מאמר שיטה

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

DOI:

10.3791/60102

⸱

7 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניידות המסה-הספקטרומטר ההמוני וטכניקות הדוגמנות המולקולריות ניתן לאפיין את ביצועי המתכת הסלקטיבית של הפפטידים העשויים מתכת-כריכה ומתיונין-הנחושת המטאוקובטין. פיתוח מחלקות חדשות של פפטידים מתכת הכלפת יסייע להוביל לtherapeutics עבור מחלות הקשורות באיזון מתכת ביון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electrospray אינון (ESI) יכול להעביר פפטיד מימית בשלב מורכב או פפטיד לשלב הגז תוך שימור מסה שלה, המטען הכולל, מתכת-מחייב אינטראקציות, וצורה הקונפורמציה. מצמד ESI עם ניידות-המסה (IM-MS) מספק טכניקה אינסטרומנטלית המאפשרת מדידה בו של מסת המסה של פפטיד (m/z) וחתך התנגשות (סמ ק) המתייחסים לסטואיצ'ימטריה שלה, פרוטונציה state, ובצורה מעשית. המטען הכולל של קומפלקס פפטיד נשלט על-ידי הפרוטונציה של 1) באתרים החומציים והבסיסיים של הפפטיד ו -2) מצב החמצון של יון המתכת (s). לכן, מצב החיוב הכולל של קומפלקס הוא פונקציה של ה-pH של הפתרון המשפיע על הזיקה של מתכת פפטידים מחייב האהדה. עבור הניתוחים של ESI-IM-MS, פפטיד ופתרונות יוני מתכת מוכנים מתוך פתרונות מימית בלבד, עם pH מותאם עם לדלל חומצה אצטית מימית או אמוניום הידרוקסיד. זה מאפשר תלות pH וסלקטיביות יון מתכת להיקבע עבור פפטיד ספציפי. יתר על כן, m/z ו-סמ ק של מתחם פפטיד יכול לשמש עם מידול B3LYP/LanL2DZ מולקולרי כדי להבחין באתרי הכריכה של תיאום מתכת יון ומבנה שלישוני של הקומפלקס. התוצאות מציגות כיצד ESI-IM-MS יכול לאפיין את הביצועים הסלגטיים סלקטיבי של קבוצה של פפטידים מתיונין חלופיים ולהשוות אותם לתוך מתיונין הנחושת-פפטיד מתיאנקובטין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נחושת ויוני אבץ חיוניים עבור אורגניזמים חיים חיוניים לתהליכים כולל הגנה חמצונית, צמיחה רקמות, נשימה, כולסטרול, מטבוליזם הגלוקוז, ו הגנום קורא1. כדי להפוך את הפונקציות הללו לזמינות, קבוצות כמו ה-thiolate של cys, סרטיאזול שלהשניים,3, (לעתים רחוקות יותר) תיויואתר של מתיונין, ו carboxylate אוחר של גלו ו-Asp לשלב באופן סלקטיבי מתכות כקופרים לתוך האתרים הפעילים של . מטלואנזימים הדמיון של קבוצות תיאום אלה מעלה שאלה מרתקת לגבי האופן שבו הליזלים והאחרים משלבים בצורה סלקטיבית את ה-Cu (I/II) או Zn (II) כדי להבטיח את התפקוד הנכון.

קשירה סלקטיבית מושגת לעתים קרובות על ידי רכישת פפטידים סחר, אשר שליטה Zn (II) או Cu (I/II) ריכוזי יון4. Cu (I/II) הוא תגובתי ביותר וגורם נזק חמצוני או כריכת האדוולקית לאנזימים, כך הריכוז החופשי שלה מוסדר בחוזקה על ידי מלווים נחושת ו-נחושת הוויסות חלבונים התחבורה אותו בבטחה למיקומים שונים בתא בחוזקה לשלוט הומאוסטזיס שלו5,6. שיבוש של מטבוליזם נחושת או הומאוסטזיס מעורב ישירות ב menkes ומחלת וילסון7 , כמו גם סרטן7 והפרעות עצביות, כגון פריון8 ומחלת אלצהיימר9.

מחלת וילסון קשורה לרמות נחושת מוגברת בעיניים, בכבד וחלקים של המוח, שם התגובות החמצון של Cu (I/II) מייצרת מינים חמצן תגובתי, גורם התנוונות וניוון נוירולוגי. טיפולי הכלרות הקיימים הם החומצות האמינו הקטנות מפאסיאנאמין וטריאטילנסאטולה. לחילופין, הmethanotrophic-פפטידים ברכישת נחושת מתיונין (mb)10,11 התערוכה פוטנציאל תרפויטי בגלל הזיקה הגבוהה שלהם עבור Cu (I)12. כאשר מתיונין (mb-OB3b) מתוך מתיונין trichosporium OB3b למדו במודל בעל חיים של מחלת וילסון, נחושת הוסר ביעילות מן הכבד מופרש באמצעות מרה13. בניסויים חוץ גופית אישר כי mb-OB3b יכול לאכול את הנחושת מתוך מטתיוגה נחושת הכלול ציטוסול הכבד13. אבלציה לייזר בשילוב עם המסת פלזמה המסה טכניקות הדמיה יש חקרו את ההתפלגות המרחבית של נחושת בסרטן המחלה של וילסון דגימות14,15,16 והראו כי mb-OB3b מסיר את הנחושת עם תקופות טיפול קצרות של 8 ימים בלבד.17.

The mb-OB3b יהיה גם לאגד עם יוני מתכת אחרים, כולל Ag (אני), Au (III), Pb (ii), Mn (ii), Co (ii), Fe (ii), Ni (ii), ו zn (ii)18,19. התחרות עבור האתר הפיסיולוגי Cu (I) מוצג על ידי Ag (I) כי זה יכול לתפוס את Cu (I) מתוך מתחם mb-OB3b, עם שני Ag (I) ו Ni (II) גם מראה מחייב בלתי הפיך Mb אשר לא ניתן לעקורים על ידי Cu (I)19. לאחרונה, סדרה של מתיונין אלטרנטיבית (amb) oligopeptides עם המוטיב 2cys מוטיב מחייב נחקרו20,21, ושלהם zn (ii) ו Cu (i/II) מאפייני איגוד מאופיין. רצפי חומצות האמינו העיקריים שלהם הם דומים, והם כולם מכילים את 2His-2Cys מוטיב, Pro ו acetylated N-טרמינוס. הם שונים בעיקר מ-mb-OB3b בגלל מוטיב 2Cys מחליף את שני אתרים כריכת oxazolone oxazolone של mb-OB3b.

Electrospray אינון בשילוב עם ניידות-המוני-המסה ספקטרומטריה (ESI-IM-MS) מספק טכניקה אינסטרומנטלית רבת עוצמה לקביעת תכונות מתכת מחייב של פפטידים כי זה מודד את המסה שלהם לטעון (m/z) והתנגשות חתך (סמ ק) תוך שימור צורת המסה, הטעינה והקונפורמציה משלב הפתרון. ה- m/z ו-סי. סי. אי מתייחסים לפפטידים סטויכמטריה, פרוטונציה המדינה והצורה הקונפורמציה. סטויכמטריה נקבע כי הזהות והמספר של כל אחד מהרכיבים המצויים במין מזוהים במפורש. המטען הכללי של קומפלקס פפטיד מתייחס למצב הפרוטונציה של האתרים חומצי ובסיסיים ואת מצב החמצון של יון מתכת (s). ה-סי. פי. סי מספק מידע של הצורה הקונפורטית של קומפלקס הפפטיד, מכיוון שהוא מודד את גודל הסיבוב הממוצע המתייחס למבנה השלישוני של הקומפלקס. מצב החיוב הכולל של הקומפלקס הוא גם פונקציה של pH ומשפיע על הזיקה של המתכת של פפטיד האיגוד משום האתרים בסיסיים או חומצי כגון carboxyl, שלו, Cys ו Tyr הם גם אתרי הקשירה הפוטנציאליים של יון מתכת. עבור הניתוחים, את הפפטיד ואת יון מתכת מוכנים פתרונות מימית עם pH מותאם על ידי מדלל חומצה אצטית מימית או אמוניום הידרוקסיד. זה מאפשר את התלות pH ואת הסלקטיביות יון מתכת להיקבע עבור פפטיד. יתר על כן, m/z ו-סמ ק נקבעים על ידי ESI-IM-MS ניתן להשתמש עם מידול B3LYP/LanL2DZ מולקולרי כדי לגלות את סוג של תיאום מתכת יון ומבנה שלישוני של הקומפלקס. התוצאות המוצגות במאמר זה לחשוף כיצד ESI-IM-MS יכול לאפיין את ביצועי הכלגדירוג סלקטיבית של סט של פפטידים amb ולהשוות אותם לתוך הנחושת-מחייב פפטיד mb-OB3b.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים

  1. התרבות מתיונין trichosporium OB3b, לבודד את Cu (I)-mb חינם-OB3b18,22,23, להקפיא לקפוא את המדגם ואת החנות ב-80 ° צ' עד השימוש.
  2. לסנתז את הפפטידים amb (> 98% טוהר עבור amb1, amb2, amb4; > 70% טוהר עבור amb7), להקפיא את הדגימות, ולאחסן אותם ב-80 ° c עד השימוש.
  3. רכישה > 98% טוהר מנגן (II) כלוריד, קובלט (II) כלוריד, nickle (II) כלוריד, נחושת (ii) כלוריד, נחושת (II) חנקתי, כסף (I) חנקתי, אבץ (II) כלוריד, ברזל (III) כלוריד ועופרת (II) כלוריד.
  4. לרכוש את הפולימרים פולי-DL-אלטין המשמשים ככייל עבור מדידת מקטעים ההתנגשות התנגשות של מינים amb ו-כיתה של כיתה או הידרוקסיד אמוניום גבוה יותר, חומצה אצטית קרחוני, ו acetonitrile.

2. הכנת פתרון מניות

  1. פתרון מניות פפטיד
    1. שוקלים במדויק, באמצעות לפחות שלוש דמויות משמעותיות, המסה של 10.0 – 20.0 mg של mb-OB3b או amb בבקבוקון פלסטיק 1.7 mL.
      הערה: מסה שקלה צריך להניב או 12.5 mM או 1.25 mM, בהתאם מסיסות של פפטיד, כאשר 1.00 mL של המים (DI) הוסיף.
    2. באמצעות pipet, להוסיף 1.00 mL של מים מוכי (> 28.6 MΩ ס"מ) למדגם פפטיד שוקלת להניב או 12.5 mM או 1.25 mM פתרון. המקום כובע מאובטח ולערבב ביסודיות עם לפחות 20 inversions.
    3. באמצעות מיקרופיפט לוותר 50.0 μL הפחת מדגימת פפטיד לתוך המסומנת באופן אינדיבידואלי 1.5 mL מבחנות ולאחסן אותם ב-80 ° צ' עד השימוש.
  2. מניות מתכת-פתרונות
    1. שוקלים במדויק, באמצעות לפחות שלוש דמויות משמעותיות, המסה של 10.0 – 30.0 mg של מתכת כלוריד או כסף חנקתי בבקבוקון 1.7 mL.
      הערה: מסה שקלה צריך להניב 125 mM כאשר 1.00 mL של מים DI מתווסף.
    2. הוסף את 1.00 mL של מים DI לדגימת מתכת שוקלת ב 1.7 mL בקבוקון כדי להניב את הפתרון 125 mM. המקום כובע מאובטח ולערבב ביסודיות עם לפחות 20 inversions.
  3. הידרוקסיד אמוניום פתרונות מניות: להכין 1.0 M חומצה אצטית פתרון על ידי דילול 57 μl של 99.5% חומצה אצטית פתרון עם מים די לנפח הסופי של 1.00 mL. הכנת 1.0 M הידרוקסיד אמוניום הידרוקסידי על ידי דילול 90 μL של 21% אמוניום הידרוקסידי הפתרון עם מים די לנפח הסופי של 1.00 mL. לעשות שתי מדלל רצופים של כל פתרון על ידי נקיטת 100 μL של 1.0 M פתרונות להכין 0.10 M ו 0.010 חומצת חומץ M ו-אמוניום הידרוקסידי פתרונות.
  4. פולי-dl-alanine פתרון המניה: להכין את פולי-dl-alanine (PA) על ידי שקילה 1.0 מ"ג של הרשות והמסת ב 1.0 mL של מים DI לתת 1,000 ppm. מערבבים ביסודיות. באמצעות מיקרופיפט, לוותר על 50.0 μL ali, ולמקם כל אחד לתוך בקבוקון 1.7 mL ולאחסן ב-80 ° c.

3. ריסוס אלקטרומטריה-מוביטריית יונים

  1. נקה את אבובים בכניסה ESI ואת נימי המחט ביסודיות עם כ 500 μL של 0.1 M חומצה אצטית קרחוני, 0.1 M אמוניום הידרוקסיד, ולבסוף די מים.
  2. הפשרת 50.0 μl סדרת מחלקים של הפתרון של מניות 1,000 ppm הרשות הפלסטינית ולדלל אותו עם 450 μl של מים DI כדי לתת לדפי הבית הפלסטינית 100. Pipet 100.0 μL של פתרון זה ולדלל אותו ל 1.00 mL עם 500 μL של מים DI ו500 μL של acetonitrile לתת 10 לדפי הרשות הפלסטינית פתרון.
  3. לאסוף את השלילי וחיובי יון IM-MS ספקטרום של 10 ppm הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל שימוש יליד ESI-IM-MS התנאים כמתואר בסעיף הדיון.
  4. ההפשרה 50.0 μl סדרת מחלקים של 12.5 מ"מ או 1.25 mm amb פתרון המניה ולעשות מדלל רצופים עם מים די לתת ריכוז סופי של 0.125 mM amb. מערבבים ביסודיות כל דילול.
  5. Pipet 100.0 μL של 125 mM מלאי הפתרון של מתכת יון, מקום בבקבוקון 1.7 mL ולדלל כדי 1.00 mL עם די מים כדי לתת ב12.5 מטאל mM יון. חזור עם עוד שתי מדלל רצופות כדי לתת הסופי 0.125 mM מטאל ריכוז יון. מערבבים ביסודיות כל דילול.
  6. Pipet 200.0 μL של 0.125 mM amb לתוך מבחנה 1.7 mL, לדלל עם 500 μL של מים DI, ולערבב את הפתרון ביסודיות.
  7. להתאים את ה-pH של המדגם כדי 3.0 על ידי הוספת 50 μL של 1.0 M חומצה אצטית תמיסה.
  8. הוסף 200.0 μL של יון מתכת 0.125 מ"מ למדגם המותאם ל-pH. הוסף מים DI כדי להניב נפח סופי של 1.00 mL של המדגם, לערבב ביסודיות, ולאפשר את המדגם כדי להאביק 10 דקות ב RT.
  9. באמצעות מזרק אף קהה לקחת 500 μL של המדגם לאסוף את יון שלילי וחיובי ES-IM-MS ספקטרום עבור 5 דקות כל אחד. השתמש בשאר 500 μL של המדגם כדי להקליט את ה-pH הסופי באמצעות אלקטרודה מיקרו pH מכויל.
  10. חזור על שלבים 3.6 – 3.9, תוך שינוי שלב 3.7 להתאים את ה-pH כדי 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, או 10.0 על ידי הוספת כרכים חדשים של 0.010 M, 0.10 M, או 1.0 M חומצה אצטית או הידרוקסידי פתרונות.
  11. לאסוף את יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS ספקטרום של 10 דפי הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל אחד.

4. הכנת הטטור מתכת לדיגום של דגימות amb

  1. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200.0 μL של 0.125 mM amb לתוך מבחנה 1.7 mL, לדלל עם 500.0 μL של מים DI ולערבב את הפתרון ביסודיות.
  3. להתאים את ה-pH של המדגם ל-pH = 9.0 על ידי הוספת 80 μL של 0.010 M אמוניום הידרוקסיד הפתרון.
  4. הוסף 28 μL של 0.125 mM הפתרון מתכת להעניק 0.14 מקבילות טוחנת של יון מתכת, להוסיף מים DI כדי להפוך את הנפח הסופי של המדגם 1.00 mL, לערבב ביסודיות, ולאפשר את המדגם כדי equi, עבור 10 דקות ב RT.
  5. באמצעות מזרק אף קהה לקחת 500 μL של המדגם לאסוף את יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS ספקטרום עבור 5 דקות כל אחד. השתמש בשאר 500 μL של המדגם כדי להקליט את ה-pH הסופי באמצעות אלקטרודה מיקרו pH מכויל.
  6. חזור על שלבים 4.2 – 4.5, תוך שינוי שלב 4.3 כדי להוסיף נפח מתאים של פתרון מתכת 0.125 mM כדי לתת את שני 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26, או 1.40 מקבילות טוחנת.
  7. לאסוף את השלילי וחיובי יון IM-MS ספקטרום של 10 ppm הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל אחד.

5. ניתוח מידע בנוגע לנתוני ה-ESI-MS

  1. מ-IM-MS ספקטרה לזהות אילו מינים טעונה של ambs נוכחים על ידי התאמת אותם דפוסי האיזוטופ שלהם m/z התיאורטי.
    1. פתח MassLynx ולחץ על כרומטוגרמה לפתוח את החלון chromatogram.
    2. עבור אל תפריט הקובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS.
    3. חלץ את הספקטרום IM-MS על ידי לחיצה ימנית וגרירה על פני chromatogram ושחרור. חלון הספקטרום ייפתח ויציג את ספקטרום ה-IM-MS.
    4. בחלון הספקטרום, לחץ על כלים ומודל איזוטופ. בחלון מידול האיזוטופ, הזן את הנוסחה המולקולרית של מיני amb, בדוק את תיבת היון של הצג והזן את מצב הטעינה. לחץ על אישור.
    5. חזור על הפעולה כדי לזהות את כל המינים בספקטרום IM-MS ולהקליט את טווח האיזוטופ של m/z שלהם.
  2. עבור כל מיני מינים, יש להפריד בין מיני מקרי m/z לבין הפצות הזמן ההגעה שלהם (ATD) תוך שימוש בדפוסי האיזוטופ שלהם כדי לזהות אותם.
    1. ב-MassLynx לחץ על Driftscope כדי לפתוח את התוכנית. בתוך DriftScope לחץ על קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS.
    2. השתמש בעכבר ולחץ לחיצה שמאלה כדי להתקרב על תבנית איזוטופ m/z של המינים amb.
    3. השתמש בכלי בחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את תבנית האיזוטופ. לחץ על לחצן ' קבל בחירה נוכחית '.
    4. כדי להפריד כל מיני מקרי m/z להשתמש בכלי בחירה ולחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את הזמן atd מיושר עם תבנית איזוטופ של מינים amb. לחץ על לחצן ' קבל בחירה נוכחית '.
    5. כדי לייצא את ה-ATD, עבור לקובץ | ייצוא ל-MassLynx, לאחר מכן בחר שמור זמן הסחף ושמור קובץ בתיקיה המתאימה.
  3. לקבוע את הסנטאיד של ATD ולשלב את האזור תחת עקומת ATD כמדד של אוכלוסיית המינים.
    1. בחלון Chromatogram של MassLynx פתח את הקובץ המיוצא שנשמר. לחץ על התהליך | שילוב מהתפריט. בדוק את התיבה שילוב שיא של ApexTrack ולחץ על אישור.
    2. הקלט את המרכז האזורי ATD (tA) ואת האזור המשולב כפי שמוצג בחלון chromatogram . חזור על כל קבצי הנתונים שנשמרו amb והרשות הפלסטינית-MS.
  4. השתמש ATD משולב עבור כל המינים מחולץ amb של יונים חיוביים או שליליים בכל נקודת טיטור לנרמל לקנה מידה יחסי באחוזים.
    1. הזן את הזהויות של מינים amb ו-ATD המשולב שלהם בכל pH לתוך גיליון אלקטרוני.
    2. עבור כל pH, השתמש בסכום ה-ATDs המשולבים כדי לנרמל את ה-ATDS של האדם לקנה מידה באחוזים.
    3. מתווה את אחוזי הכוונות של כל מיני מינים לעומת pH בגרף כדי להראות כיצד אוכלוסיית כל מינים משתנה כפונקציה של pH.

6. התנגשות בין סעיפים

  1. באמצעות גיליון אלקטרוני, המירו את ccss (Ω) של הרשות הפלסטינית25,26 ו-27 יונים חיוביים שנמדדו ב-הוא מאגר גז28 לתיקון סמ ק (Ωc) באמצעות משוואה 1 להלן, כאשר: z = ion חיוב; ה c = מטען אלקטרוני (1.602 × 10-19 ג); מ ' נ 2 = מסה של N2 גז (Da); ו- mיון = מיסת יונים. בן 29

figure-protocol-1

  1. להמיר את זמני ההגעה הממוצעת (tA) של הרשות הפלסטינית מיני נמלים ומינים amb לתוך זמני הסחף (tD) באמצעות משוואה 2 להלן, כאשר: c = מקדם העיכוב של מחזור החובה המשופר (1.41), ו-m/z הוא מסה-to-התשלום של יון פפטיד.

figure-protocol-2

  1. העלילה הרשות הפלסטינית מכייל ' tD Vs. Ωcשלהם. לאחר מכן, תוך שימוש בהתאמת רגרסיה לפחות של משוואה 3 המוצגת להלן, קבע את ערכי a ' ו-B, כאשר: a ' הוא תיקון הטמפרטורה, הלחץ ופרמטרי השדה החשמליים; ו-B מפצה על ההשפעה לא לינארית של מכשיר ה-IM.

figure-protocol-3

  1. באמצעות אלה ' ו B ערכיהערך של הסנטאיד t מתוך atd של ambs לקבוע Ωc שלהם באמצעות משוואה 3 ואת Ω שלהם באמצעות משוואה 1. שיטה זו מספקת ccss עבור מינים פפטיד עם שגיאות מוחלטות משוער של כ 2%25,26,27.

7. שיטות חישוביות

  1. השתמש ברמה הB3LYP/LanL2DZ של התיאוריה, הכוללת את הפונקציונליות היברידית של becke 3-הפרמטר30 ואת בסיס דנינג להגדיר31 ו אלקטרון פוטנציאל ליבה32,33,34 כדי לאתר הגיאומטריה האופטימיזציה עבור כל הסוגים האפשריים של coordinations של m/z amb מינים שנצפו35.
    הערה: לקבלת פרטים אודות אופן הבנייה והשליחה של חישובים, עיין בשימוש ב-GaussView בקובץ משלים.
  2. השוו את האנרגיה החופשית החזויה של כל אחד מהמגבונס ולחישוב CCSs התיאורטי שלהם באמצעות שיטת לנארד-ג'ונס (אל-ג'יי) מתוכנית סיגמא36.
  3. מהמגבנות הנמוכות ביותר של אנרגיה חופשית קובעות באיזה קונלשעבר מוצגים ה-אל. סי. אם. סי. אם. סי. סי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כריכת מתכת של amb1
מחקר IM-MS20 של amb1 (איור 1א) הראו כי שני יוני נחושת ואבץ הקשורים Amb1 באופן תלוי pH (איור 2). עם זאת, נחושת ואבץ מאוגד amb1 דרך מנגנוני תגובה שונים באתרי תיאום שונים. לדוגמה, הוספת Cu (II) ל-amb1 הביא חמצון של amb1 (amb1ox) על ידי היווצרות הגשר קשר דיסולפידי, ו ב-pH של > 6, את [amb1ox-3h + Cu...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים: שימור התנהגות בשלב הפתרון לבדיקה דרך ESI-IM-MS
יש להשתמש בהגדרות האינסטרומנטליות המקוריות שמאגור את הפפטידים הסטויכמטריה, לטעון את המצב ואת המבנה הקונפורמי. עבור תנאים מקומיים, התנאים במקור ESI כגון מתח חרוט, טמפרטורות, וזרמי הגז צריך להיות ממוטב. כמו כן, את הלחצים ואת המתח במקור, מלכודת, התנועה היון, והעברת גלי נסיעה (במיוחד הטיה מלכודת DC השולט מתח הזרקה בתא IM) יש לבדוק את ההשפעות שלהם על הפצות המדינה החיוב וניידות היון.

להלן תנאי ההפעלה הטיפוסיים ששימשו ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת 1764436, תמיכה בכלי NSF (MRI-0821247), קרן וולש (T-0014), ומשאבי מיחשוב מהמחלקה לאנרגיה (TX-W-20090427-0004-50) ו-L3 תקשורת . אנו מודים לקבוצת בוואר של אוניברסיטת קליפורניה-סנטה ברברה על שיתוף התוכנית סיגמא ו Ayobami Ilesanmi להפגין את הטכניקה בווידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוניטריל HPLC בדרגתפישר סיינטיפיק (www.Fishersci.com)A998SK-4
אמוניום הידרוקסיד (בדרגת קורט מתכת)פישר סיינטיפיק (www.Fishersci.com)A512-P500
קובלט (II) כלוריד הקסהידרט 99.99%סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)255599-5G
נחושת (II) כלוריד 99.999%סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)203149-10G
נחושת (II) חנקת הידרט 99.99%סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)229636-5G
תוכנן amb1,2,3,4,5,6,7 פפטידיםNeo BioLab (neobiolab.com)סונתזו על ידי
פפטידים שתוכננו לפי סדר AMB5B,C,D,E,F פפטידיםפפמיקקו (www.pepmic.com)עוצבו סונתזו בהזמנה
Driftscope 2.1 תוכנתווטרס (www.waters.com)תוכנית ניתוח תוכנה
mb-OB3b מיובש בהקפאה, מטוהר ונטול Cu(I) M-Commerce)
חומצה אצטית קרחונית (בדרגת אופטימה)פישר סיינטיפיק (www.Fishersci.com)A465-250
ברזל (III) כלוריד נטול מים 98%+אלפא Aesar (www.alfa.com)12357-09
עופרת (II) חנקת ACS בדרגתאוונטור (www.avantormaterials.com)128545-50G
מנגן (II) כלוריד טטרהידרט 99.99%סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)203734-5G
MassLynx 4.1Waters (www.waters.com)תוכנה ניתוח תוכנה
ניקל כלוריד הקסהידראט 99.99%סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)203866-5G
פולי-DL-אלניןסיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)P9003-25MG
כסף חנקתי 99.9%+אלפא אייזר (www.alfa.com)11414-06
Waters Synapt G1 HDMSWaters (www.waters.com)quadrupole - ניידות יונים- ספקטרומטר מסה של זמן טיסה
אבץ כלוריד נטול מיםAlfa Aesar (www.alfa.com)A16281
מתוכננים שתוכננו מתורבת ומבודד במעבדתו של ד"ר דונגוון צ'וי (המחלקה לביולוגיה, טקסס A&

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116 (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ion Mobility Mass SpectrometryMetal Ion RecognitionRedox ActivityMetal Binding OligopeptidesElectrospray IonizationCollision Cross SectionMolecular ModelingpH Dependent BindingMethanobactin PeptidesCopper Zinc Binding

מאמרים קשורים