימים.
    5. החלפת מחצית מדיית התרבות המתמשכת (כ-5 מ"ל) עם מדיה טרייה המכילה 40 ng/mL GM-שדרתי ביום 3.
    6. חמם את מדיית התרבות באמבט מים ב-37 ° c. לאסוף כ 5 מ ל של התקשורת מתוך מנות תרבות מח העצם. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה בתוך 5 מדיית תרבות של mL המכילה 40 ng/mL GM-שדרתי.
    7. הוסף 25 μg/mL ליפופוליד (lps) למדיה ביום 6 של התרבות כדי להבשיל את ה-BM-DCs. שמור סדרת מחלקים של 2 x 106 תאים כדי לקבוע את היעילות DC בידול על ידי הזרימה cy, try.
    8. לאסוף מתבגר בקרי DCs: להשתמש בתאים לשפשף בעדינות בקרי בדים מתוך מנות פטרי. לאסוף את כל השעיות התא בצינורות חרוט 50 mL. צנטריפוגה ב 800 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט לשטוף את כדורי 3x תא עם 50 mL של הקרח קר PBS. שמור על 2 x 106 מוניטור-בקרי עבור ניתוח האימונוולוגית על ידי זרימה cy, לנסות.
  2. לבצע שיתוף השתלת תא דנדריטי של BMT (DC-coמשתלת BMT).
    הערה: השתמש בעכברים FVB (H2kq) כתורמים לתאי T ו-BM. הקרין B6 בלבד 5.1 עכברים הנמען במינון של 1,100 cGy (2 מנות, 3 h מרווח). ראה פרטים בשלב 1.1.
    1. בודד BM מ עצמות ו הטייה של עכברים התורמים fvb. ראה פרטים בצעדים 1.2.3-1.2.10.
      הערה: השתמש במח העצם הבודד הכולל במקום TCD-BM במודל זה.
    2. טיהור תאים מתוך הבלוטות ובלוטות הלימפה של העכברים התורמים FVB. ראה פרטים בשלבים 1.3.1-1.3.13.
    3. הכנס BM (5 x 106/עכבר), T-תאים (0.5 x 106/עכבר) עם BM-DCs (2 x 106/עכבר) ביום 0 של הקורס ניסיוני.
    4. ביום 3 לאחר ההשתלה, לבחון את החוקה החדש של DC התורם על ידי הזרמת cy, try.
      1. לאסוף דם מעיני הנמענים.
      2. שאיפת התקליטור ה45.1/Ly 5.1 באופן מידי 3% השאיפה לאינהלציה. בדקו את עומק ההרדמה. על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן
      3. מניחים צינור ניקוי זכוכית סטרילית ב canthus האמצעי של העין בבימויו של מונחה בזווית 30-45 ° מהמטוס של האף. הפעילו לחץ תוך כדי שאתם מסתובבים בעדינות בצינור.
      4. שחרר את הדם לתוך 10 μL הפארין-המכילה צינורות מיקרוצנטריפוגה סטרילית 1.5 mL. העבר 50 μL של דם לתוך 5 שפופרות זרימת זכוכית mL.
      5. הוסף 2 מ ל של מאגר ליסינג ACK. מודקון ב 37 ° c באמבט מים עבור 45 דקות. הוסף 2 מ ל של מאגר מכתים של FACS. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
      6. השהה מחדש את כדורי התא עם 200 μL של מאגר FACS המכיל את הזרימה המתאימה נוגדנים מכתים (חיים/מוות צהוב, α-H-2Kb, α-cd 45.1, α-cd 45.2, α-CD11c, ו α-MHCII). המשך 15 דקות ב -4 ° c בחשכה. שטוף 2x עם מאגר FACS 1 mL. השהה מחדש את כדורי התא ב-200 μL של מאגר FACS ובצע את הניתוח באמצעות הזרמת cy, try.

3. GVHD/GVHD מודלים של BMT

  1. ביצוע האינדוקציה GVHD/GVHD.
    1. תרבות the לוציפראז התמרה לימפומה של תא ב-A20 בתקשורת התרבות RPMI.
    2. הקרינה BALB/c רקע WT או Ly 5.1 הנמען ב 700 cGy (מנה אחת). ראה פרטים בשלב 1.1.
    3. בידוד TCD-BM מהמורס והטיטיה של B6. . עכברים תורמים באופן אנוכי ראה פרטים בשלבים 1.2.1-1.2.10.
    4. לטהר את התאים מפני טחולים ובלוטות הלימפה של העכברים תורם C57BL/6. ראה פרטים בצעדים 1.3.1-1.3.15.
    5. לשטוף את לימפומה A20 2 x עם 25 מ ל של PBS. השהה מחדש את כדורי התא ב -10 מ ל. של הערוץ הקרח הקר קח השעיה תא (10 μL) ולספור את התאים באמצעות 1% טריקון כחול ו-הומוציטומטר. כוונן את ריכוז התא ל-20,000 תאים/mL.
    6. הכנס TCD-BM (5 x 106/עכבר) עם או בלי T-תאים (0.75 x 106/עכבר) ו A20 לימפומה (5,000 תאים/עכבר).
    7. מעקב על הישרדות הנמען, שלטים קליניים GVHD, וירידה במשקל הגוף במהלך הקורס הנסיוני. ראה פרטים בשלב 1.5.
  2. ביצוע הדמיה ביולומי,
    1. נטר את צמיחת הגידול בנמען על-ידי הזרקת עכברי הנמען עם 4 מ ג של D-לluciferin. דגירה עבור 5 דקות כדי להבטיח לוספרין מגיב עם לוספרין.
    2. הורד את העכבר באמצעות 3% isofליקאן בחדר של ביולומינסנציה ודימוי הנמענים עבור 5 דקות בשדה D וזמן החשיפה של 1 דקות.
    3. ניתוח נתונים באמצעות תוכנות לניתוח תמונות. שינוי קנה המידה של תמונות צבע מדומה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
      הערה: כל התמונות חייבות להיות באותה מידה על פני ניסויים.
    4. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לקבוע את אזורי הריבית ולכמת את צפיפות האות על ידי חישוב שטף (פוטונים/s) להיות נפלט מכל אזור של עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ה-MHC הגדול-לא תואם B6 (H2kb)-balb/C (H2kd) מודל התכתב היטב לפיתוח gvhd לאחר ההשתלה (איור 2). כל ששת הסימנים הקליניים GVHD שנקבעו בעבר על ידי קוק ואח '16 אירע הנמענים המושתלים עם WT-B6 T-תאים, אבל לא הנמענים מושתלים עם BM לבד (שלב 1.5), אשר ייצגו את הקבוצה gvhd-שלילי. קיימים שני שלבים בפיתוח ה-GVHD במודל זה. ראשית, שיא החומרה הוא כ 11 ימים לאחר ההשתלה, ואחריו ירידה בתוצאות הקליני התאוששות משקל הגוף עד 16 ימים. בשל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השימוש בתאי גזע להתאים אדם מסוים היא גישה יעילה לטיפול בסרטן מתקדם ועמיד18. תרופות מולקולה קטנה, עם זאת, נותרו זמן רב המוקד העיקרי של טיפול בסרטן אישית. מצד שני, בטיפול הסלולר המון אינטראקציות בין התורמים והמארחים יכולים להשפיע באופן מוחלט על תוצאות הטיפול, כגון פיתוח של GVHD לאחר BMT1.

רס ן MHC לא תואם מודלים העכבר של BMT הם כלי רב ערך בהבנת הביולוגיה של GVHD ובדיקת היעילות של תרופות בטיפול שלה. ביניהם, C57BL/6 (h2ב) כדי balb/c (h2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה המכללה לרפואה סטארט-up מענק (כדי HN), אוניברסיטת פיטסבורג מרכז רפואי הילמן מרכז הסרטן להתחיל מענק (כדי HL), ארצות הברית NIH מענק #1P20CA210300-01 ו-ויאטנמית משרד מענק בריאות #4694/QD-BYT (כדי PTH). אנו מודים ד ר Xue-zhong יו באוניברסיטת הרפואית של דרום קרוליינה עבור מתן חומרים למחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA pH 8.0 100 מ"לפישר סיינטיפיקBP2482100מאגר MACS
10X PBSפישר סיינטיפיקBP3994מאגר MACS
A20 לימפומה של תאי Bאוניברסיטת מרכז פלורידהניסוי GVLבבית
ACC1 fl/flמעבדת ג'קסון30954ניסוי GVL
ACC1 fl/fl CD4creאוניברסיטת מרכז פלורידהניסוי GVL
אנטי-ביוטין מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec130-090-485העשרת תאי T
אנטי-אדם/עכבר CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85העשרת תאי T
נגד עכבר B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85ניתוח ציטומטריית זרימה
נגד עכבר CD11c-AF700Thermo Fisher Scientific117319ניתוח ציטומטריית זרימה
אנטי עכבר CD25 PEתרמו פישר סיינטיפיק12-0251-82מכתים זרימה
נגד עכבר CD4 ביוטיןתרמו פישר סיינטיפיק13-0041-86העשרת תאי T
נגד עכבר CD4 eFluor® 450 (פסיפיק כחול® תחליף)תרמו פישר סיינטיפיק48-0042-82מכתים זרימה
נגד עכבר CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83ניתוח ציטומטריית זרימה
Anti-Mouse CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83ניתוח ציטומטריית זרימה
נגד עכבר H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82ניתוח ציטומטריית זרימה
נגד עכבר MHC Class II נוגדן APCThermo Fisher Scientific17-5320-82ניתוח ציטומטריית זרימה
Anti-Mouse TER-119 BiotinThermo Fisher Scientific13-5921-85העשרת תאי
T Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM דור
B6 fB-/- עכבריםאוניברסיטת מרכז פלורידהבביתמקבלי
B6. Ly5.1 (CD45.1+) עכבריםצ'ארלס ריבר564תורמים
עכברי BALB/cצ'ארלס ריבר028מושתלים
C57BL/6 עכבריםצ'ארלס ריבר027תורמים/מקבלי
CD11bתרמו פישר סיינטיפיק13-0112-85העשרת תאי T
CD25-ביוטיןתרמו פישר סיינטיפיק13-0251-82העשרת תאי T
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82העשרת תאי T
CD49b נוגדן חד שבטי (DX5)-ביוטיןThermo Fisher Scientific13-5971-82העשרת תאי T
מסננת תאים 40 uMThermo Fisher Scientific22363547הכנת תאים
מסננת תאים 70 uMThermo Fisher Scientific22363548הכנת
תאיםD-LuciferinGoldbioLUCK-1Gהדמיית בעלי חיים
חיים סרום בקר עוברי (FBS)אטלנטה ביולוגיה מו"פ מערכת DD17051
צינורות ציטומטריית זרימת תרבית תאיםפישר סיינטיפיק352008ניתוח ציטומטריית זרימה
FVB/NCrlצ'ארלס ריבר207תורמים
ליפופוליסכריד (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC
עמודת LSMitenyi Biotec130-042-401הכנת תאים
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302העשרת תאי T
חממת ניו ברונסוויק גלקסי 170Rאפנדורףגלקסי 170 Rתרבית תאים
פניצילין + סטרפטומיצין פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יחידות פניצילין / 10,000 מ"ג / מ"ל סטרפטוקוקוק)GIBCO15140מדיה
RPMI 1640תרמו פישר Scienctific11875-093מדיה
TER119תרמו פישר מדעי13-5921-82העשרת תאי T
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200הדמיית בעלי חיים
חיים X-RAD 320 Biological IrradiatorPrecision X-RAYX-RAD 320הקרנת גוף כוללת
בוגר

מקורות

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006(2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417(2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

graft versus leukemiaTFactor BMHCA20
עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.