פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של קסנופוס
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההקרנה החזותית העיקרית של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה משמש מערכת מודל מעולה למחקר מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של קישוריות עצבית. במהלך הקמתה של ההקרנה retino-tectal, מרחיבים אופטיים להאריך מן העין ולנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע רקמת היעד שלהם, tectal אופטי. לאחר אקסונים אופטיים להיכנס tectum, הם מורכבים סוכת הטרמינל כי הפונקציה להגדיל את מספר הקשרים סינפטית הם יכולים לעשות עם היעד interneurons ב tectum. כאן, אנו מתארים שיטה לבטא קידוד ה-DNA חלבון פלורסנט ירוק (GFP), ו-להשיג ואובדן של פונקציה מבנים גנים, ב נוירונים אופטיים (בתאי גנגליון הרשתית) ב העוברים Xenopus . אנו מסבירים כיצד להחדיר מיקרו DNA/ליפופיהזיהום מגיב לתוך eyebuds של עוברים הישן יום אחד כגון גנים אקסוגני מבוטא במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים. על-ידי תיוג גנים עם gfp או שיתוף הזרקת עם gfp פלאבאמצע, הטרמינל סיבי סוכת של נוירונים בודדים אופטיים עם איתות מולקולרי שונה ניתן לדימות ישירות במוח של שלמים, חי xenopus ראשנים מספר ימים לאחר מכן, ואת מורפולוגיה שלהם ניתן לכמת. פרוטוקול זה מאפשר לקבוע את המנגנון המולקולרי האוטונומי התאי הנמצא בתוך הvivo.
מבוא
במהלך הפיתוח של מערכת העצבים, אקסונים של נוירונים טרום סינפטיות לנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע לאזורי היעד שלהם. כאשר אקסונים לפלוש רקמות היעד שלהם, הם לבסס קשרים סינפטית עם היעד הפוסט נוירונים. בסוגים רבים של נוירונים, אקסונים להגדיל את המספר ואת ההיקף המרחבי של חיבורי סינפטית הם יכולים לעשות על ידי הגברת רשתות של סניפי מסופים או סוכת1. ההקרנה retino-tectal של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה הוא מודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור בדיקת מנגנונים בבסיס מסוף אקסון arborization קישוריות סינפטית2,3,4 . בודדים gfp ביטוי סוכת אופטיים עם איתו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת טורו קליפורניה (פרוטוקול TUCA003TE01X).
1. השגת X. זריזה עוברים
- השג X. זריזה העוברים על ידי ההזדווגות הטבעית של זוגות של זכר ונקבה צפרדעים מבוגרים מוכן גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG), על ידי הפריה חוץ גופית של ביצים לשפוך מצפרדעים למבוגרים נקבה מוכן hcg, או על ידיהזמנת ישירות (השולחן של חומרים).
-
העוברים dejelly השיגו עם פתרון ציסטאין 2% בטמפרטורת החדר (לוח חומרים)16.
- איסוף 50-100 עוברים בצלחת פטרי גדולה. להסיר את הפתרון העוברים הם על ידי היין או....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המתואר במאמר זה מניב שיעור הצלחה של 30 ל-60% של מוזרקים העוברים ביטוי gfp (לבד או ביחד עם מבנים DNA נוספים) באחד עד עשר arbors אופטיים. באיור 3, אנו מציגים הנציג מיקוד תמונות של בקרת הביטוי gfp ו-מוטציה אופטיים מוטנטים בתוך שלמים של xenopus ראשנים מן המחקר שפורסם לאחרונה7. עבור מחקר זה, שיכלנו שני מוטציות בתחום של APC (APCNTERM ו-APCβ-cat) לתוך pCS2 פלמידים, ושיתוף הזריק אלה הפלמידים יחד עם התוויות pCS2-GFP בתוך העיניים של עוברי יום אחד העו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לבטא במבנים DNA אקסוגני במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים וכיצד התמונה בודדים gfp המבטא האופטית סוכת עם איתות רגיל ומשתנה מולקולרית בשלמותו, החיים ראשנים של הצפרדע X . . אני מבין. אנו גם מסבירים כיצד לשחזר ולכמת את המבנה של gfp המבטא האופטית סוכת מתמונות שנתפסו vivo. כדי לבטא את ה-DNA האקסוגני במספר קטן של נוירונים אופטיים, אנו מזריקים התערובת DNA/ליפועיהזיהום לתוך הראש הפריחידייה של עוברי יום אחד הישן Xenopus , באמצעות טכניקה שפותחה לראשונה במעבדה של כריסטין הולט ללמוד או.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים Touro אוניברסיטת קליפורניה המכללה לרפואה אוסטאופתי על תמיכה במחקר שלנו. אנו מכירים את התלמידים הקודמים במעבדה (אסתר וו, גרגורי פנג, Taegun Jin, ג'ון סלים) שסייעו ליישם את טכניקת המיקרוהזרקה הזאת במעבדה שלנו. אנו אסירי תודה לד ר כריסטין הולט, שבמעבדאת הטכניקה הזאת, מיקרופיפוס ה-DNA וטכניקת הליפסד בעוברים התפתחו לראשונה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3.5 אינץ' Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - תוכנת G/X | |
| μ-manager (גרסה 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD מצלמה Scion | Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (גונדוטרופין כוריוני אנושי) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Ocps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 מיקרוסקופ אפיפלואורסנטיות | Nikon | מטרות: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (גרסה 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative ענן) | Adobe | ||
| ImageJ (גרסה 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| מיקרומניפולטור עם מתאם אוניברסלי ובסיס תמיכה | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| מכשור מדעי יישומי | ממונע z-stage | MFC-2000 | |
| Nanoject II מזרק | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (גרסה 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis עוברים | Nasco | LM00490 |
מקורות
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: d....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
