העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

מקרופאגים הם תאים phagocytic המתמחים זיהוי, בליעת חיידקים משפיל, תאים אפוטוטיים ופסולת הסלולר. יתר על כן, הם עוזרים לארגן את התגובות החיסונית על ידי הפרשה ציטוקינים ו נוגדנים ועל ידי הצגת אנטיגנים לתאי T ו-B תאים. המקרופאגים גם לשחק תפקידים חשובים בתהליכים אחרים רבים, כגון ריפוי הפצע, טרשת עורקים, tuמוריגנזה והשמנה.

כדי להיות מסוגל לזהות מולקולות שאינן עצמיות כגון דפוסי מולקולרי הקשורים לפתוגן (PAMPs) ומולקולות מחוץ למקום כגון דפוסי נזק מולקולריים (DAMPs), מקרופאגים מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRR)¹. למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect² כמו מגיב החצייה³ ואת חומצות גרעין מנוכר^4,5,6,7 לעתים קרובות מוכרים על ידי prrs כמו לא עצמי. מסיבה זו, העברה של מקרופאגים באמצעות שיטות כימיות או פיזיות⁸ בדרך כלל גורמת הפעלה מקרופאג והשפלה של חומצות גרעין מזוהמים או אפילו ב מקרופאג התאבדות דרך פירופציטוזה, צורה של מוות תאים מתוכנת lytic המופעל לאחר הכרה של pמגברים ציטופולימרים/damps כגון DNA או זרים RNA⁹. העברה ביולוגית של מקרופאגים באמצעות וירוסים כגון אדנוירוסים או וירוסים כמו וקטורים הוא לעתים קרובות יעיל יותר, אך הבנייה של וקטורים ויראליות כגון הוא זמן רב ודורש ברמה אבטחה טיחות 2 ציוד^10,11.

כך, למרות מקרופאגים הם הנושא של מחקר אינטנסיבי, ניתוח התפקודים שלהם על הרמה המולקולרית היא הכשלה כי אחד הכלים החשובים ביותר של ביולוגיה מולקולרית, הגלגול של חומצות גרעין בנייה לביטוי אקסוגני של חלבונים, בקושי ישימה. זה לעתים קרובות כוחות חוקרים להשתמש קווי תאים מקרופאג כמו במקום מקרופאגים בתום הכוח. יישומים עבור חומצות גרעין בניית המבנה כוללים ביטוי של גירסאות חלבון מוטציה או מתויג, הבעות יתר של חלבון מסוים, חלבון מחדש ביטוי ברקע נוקאאוט בהתאמה וביטוי של חלבונים ממינים אחרים (g. , היצור recombinase או מדריך RNA ו Cas9 עבור הסתרה המוקד הגן).

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של (בדרך כלל קשה transfection) מקרופאגים ראשוניים, כי הוא murine הצפק מקרופאגים (PM) ו מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA שנוצר מ-DNA תבניות כגון פלמידים. חשוב לעשות זאת, בתוך מבחנה מחוץ לגופית mrna שנוצר באמצעות פרוטוקול זה מכיל את נוקלאוטידים באופן טבעי משתנה 5-מתיל-ctp ו פסאודו-utp כי להפחית את האימונוגלוגניות ולשפר את יציבות^4,6,7,12,13. יתר על כן, 5 '-הקצוות של ה-mrna המועתק מחוץ לחומרים מלאכותית הם deזרחנות על ידי פוספספטאז אנטארקטיקה כדי למנוע הכרה על ידי המתקן-I מורכב^14,15. זה ממזער את ההכרה החיסונית הטבועה ב-mRNA מתורבת. עם שלנו קל לבצע את הפרוטוקול, שיעורי החצייה בין 50-65% (מקרופאגים הצפק (PM)) ו 85% (BMDM) הגיעו בזמן, וחשוב, אין הרעלת ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט (i) כיצד מושתקים החיסוני mRNA עבור החצייה ניתן להפיק מתוך מבנים DNA כגון פלמידים ו (ii) את ההליך החוצה עצמו.

בידוד מקרופאג מעכברים התבצע בהתאם לחוק הגנת בעלי חיים בגרמניה בציות לוועדת האתיקה באוניברסיטת קלן.

הערה: לבצע את כל השלבים ללבוש כפפות. בצע את כל צעדי החצייה תחת מכסה זרימה למינארי כדי למנוע זיהום של התאים. לפני העבודה עם mRNA, לנקות את כל המכשירים כגון פיפטות ומכל משטח עם 70% אתנול ו/או החומר המשפיל של RNAse (טבלת חומרים). ודא כי כל צינורות התגובה הם RNAse-חינם וסטרילי. השתמש רק מים סטרילי, RNAase ללא מדלל. השתמש באופן בלעדי בעצות בצנרת עם מסננים. שינוי עצות הפיפטה לאחר כל צעד מלטף.

1. הדור של תבנית ה-DNA

הערה: תבנית ה-DNA עבור שעתוק מחוץ לחוק mRNA באמצעות פרוטוקול זה חייב להכיל רצף מקדם T7 כדי לאפשר עגינה של RNA פולימראז. אם הפלסטלינה המכילה את רצף ה-DNA של חלבון הריבית כבר מכיל רצף מT7 מכוונת בצורה נכונה במעלה הזרם של רצף העניין, לינריזציה של הפלביניים (ראה שלב 1.1.) צריך להתבצע. אחרת, חבר T7 מקדם לרצף העניינים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR, ראה שלב 1.2.).

1. לינריזציה של T7 מקדם המכיל פלמידים
   1. הפלמידים של linearize כבר מכילים רצף מסור T7 מסור על ידי העיכול עם אנזים הגבלה חותך במורד הזרם מעבר לסדר הריבית. אחרת, התמלול לא תסתיים כראוי לאחר רצף הריבית.
      הערה: מומלץ להשתמש באנזימי הגבלה העוזבים את הקצוות בוטה או 5 ' תלויים.
   2. לאשר שורה מלאה של הפלסמיד על ידי האגנה ג'ל אלקטרופורזה של דנ א מתעכל נגד מתעכל DNA.
   3. לטהר את ה-DNA לפני השימוש כמו תבנית DNA עבור שעתוק מבחנה mRNA באמצעות ערכת טיהור DNA (טבלת חומרים).
2. מצורף לT7 הקדם של ה-PCR
   1. השתמש בתחל הקדמי המכיל את הרכיבים הבאים (בסדר המצוין מ 5 ' עד 3 '): כ 5 לחץ דם אקראי במעלה של מקדם מקדם (למשל, GAAAT); רצף הT7 מקדם (טאקאטקקאג); שני Gs נוספים להגברת היעילות המוגברת (GG); החלק הספציפי לרצף היעד ההומוולוגי לרצף הפלביניים המקיף את ההתחלה של הקודון.
      הערה: זה צריך להיות מורכב: 3-6 bp במעלה של רצף kozak ולהתחיל קודון, רצף kozak ולהתחיל קודון (בדרך כלל gccacc atg g), 12-18 bp במורד של ההתחלה קודון. אם רצף הריבית אינו מכיל כבר רצף KOZAK או להתחיל לפתוח, אלה יכולים להיות מחוברים בשלב זה על ידי פשוט כולל אותם ברצף התחל.
   2. לחשב את t_m של פריימר קדימה רק על ידי לקיחת בחשבון את החלק הומולוגי לרצף היעד.
   3. כדי להעריך את היווצרות דימרס/סיכת להשתמש ברצף התחל כולו, אשר בקלות יכול לחרוג 50 bp.
   4. השתמש פריימר הפוכה ממוקם במורד במורד המטה של לעצור codon.
      הערה: אם רצף העניין אינו מכיל כבר את הפסקת הפעולה, הוא יכול להיות מצורף בשלב זה על-ידי כלילת הרצף התחל.
   5. השתמש בתחל הקדמי והפוך כדי לבצע PCR באמצעות הגהה באיכות גבוהה עם הגהת (טבלת חומרים).
   6. לאשר את הדור של מוצר אחד ואת הגודל אמפליקון על ידי אגנה ג'ל (g., השתמש 1% agarose ג'ל ו-V קבוע 100 הנוכחי).
   7. לטהר את מוצר ה-PCR לפני השימוש כתבנית DNA עבור תמלול mRNA מתורבת באמצעות ערכת טיהור DNA.

2. הדור mRNA

1. הפשרת כל הרכיבים של ערכת תמלול מחוץ למערכת (עיין בטבלת החומרים). מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g. . שמור על הקרח עד השימוש
2. להכין את תערובת התגובה עבור שעתוק מבחנה mRNA ב 0.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת בסדר הבא (נפח כולל של 40 μL): 20 μL של מיקס 10 x מארקה/NTP (כלול בערכת התעתיק של מבחנה mRNA); 0.25 μL של 5-מתיל-CTP (ריכוז סופי (מועדון) הוא 1.25 מ"מ; 50% של CTP סה כ); 0.25 μL של פסאודו-UTP (מועדון לינה 1.25 מ"מ; 50% of הכולל UTP); X μL של תבנית DNA; 2 μL של T7 RNA פולימראז מיקס (כלול בערכת התמלול של מבחנה); Y μL של RNAse-H חינם₂O.
   הערה: X הוא אמצעי אחסון המכיל לפחות 1 μg של דנ א. לדוגמה, 1.6 μL מפתרון מלאי 625 ng/μL. Y הוא אמצעי האחסון הרזרבי לנפח הכולל של 40 μL.
3. מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g. מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות ב 400 סל ד על מערבל תרמי עבור שעתוק מבחנה.
4. לאחר מכן, הוסף 2 μL של DNase I ישירות לתוך תערובת התגובה להסרת ה-DNA של התבנית. מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
5. מודקון ב 37 ° c עבור 15 דקות ב 400 סל ד על מערבל תרמי. קח סדרת מחלקים של 2 μl עבור ג'ל הבקרה (שלב 3.3) ולאחסן ב-80 ° c.
6. עבור פולי (A) לעקוב, להוסיף את הרכיבים הבאים ישירות לתוך תערובת התגובה הקודמת (לנפח הסופי של 50 μL): 5 μL של 10x פולי (A) התגובה פולימראז ו 5 μL של פולי (א) פולימראז (שניהם כלולים ערכת התעתיק של מבחנה mRNA). מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
7. מודטה את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות ב 400 rpm על thermomixer. קח סדרת מחלקים של 2 μl עבור ג'ל הבקרה (שלב 3.3) ולאחסן ב-80 ° c.
8. עבור הדרחון של 5 הקצוות-קצות ה-mRNA, להוסיף את הרכיבים הבאים ישירות לתוך תערובת התגובה הקודמת (לנפח הסופי של 60 μL): 3 μL של RNAse-H חינם₂O; 6 μL של מאגר התגובות האנטארקטי של 10x באנטארקטיקה; 3 μL של פוספספטאז האנטארקטי (15 יחידות עבור 60 μL תגובה). מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
9. מודטה את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות ב 400 סל ד על מערבל תרמי.
10. מחממים הפוך פוספספטאז באנטארקטיקה על ידי הדגירה ב 80 ° c עבור 2 דקות.
    הערה: באופן אידיאלי, השתמש במערבל תרמי נפרד, אל תחכה עד שמערבל הראשון יגיע לטמפרטורה הרצויה.

3. mRNA טיהור

1. לטהר את המוצר mRNA מוצר באמצעות ערכת טיהור ייעודי RNA (טבלת חומרים).
   1. הוסף X μL של פתרון הימנעות לערבב את התגובה mRNA משלב 2.10. מערבבים על ידי היפוך 5 פעמים. הוסף 300 μL של התמקד בפתרון הכריכה. מערבבים על ידי ליטוף עדין 5 פעמים.
      הערה: X הוא אמצעי האחסון הרזרבי לנפח כולל של 100 μL. לדוגמה, הוסף את הפתרון של 40 μL ל-60 מיקס התגובה של μL mRNA.
   2. הוסף 100 μL של אתנול חופשי של RNAase. מערבבים על ידי ליטוף עדין 5 פעמים.
   3. מקם עמודת מסנן באחד מצינורות האוסף שסופקו. העבר את מיקס התגובה mRNA בעדינות אל מרכז המסנן מבלי לגעת במסנן. צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. הרם בזהירות את עמודת המסנן והשמט את הזרימה בצינור הגבייה. הצב את עמודת המסנן בחזרה לאותה צינורית אוסף.
   5. הוסף 500 μL של הפתרון לשטוף (לא לשכוח להוסיף 20 מ ל של אתנול חינם RNAase לפני שימוש בפתרון לשטוף בפעם הראשונה).
   6. צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות ב RT. חזור על הצעדים 3.1.4-3.1.6 לשטוף עוד פעם אחת.
   7. צנטריפוגה במהירות מלאה (17,900 x g) עבור 1 דקות ב-RT כדי להסיר כל נוזל שיורית מעמודת המסנן. קח בזהירות את עמודת המסנן מצינור האיסוף. הצב את עמודת המסנן בצינור אוסף חדש.
   8. הוסף 50 μL של מאגר הימנעות למרכז המסנן מבלי לגעת במסנן. מודקון ב 65 ° c עבור 10 דקות על מערבל תרמי.
   9. צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות בשעה RT. הסר את עמודת המסנן והתעלם ממנה.
2. למדוד את הריכוז ואת הטוהר של mRNA, למשל, באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume כדי למדוד ספיגת ב 260 ו 280 nm.
   הערה: יחס A260/A280 של 1.8-2.1 מעיד על mRNA מטוהרים מאוד.
3. ודא נוכחות של מוצר בודד, אורך תעתיק נכון ו-פולי (א) לעקוב אחר על ידי ניתוח האליבטים מתוך שלבים 2.5 ו 2.7 על ידי אגנה ג'ל אלקטרופורזה תחת התנאים המאחדים (למשל, השתמש ב1.2% agarose ג'ל המכיל 20 מ"מ 3-(N-גוורולינו) חומצה propanesulfonic [מגבים], 5 מילימטר אצטט נתרן, 1 מ"מ EDTA ו 20% פורמלדהיד ולרוץ 20 מ"מ מגבים, 5 mM אצטט נתרן, 1 מ"מ EDTA ו 0.74% פורמלדהיד ב 100 V קבוע זרם.
4. אחסן את ה-mRNA הטהור בצינור האלויון ב-80 ° c עד לאחר החצייה. אם השימוש רק בכמויות נמוכות של ה-mRNA לאחר מכן, השתמש ב-mRNA כדי להימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאת ההקפאה.
   הערה: mrna ניתן לאחסן ב-80 ° c עבור 1 שנה.

4. הכנה למקרופאג

1. המתת חסד C57/BL6 עכברים (להשתמש בעכברים של אותו מין ו של 6-24 שבועות של גיל) על ידי פריקה צוואר הרחם.
   הערה: העכברים אותו ניתן להשתמש עבור בידוד של PM (שלב 4.2) והדור של BMDM (שלבים 4.3 ו 4.4). לבידוד של השימוש ב-PM לפחות שני עכברים. אם רק BMDM יש ליצור עכבר אחד בדרך כלל הוא מספיק.
2. העשרת מקרופאגים. בצפק מגנטיים
   1. מילוי מזרק 10 מ ל עם צינורית ב0.9 x 40 מ"מ עם 8 מ ל של תמיסת מלח באגירה קרה (PBS) ו-2 מ ל של אוויר. . רוקן את חלל הצפק עם הערוץ האוויר יהיה ליצור בועה כי ממזער את הדליפה של ה-PBS.
   2. לאסוף במהירות שאיפה הצפק עם מזרק אותו ולהעביר לתוך צנטריפוגה mL חרו50 א חרוט. לשלב תאים הצפק של עכברים מרובים במידת הצורך. . שמור על השעיית תא בקרח
   3. תא צנטריפוגה מושעה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 5 מ ל של 0.2% הנאגל עבור 30 s למטה כדוריות הדם האדומות.
   4. הוסף 5 מ ל של 1.6% לנפח כולל של 10 מ ל כדי להוות מחדש תנאי איזוטוניקה. צנטריפוגה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
   5. למחוק את supernatant ולהשעות את הגלולה תא ב 97.5 μL של מיון תא מגנטי (MCS) מאגר (2 מ"מ חומצה ethylenediams התרופה [EDTA], 5% בסרום שור אלבומין [BSA] ב PBS) ל 1 שטיפה הצפק (למשל, אם שלושה עכברים היו סומק, להשהות ב 292.5 ).
   6. הוסף 2.5 μL של חרוזים פאראמגנטים מצוCD11b ל-נוגדן ספציפי לכל 97.5 μL של השעיית תא (למשל, להוסיף 7.5 μL כדי 292.5 μL).
   7. דגירה על קרח עבור 15 דקות ב 150 סל ד על שייקר מסלולית.
   8. תא צנטריפוגה מושעה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, למחוק את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא 1 מ ל של מאגר mcs.
   9. הוסף 4 מ ל של מאגר MCS לנפח כולל של 5 מ ל ולשטוף את התאים על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה שלוש פעמים.
   10. חזור על הצעדים 4.2.8 ו 4.2.9 פעמיים נוספות עבור סך של שלושה שלבים לשטוף.
   11. במהלך שלבי הכביסה מניחים עמודת LS במפריד תאים מגנטי (ראו טבלת חומרים). שטוף את העמודה עם 3 מ ל של מאגר MCS.
       הערה: להימנע כל בועות כמו אלה עשויים לסתום את העמודה.
   12. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מאגר MCS. הוסף 3 מ ל של מאגר MCS לנפח כולל של 4 מ ל, לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה שלוש פעמים.
   13. העבר את 4 mL של השעיית תא על עמודת LS שוטפים.
       הערה: שוב, להימנע כל בועות כמו אלה עשויים לסתום את העמודה.
   14. המתן עד שמאגר העמודה יהיה ריק לחלוטין. אל תוסיף נוזל נוסף עד שהעמודה תפסיק לטפטף.
   15. הוסף 3 mL של מאגר MCS אל העמודה. לאחר מכן, המתן עד שמאגר העמודה יהיה ריק לחלוטין. חזור על השלב 4.2.15 עוד פעמיים.
   16. הצב את עמודת LS בשפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל. החלת 5 מ ל של מאגר MCS על העמודה. המתן עד 2 מ ל של נוזל עבר דרך הטור, ואז להשתמש בבוכנה כדי לדחוף בעדינות את השבר הנותר לתוך הצינור.
   17. תא צנטריפוגה מושעה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהיפטר supernatant.
   18. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של DMEM בתוספת של 10% סרום עגל עוברי העובר בחום (FCS) (Dמאמ + FCS).
   19. לקבוע את מספר התאים הקיימא על ידי ספירה של הפתרון הכחול בתוך כדוריות התאים והזרעים של נויבאואר ב-Dמאמ + FCS לתוך לוחיות התרבות.
       הערה: זרעים PM בצפיפות של 100,000 תאים/גם בלוח מיקרוטיטר התחתון שטוח. אין להשתמש בלוחות שטופלו על-ידי הרקמה כאשר PM לא ניתן להתנתק מאלה. במקום זאת, השתמש בלוחות שאינם מטופלים.
3. דור של BMDM
   1. הסרת העור והשרירים מהרגליים האחוריות באמצעות זוג מספריים. רוחצים כל רגל באמצעות שטיפה קצרה ב-70% אתנול.
   2. ניתוק הרגליים ופתיחת שני קצות עצם הירך והשוקה על ידי חיתוך עם מספריים.
   3. מילוי מזרק 5 מ ל ממולא בצינורית של 0.6 מ"מ x 30 מ"מ עם 5 מ ל של אנדוטוקסין נמוך מאוד (VLE) RPMI 1640 ולשטוף את מח העצם מתוך העצמות הפתוחות לתוך צלחת תרבות.
   4. שילוב מח עצם של עכברים מרובים אם נדרש על ידי שלבים חוזרים 4.3.1-4.3.3. העבר את מח העצם לתוך שפופרת 50 צנטריפוגה ל חרוט.
   5. צנטריפוגה את מח העצם ההשעיה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהיפטר supernatant.
   6. השהה מחדש את הגלולה בתא 5 מ ל של מאגר פירוק של תא דם אדום (8.3% NH₄Cl, 0.1 M טריס) ו דגירה עבור 5 דקות ב-RT כדי לעבור את כדוריות הדם האדומות.
   7. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 650 x g ב 4 ° צלזיוס עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
   8. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של VLE RPMI 1640 בינונית בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% HEPES, 1% נתרן פירובט ו 10 ng/mL רקומביננטי מקרופאג המושבה מגרה גורם (M-שדרתי) (RPMI⁺+ + + +).
   9. הוסף 4 מ ל של RPMI⁺ + + + + לנפח כולל של 5 מ ל.
   10. הכינו 5 92 mm x 16 מ"מ מנות פטרי לא מטופלות עם מצלמות (לראות את הטבלה של חומרים) לכל עכבר על ידי ליטוף 7 מ ל של RPMI⁺ + + + + בינוני לתוך כל מנה.
   11. העבר את 1 מ ל של פתרון התא ל 5 מנות תרבות מוכנות ב-37 ° c ו-5% CO₂.
   12. לאחר 4 ימים, האכילו את התאים על-ידי הוספת 4 מ ל של RPMI⁺+ + + +. לאחר 6-7 ימים, התאים מח העצם מובחנים במלואם ל BMDM.
4. קציר של BMDM
   1. הסירו לחלוטין את המדיום ממאכלי התרבות. הוסף 5 מ ל של חם 0.2 mM EDTA ב-PBS לכל מנה.
   2. מגרדים בעדינות את כל הצלחת עם מגרד התא כדי לנתק את BMDM. שלבו את השעיות התא בשפופרת צנטריפוגה של 50 mL.
   3. . רוקן את כל 5 המנות שוב השתמש באותו כמות של 5 mL של חם 0.2 mM EDTA ב-PBS עבור כל 5 מנות. שלב זה השעיה התא עם אחד מהשלב הקודם.
   4. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהיפטר supernatant.
   5. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של VLE RPMI 1640 בינונית בתוספת 10% FCS, 1% HEPES, 1% נתרן פירובט ו 10 ng/mL רקומביננטי M-שדרתי, אבל לא אנטיביוטיקה (RPMI⁺+ + +).
   6. קבע את מספר התאים הפעילים על-ידי ספירת התמיסה הכחולה ב-RPMI⁺ + + לוחיות התרבות של נויבאואר.
      הערה: זרעי BMDM בצפיפות של 50,000 תאים/מקסימום היטב בלוח מיקרוטיטר התחתון שטוח. אל תשתמשו ברקמות הרקמה המטופלת כמעט לא ניתן להתנתק מאלה. במקום זאת, השתמש בלוחות שאינם מטופלים.

5. התמרה של מקרופאגים עם mRNA

1. חישוב הנפח הנדרש של מאגר החצייה של mRNA.
   הערה: הנפח של מאגר החצייה mRNA הנדרש תלוי בגודל טוב: השתמש 200 μL עבור העברה בצלחת 6-באר, 100 μL בצלחת 12-באר וכן הלאה. תמיד להוסיף קצת נפח רזרבי בגלל אובדן ליטוף (אבל לא יותר מדי, כדי למנוע דילול מופרז של mRNA). לדוגמה, השתמש ב-450 μL במקום 4 x 100 μL = 400 μL כדי להשתמש ב-4 בארות של צלחת 12-היטב.
2. חשב את הנפח הנדרש של מגיב החצייה של mRNA. התוספת הכימית של mRNA נוספת ביחס של 1:50. לדוגמה, 9 μL של מגיב העברה של mRNA נדרש עבור נפח סופי של 450 μL.
3. חשב את הסכום הכולל של mRNA הנדרש. לפחות 100 ng לכל 100,000 מקרופאגים נדרשים עבור הזיהום יעיל, 200 ng עובד אפילו טוב יותר (למשל, 800 mRNA כדי transfection 400,000 מקרופאגים).
   1. הכפל את הסכום המחושב של mRNA הנדרש עם המספר הכולל של בארות שצריך להיות מנוכר (למשל, 4 בארות עם 400,000 מקרופאגים כל: 4 x 800 ng = 3,200 ng mRNA נדרש בסך הכל עבור כל הבארות). לדוגמה, אם מלאי mRNA הוא 426.8 ng/μL, 7.49 μL נדרשים עבור העברה אופטימלית של 4 בארות עם 400,000 מקרופאגים כל אחד.
4. הוסף את אמצעי האחסון המחושב של מאגר החצייה של mRNA (שלב 5.1.) פחות את אמצעי האחסון עבור מגיב החצייה של mRNA (שלב 5.2) ו-mRNA (שלב 5.3) לשפופרת תגובה. לדוגמה, 450 μL-9 μL-7.49 μL = 433.51 μL.
5. להפשיר את המניה mRNA ולערבב אותו על ידי היפוך עדין של צינור להתחמק. הוסף את אמצעי האחסון המחושב של mRNA (שלב 5.3) לצינור התגובה עם מאגר התגובה mRNA (בדוגמה המוצגת לעיל: 7.49 μL ב 433.51 μL).
6. מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
7. מערבולת הזיהום של mRNA מגיב עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
8. הוסף את אמצעי האחסון המחושב של מגיב ההעברה של mRNA (שלב 5.2) לצינור התגובה המכיל את מאגר החצייה של mRNA ואת mRNA (בדוגמה המוצגת לעיל: 9 μL של מגיב החצייה של mRNA).
9. מערבולת תערובת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
10. דגירה עבור 15 דקות ב RT.
11. בינתיים, להחליף את מדיום התרבות של מקרופאגים עם מדיום טרי, התרבות החם (ראה שלבים 4.2.18. and 4.4.5).
12. לאחר הדגירה שלב 5.10, להוסיף את תערובת התרגום לבארות המכילים את מקרופאגים בכרך המתאים לגודל של הבאר (ראה שלב 5.1). הוסיפו את התערובת הנפתחת בעיגול מבחוץ לאמצע הבאר.
13. בעדינות לנדנד את הצלחת, הראשון באנכי ולאחר מכן בכיוון אופקי כדי להבטיח פיזור אחיד של תערובת הזיהום בבאר. ואז, הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂. סינתזה של חלבון מקודד על ידי mRNA מזוהמים יחל זמן קצר לאחר הזיהום. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הדגירה לפחות 6 h.
14. לאחר הדגירה, לנתח את יעילות הזיהום על ידי (חיסונית) מיקרוסקופ פלואורסצנטית, זרימה cy, לנסות או כתמי החיסונית¹⁶, או להשתמש מקרופאגים מזוהמים לניסוי הבחירה.

השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור קידוד mRNA עבור הדגל-מתויג נמו ו IKKβ משתנים עבור העברה של מקרופאגים הראשי16. קידוד הפלמידים עבור דגל-מתויג פראי (נמוWT) ו C54/347a וטציה נמו (נמוC54/374a) (לראות את הטבלה של חומרים) כבר מכיל מקדם מקדם T7 בכיוון הנכון (איור 1א). כדי ליצור תבניות דנ א. לתמלול של מבחנה למטרה זו, 10 μg של ה-DNA פלמיד היו מתעכל עם 5 μL Xbal וכתוצאה מכך שינלון של הפלבאמצע בשל לחתוך אחד 3 ' של לעצור codon. שורה מלאה של הדי-אן-איי הפלמיד אומת על ידי אלקטרופורזה בג ג'ל (איור 1ב).

קידוד הפלמידים עבור דגל מתויג מסוג פראי (IKKβWT) ו-S177/181e מוטציה IKKβ (IKKβS177/181e) אינם מכילים מקדם מקדם T7. לכן, יש לנו המצורפת T7 מקדם על ידי ה-PCR כדי ליצור תבניות DNA עבור שעתוק מבחנה (איור 2א). הדור של מוצר PCR מסוים, דהיינו, מוצר יחיד בגודל הנכון, אומת על ידי אלקטרופורזה בג ג'ל (איור 2ב).

לאחר שעתוק מבחנה באמצעות תבניות DNA בהתאמה, אנו מאומתים הדור של מוצר mRNA בודד של גודל נכון ו פולי (א) המעקב על ידי אגבה ג ' ל ג'ל בתנאים הדהרפתקאות (איור 3).

כדי לוודא ש-mRNA שנוצר באמצעות פרוטוקול זה מאפשר העברה של מקרופאגים ראשיים (ראה איור 4א, B לניתוחים של כינוטומטים של העשרת החומרים האימונוגנגנטיים של PM ו בידול של bmdm, הצלחנו ליצור קידוד Mrna עבור egfp (איור 5a-C) ולנתח את היעילות של הניתוח על ידי הזרמת cytometric (איור 6א). 100,000 PM או 50,000 BMDM לכל באר של צלחת microtiter מטופל היו מנוכר עם 50, 100 או 200 ng של eGFP mRNA עבור 6, 9 או 24 h. ב-PM ו-BMDM, רמות גבוהות של ביטוי eGFP עלולות להתגלות ב-6 שעות לאחר החצייה. שיעור העברה גדל עם כמות mRNA מנוכר והיה הגבוה ביותר עבור 200 ng mRNA (איור 6B, C). לאחר השעה, שיעור ה50-65 הגיע בערך 6 עד 9 שעות לאחר החצייה (איור 6ב). ב -24 שעות לאחר החצייה, שיעור ההעברה היה נמוך באופן משמעותי לציון ביטוי eGFP שפג תוקפם. לכן, לא צריך להיות מזוהמים בלילה. עבור BMDM, שיעור ההעברה הגיע כ 80-85% (איור 6ג). ירידה בשיעור החצייה לאחר 24 h היה הרבה פחות מבוטא BMDM. לכן, מסכת BMDM יכולה להיות מפועלת בלילה. בשני PM (איור 6D, E) ו bmdm (איור 6F, G), רמת הביטוי של egfp בתאים מזוהמים גדל באופן הזמן ותלויי המינון. והכי חשוב, הליך החצייה לא הזרז את המוות התאי או האפוטוטיים כאשר לא היתה עלייה ב-propidium יודיד-חיוביים (PI) או מקרופאגים V-חיוביים לאחר הניתוח (איור 7א, ב).

יעילות התרגום של הקידוד של mRNAs עבור משתני מתויג של נמו או IKKβ מתותחו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. 300,000 PM לכל טוב של הצלחת 12-באר היו מזוהמים עם 300 ng של mRNA המתאים עבור 6 h. שיעור העבר היה על 60% עבור נמו Mrna ועל 55% עבור IKKβ Mrna (איור 8a, B). כך, שיעורי ההעברה שלהם היו דומים לזה של Efp mRNA המציין שיעור החצייה הכללי של כ 55% עבור PM.

השתמשנו גם בפרוטוקול זה כדי ליצור קידוד mRNA עבור recombinase. הזיהום של 400,000 BMDM של נמוflox/flox עכברים17 לכל טוב של הצלחת 12-היטב עם 400 ng של היצור recombinase mrna הביא דלדול כמעט מלאה עבור חלבון נמו לאחר 48 h (איור 9) המציין העברה יעילה מאוד של bmdm.

PM ו-BMDM לא הפרישות כמויות לזיהוי של IL-1β, IL-6 ו-TNF לאחר הזיהום (איור 10א, ב). יתר על כן, המסלולים NF-kB ו-MAPK איתות לא הופעלו לאחר הדלקת16 המציין כי הליך החצייה אינו מפעיל איתות proinflammatory. אנחנו גם לא הבחנו שינויים פונקציונליים של מקרופאגים מזוהמים בהשוואה מקרופאגים מזוהמים16.

איור 1: לינריזציה של הפלמידים של נמו קידוד כבר מכיל T7 מקדם בכיוון הנכון. (א) קטע הרצף של הקידוד הפלמיד עבור הדגל-מתויגנמוWT או נמוC54/347A. T7 מקדם בכיוון הנכון וקרוב לרצף kozak ולהתחיל קודון כבר נוכח. האזור T7 מקדם-מקדם, רצף הקידוד (תקליטורים) עבור תג הדגל ו-נמו, הקודים של ההתחלה והעצירה ואתר ההגבלה עבור לינריזציה עם XbaI מסומנים בצבע. (ב) נציג 1% העלה ג'ל המציג את הפלמידים לפני ואחרי שינלון עם xbal; 1 μL של דנ א לא מטופל, או מטוהרים ליין באמצע DNA היה טעון לנתיב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: T7 מקדם מצורף לikkß קידוד הפלמיונים על ידי ה-PCR. (א) קטע רצף של קידוד פלמיד עבור דגל-Tagged IKKβWT או IKKβS177/181e. הפלמידים אינם מכילים מקדם T7 מתאים, שהוא מחובר אפוא על ידי ה-PCR. מיקום, כיוון ורצף של התחל הקדמי (המכיל את רצף T7 מקדם להוספה) ואת התחל הפוכה מצוינים על ידי החיצים. האזור T7 מקדם, התקליטורים עבור תג הדגל ו-IKKβ ומתגי ההתחלה והעצירה מסומנים בצבע. (ב) נציג 1% העלה ג'ל המאמת את הדור של מוצר PCR אחד בגודל הנכון באמצעות התחל המצוין לעיל. 1 μL של מוצר ה-PCR הטהור נטען לנתיב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סינתזה mRNA מתוך נמו-And IKKβ-קידוד תבניות DNA. (א) נציג ה1.2% agarose ג'ל המכיל 0.7% פורמלדהיד מראה mrna מטוהרים של נמו ו IKKβ בנייה לפני ואחרי פולי (א) עוקב. 2 μL של נמוWT, נמוC54/347a, IKKβWT ו IKKβS177/181e mrna נטענו למסלול. סולם של 32 μL ssRNA נטען לקביעת אורך RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח ציטומטלי זרימה של העשרת האימונוגנטיות של PM ומעמד הבידול של BMDM. (א) אחוז השיעור F4/80+/cd11b+ PM בשטיפה הצפק לפני ואחרי ניתוח העשרה שנותחו על ידי הזרמת הציקלנסה. (ב) ביטוי של F4/80 ו-CD11b על ידי bmdm לאחר 6 ימים של בידול אומת על ידי cy, הזרמת לנסות. 10,000 או 5,000 תאים נספרו לכל מדגם, בהתאמה. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של n = 3 ניסויים עצמאיים, כל אחד. * P < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * * * p < 0.0001 על-ידי מבחן t של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: סינתזה mRNA עם פולי (A) במעקב של eGFP. (א) קטע רצף של קידוד פלסמיד עבור egfp. הפלביניים אינו מכיל מקדם T7 מתאים, שהוא מחובר אפוא על ידי ה-PCR. מיקום, כיוון ורצף של התחל הקדמי (המכיל את רצף T7 מקדם להוספה) ואת התחל הפוכה מצוינים על ידי החיצים. T7 מקדם את האזור, את התקליטורים עבור eGFP והתחל ולהפסיק הקודונים הם בצבע מקודד. (ב) נציג 1% agarose ג'ל המציג את האמפליצין הטהור לאחר ה-PCR באמצעות התחל המצוין לעיל. 1 μL של מוצר ה-PCR הטהור נטען לנתיב. (ג) נציג מ1.2% agarose ג'ל המכיל 0.7% פורמלדהיד מראה mrna מטוהרים של egfp לפני ואחרי פולי (א) עוקב. 2 μL של eGFP. סולם של 32 μL ssRNA נטען לקביעת אורך RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים הצפק ו BMDM עם eGFP mRNA. מקרופאגים היו מודבטים עבור 6, 9 או 24 שעות עם 50, 100 או 200 ng של eGFP mRNA מראש כדי jetMESSENGER או עם jetMESSENGER לבד (ללעוג) ולאחר מכן נותחו על ידי הזרמת cy, try. (א) האסטרטגיה המשמשת להגדיר את האוכלוסיות של מקרופאגים קיימא, קיימא egfp+ מקרופאגים ו-PI+ (כלומר, מת) מקרופאגים. נתונים מייצגים עבור העברה עם 200 מציג mRNA עבור 6 h מוצגים. (ב, ג) שיעורי ההעברה של (ב) PM ו-(ג) bmdm נקבעו על ידי ניתוח האחוז של תאים egfp-חיוביים הקיימא על ידי זרימה cy, לנסות (n = 5-7 ו n = 4-5 ניסויים עצמאיים, בהתאמה). (D-G) רמות ביטוי של eGFP נקבעו על ידי ניתוח העוצמה הפלואורסצנטית ממוצע (MFI) של קיימא (D) pm ו-(F) bmdm ואת משנה קיימא ו-egfp-האוכלוסיה החיובית (E) pm ו (ז) bmdm (n = 5-7 ו-n = 4-5 ניסויים עצמאיים, בהתאמה). 10,000 תאים נספרו לכל מדגם. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. נ = אינו משמעותי; * P < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * * * p < 0.0001 על-ידי מבחן t של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: העברה אינה מזרז מוות תאי ליטיק או אפוטוטית. הזיהום הנגרם ממוות התאים של (א) PM ו-(ב) bmdm נקבע על ידי ניתוח אחוז התאים PI-חיוביים ו-V-חיוביים מבית (n = 5-7 ו-n = 4-5 ניסויים עצמאיים, בהתאמה). האחוז של מקרופאגים מתים נוכח בדגימות בלתי מבוקר (מידה מסוימת של מוות התאים נגרם על ידי ניתוק פיזי של מקרופאגים מן הבארות למרות השימוש של לוחיות שאינן מטופלות) היתה מופחתים כי בדגימות מבוקר בהתאמה רק לקחת בחשבון תא מוות הנגרמת על ידי הליך החצייה. האסטרטגיה המ, המשמשת להגדרת האוכלוסיות של PI+, מקרופאגים v+ ו-PI+/שקסין v+ המקרופאגים מוצגים עבור מערכת נתונים ייצוגית של PM Transfected זוהמים ב-200 ng mrna עבור 6 h מוצגים. סטרוספורטין (50 μM עבור 1 h) שימש כשליטה חיובית. 10,000 תאים נספרו לכל מדגם. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. n.d. = אינו זיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: שיעורי העברה באמצעות קידוד mRNA עבור מבנים של נמו ו-IKK. שיעורי העברה באמצעות קידוד mRNA עבור (א) נמו בנייה ו (ב) ikk בנייה היו מומלו על ידימיקרוסקופimmunofluorescence (n = 4 ניסויים עצמאיים). סרגל קנה מידה = 4 μm. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. n.t. = לא מנוכר, נ = לא משמעותי; * P < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * * * p < 0.0001 על-ידי מבחן t של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: העברה של נמוחליל/חליל bmdm עם הקידוד mrna עבור recombinase התוצאות מחסור כמעט לחלוטין עבור נמו. BMDM מתוך העכברים נמוחליל/חליל היו מצוידים עם הקידוד mrna recombinase עבור 48 h. מחסור בחלבון נמו כתוצאה של הנוק-אאוט מתווך העריכו על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים לזהות נמו או β-actin וכימות על ידי densi, try (n = 5 ניסויים עצמאיים). נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * * * p < 0.0001 על-ידי מבחן t של הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: החצייה אינה מהווה תגובה בלתי דלקתית. (A) PM ו (ב) bmdm היו מזוהמים עם קידוד Mrna עבור נמוWT או נמוC54/347A. כמו שליטה חיובית, מקרופאגים נדבקו יסטריה חיידקי בריבוי של זיהום 1 או מגורה עם 5 μg/mL lps או פולי (i:c) עבור 5 h (PM) או 24 h (bmdm). הפרשה של IL-1 β, IL-6 ו-TNF לתוך הסופרנטאנט היתה מונכמת על ידי אליסה (n = 3 ניסויים עצמאיים). נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. n.t. = לא מנוכר, n.d. = לא לזיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. למחברים אין מה לגלות