מאמר שיטה

העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

DOI:

10.3791/60143

⸱

9 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים ראשוניים, מאתגרים transfect כפי שהם מתמחים בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלמידים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים הם תאים phagocytic מתמחה בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. למטרה זו, הם מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRRs). למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect כמו מגיב החצייה ואת חומצות גרעין מנוכר מוכרים לעתים קרובות על ידי PRRs כמו לא עצמי. לכן, העברה החוצה גורמת לעתים קרובות מקרופאג הפעלה והשפלה של חומצות גרעין מנוכר או אפילו בהתאבדות של מקרופאגים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים ראשוניים מורטין כגון מקרופאגים הצפק (PM) ו מח עצם הנגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA בתוך מבחנה מתוך תבניות DNA כגון פלמידים. עם הפרוטוקול הפשוט הזה, שיעורי ההעברה של כ 50-65% עבור PM ו-85% עבור BMDM מושגת ללא רעילות ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של mRNA עבור העברה של מבנים DNA כגון פלמידים והליך החצייה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים הם תאים phagocytic המתמחים זיהוי, בליעת חיידקים משפיל, תאים אפוטוטיים ופסולת הסלולר. יתר על כן, הם עוזרים לארגן את התגובות החיסונית על ידי הפרשה ציטוקינים ו נוגדנים ועל ידי הצגת אנטיגנים לתאי T ו-B תאים. המקרופאגים גם לשחק תפקידים חשובים בתהליכים אחרים רבים, כגון ריפוי הפצע, טרשת עורקים, tuמוריגנזה והשמנה.

כדי להיות מסוגל לזהות מולקולות שאינן עצמיות כגון דפוסי מולקולרי הקשורים לפתוגן (PAMPs) ומולקולות מחוץ למקום כגון דפוסי נזק מולקולריים (DAMPs), מקרופאגים מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRR)1. למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect2 כמו מגיב החצייה3 ואת חומצות גרעין מנוכר4,5,6,7 לעתים קרובות מוכרים על ידי prrs כמו לא עצמי. מסיבה זו, העברה של מקרופאגים באמצעות שיטות כימיות או פיזיות8 בדרך כלל גורמת הפעלה מקרופאג והשפלה של חומצות גרעין מזוהמים או אפילו ב מקרופאג התאבדות דרך פירופציטוזה, צורה של מוות תאים מתוכנת lytic המופעל לאחר הכרה של pמגברים ציטופולימרים/damps כגון DNA או זרים RNA9. העברה ביולוגית של מקרופאגים באמצעות וירוסים כגון אדנוירוסים או וירוסים כמו וקטורים הוא לעתים קרובות יעיל יותר, אך הבנייה של וקטורים ויראליות כגון הוא זמן רב ודורש ברמה אבטחה טיחות 2 ציוד10,11.

כך, למרות מקרופאגים הם הנושא של מחקר אינטנסיבי, ניתוח התפקודים שלהם על הרמה המולקולרית היא הכשלה כי אחד הכלים החשובים ביותר של ביולוגיה מולקולרית, הגלגול של חומצות גרעין בנייה לביטוי אקסוגני של חלבונים, בקושי ישימה. זה לעתים קרובות כוחות חוקרים להשתמש קווי תאים מקרופאג כמו במקום מקרופאגים בתום הכוח. יישומים עבור חומצות גרעין בניית המבנה כוללים ביטוי של גירסאות חלבון מוטציה או מתויג, הבעות יתר של חלבון מסוים, חלבון מחדש ביטוי ברקע נוקאאוט בהתאמה וביטוי של חלבונים ממינים אחרים (g. , היצור recombinase או מדריך RNA ו Cas9 עבור הסתרה המוקד הגן).

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של (בדרך כלל קשה transfection) מקרופאגים ראשוניים, כי הוא murine הצפק מקרופאגים (PM) ו מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA שנוצר מ-DNA תבניות כגון פלמידים. חשוב לעשות זאת, בתוך מבחנה מחוץ לגופית mrna שנוצר באמצעות פרוטוקול זה מכיל את נוקלאוטידים באופן טבעי משתנה 5-מתיל-ctp ו פסאודו-utp כי להפחית את האימונוגלוגניות ולשפר את יציבות4,6,7,12,13. יתר על כן, 5 '-הקצוות של ה-mrna המועתק מחוץ לחומרים מלאכותית הם deזרחנות על ידי פוספספטאז אנטארקטיקה כדי למנוע הכרה על ידי המתקן-I מורכב14,15. זה ממזער את ההכרה החיסונית הטבועה ב-mRNA מתורבת. עם שלנו קל לבצע את הפרוטוקול, שיעורי החצייה בין 50-65% (מקרופאגים הצפק (PM)) ו 85% (BMDM) הגיעו בזמן, וחשוב, אין הרעלת ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט (i) כיצד מושתקים החיסוני mRNA עבור החצייה ניתן להפיק מתוך מבנים DNA כגון פלמידים ו (ii) את ההליך החוצה עצמו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד מקרופאג מעכברים התבצע בהתאם לחוק הגנת בעלי חיים בגרמניה בציות לוועדת האתיקה באוניברסיטת קלן.

הערה: לבצע את כל השלבים ללבוש כפפות. בצע את כל צעדי החצייה תחת מכסה זרימה למינארי כדי למנוע זיהום של התאים. לפני העבודה עם mRNA, לנקות את כל המכשירים כגון פיפטות ומכל משטח עם 70% אתנול ו/או החומר המשפיל של RNAse (טבלת חומרים). ודא כי כל צינורות התגובה הם RNAse-חינם וסטרילי. השתמש רק מים סטרילי, RNAase ללא מדלל. השתמש באופן בלעדי בעצות בצנרת עם מסננים. שינוי עצות הפיפטה לאחר כל צעד מלטף.

1. הדור של תבנית ה-DNA

הערה: תבנית ה-DNA עבור שעתוק מחוץ לחוק mRNA באמצעות פרוטוקול זה חייב להכיל רצף מקדם T7 כדי לאפשר עגינה של RNA פולימראז. אם הפלסטלינה המכילה את רצף ה-DNA של חלבון הריבית כבר מכיל רצף מT7 מכוונת בצורה נכונה במעלה הזרם של רצף העניין, לינריזציה של הפלביניים (ראה שלב 1.1.) צריך להתבצע. אחרת, חבר T7 מקדם לרצף העניינים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR, ראה שלב 1.2.).

  1. לינריזציה של T7 מקדם המכיל פלמידים
    1. הפלמידים של linearize כבר מכילים רצף מסור T7 מסור על ידי העיכול עם אנזים הגבלה חותך במורד הזרם מעבר לסדר הריבית. אחרת, התמלול לא תסתיים כראוי לאחר רצף הריבית.
      הערה: מומלץ להשתמש באנזימי הגבלה העוזבים את הקצוות בוטה או 5 ' תלויים.
    2. לאשר שורה מלאה של הפלסמיד על ידי האגנה ג'ל אלקטרופורזה של דנ א מתעכל נגד מתעכל DNA.
    3. לטהר את ה-DNA לפני השימוש כמו תבנית DNA עבור שעתוק מבחנה mRNA באמצעות ערכת טיהור DNA (טבלת חומרים).
  2. מצורף לT7 הקדם של ה-PCR
    1. השתמש בתחל הקדמי המכיל את הרכיבים הבאים (בסדר המצוין מ 5 ' עד 3 '): כ 5 לחץ דם אקראי במעלה של מקדם מקדם (למשל, GAAAT); רצף הT7 מקדם (טאקאטקקאג); שני Gs נוספים להגברת היעילות המוגברת (GG); החלק הספציפי לרצף היעד ההומוולוגי לרצף הפלביניים המקיף את ההתחלה של הקודון.
      הערה: זה צריך להיות מורכב: 3-6 bp במעלה של רצף kozak ולהתחיל קודון, רצף kozak ולהתחיל קודון (בדרך כלל gccacc atg g), 12-18 bp במורד של ההתחלה קודון. אם רצף הריבית אינו מכיל כבר רצף KOZAK או להתחיל לפתוח, אלה יכולים להיות מחוברים בשלב זה על ידי פשוט כולל אותם ברצף התחל.
    2. לחשב את tm של פריימר קדימה רק על ידי לקיחת בחשבון את החלק הומולוגי לרצף היעד.
    3. כדי להעריך את היווצרות דימרס/סיכת להשתמש ברצף התחל כולו, אשר בקלות יכול לחרוג 50 bp.
    4. השתמש פריימר הפוכה ממוקם במורד במורד המטה של לעצור codon.
      הערה: אם רצף העניין אינו מכיל כבר את הפסקת הפעולה, הוא יכול להיות מצורף בשלב זה על-ידי כלילת הרצף התחל.
    5. השתמש בתחל הקדמי והפוך כדי לבצע PCR באמצעות הגהה באיכות גבוהה עם הגהת (טבלת חומרים).
    6. לאשר את הדור של מוצר אחד ואת הגודל אמפליקון על ידי אגנה ג'ל (g., השתמש 1% agarose ג'ל ו-V קבוע 100 הנוכחי).
    7. לטהר את מוצר ה-PCR לפני השימוש כתבנית DNA עבור תמלול mRNA מתורבת באמצעות ערכת טיהור DNA.

2. הדור mRNA

  1. הפשרת כל הרכיבים של ערכת תמלול מחוץ למערכת (עיין בטבלת החומרים). מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g. . שמור על הקרח עד השימוש
  2. להכין את תערובת התגובה עבור שעתוק מבחנה mRNA ב 0.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת בסדר הבא (נפח כולל של 40 μL): 20 μL של מיקס 10 x מארקה/NTP (כלול בערכת התעתיק של מבחנה mRNA); 0.25 μL של 5-מתיל-CTP (ריכוז סופי (מועדון) הוא 1.25 מ"מ; 50% של CTP סה כ); 0.25 μL של פסאודו-UTP (מועדון לינה 1.25 מ"מ; 50% of הכולל UTP); X μL של תבנית DNA; 2 μL של T7 RNA פולימראז מיקס (כלול בערכת התמלול של מבחנה); Y μL של RNAse-H חינם2O.
    הערה: X הוא אמצעי אחסון המכיל לפחות 1 μg של דנ א. לדוגמה, 1.6 μL מפתרון מלאי 625 ng/μL. Y הוא אמצעי האחסון הרזרבי לנפח הכולל של 40 μL.
  3. מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g. מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות ב 400 סל ד על מערבל תרמי עבור שעתוק מבחנה.
  4. לאחר מכן, הוסף 2 μL של DNase I ישירות לתוך תערובת התגובה להסרת ה-DNA של התבנית. מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
  5. מודקון ב 37 ° c עבור 15 דקות ב 400 סל ד על מערבל תרמי. קח סדרת מחלקים של 2 μl עבור ג'ל הבקרה (שלב 3.3) ולאחסן ב-80 ° c.
  6. עבור פולי (A) לעקוב, להוסיף את הרכיבים הבאים ישירות לתוך תערובת התגובה הקודמת (לנפח הסופי של 50 μL): 5 μL של 10x פולי (A) התגובה פולימראז ו 5 μL של פולי (א) פולימראז (שניהם כלולים ערכת התעתיק של מבחנה mRNA). מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
  7. מודטה את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות ב 400 rpm על thermomixer. קח סדרת מחלקים של 2 μl עבור ג'ל הבקרה (שלב 3.3) ולאחסן ב-80 ° c.
  8. עבור הדרחון של 5 הקצוות-קצות ה-mRNA, להוסיף את הרכיבים הבאים ישירות לתוך תערובת התגובה הקודמת (לנפח הסופי של 60 μL): 3 μL של RNAse-H חינם2O; 6 μL של מאגר התגובות האנטארקטי של 10x באנטארקטיקה; 3 μL של פוספספטאז האנטארקטי (15 יחידות עבור 60 μL תגובה). מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
  9. מודטה את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות ב 400 סל ד על מערבל תרמי.
  10. מחממים הפוך פוספספטאז באנטארקטיקה על ידי הדגירה ב 80 ° c עבור 2 דקות.
    הערה: באופן אידיאלי, השתמש במערבל תרמי נפרד, אל תחכה עד שמערבל הראשון יגיע לטמפרטורה הרצויה.

3. mRNA טיהור

  1. לטהר את המוצר mRNA מוצר באמצעות ערכת טיהור ייעודי RNA (טבלת חומרים).
    1. הוסף X μL של פתרון הימנעות לערבב את התגובה mRNA משלב 2.10. מערבבים על ידי היפוך 5 פעמים. הוסף 300 μL של התמקד בפתרון הכריכה. מערבבים על ידי ליטוף עדין 5 פעמים.
      הערה: X הוא אמצעי האחסון הרזרבי לנפח כולל של 100 μL. לדוגמה, הוסף את הפתרון של 40 μL ל-60 מיקס התגובה של μL mRNA.
    2. הוסף 100 μL של אתנול חופשי של RNAase. מערבבים על ידי ליטוף עדין 5 פעמים.
    3. מקם עמודת מסנן באחד מצינורות האוסף שסופקו. העבר את מיקס התגובה mRNA בעדינות אל מרכז המסנן מבלי לגעת במסנן. צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    4. הרם בזהירות את עמודת המסנן והשמט את הזרימה בצינור הגבייה. הצב את עמודת המסנן בחזרה לאותה צינורית אוסף.
    5. הוסף 500 μL של הפתרון לשטוף (לא לשכוח להוסיף 20 מ ל של אתנול חינם RNAase לפני שימוש בפתרון לשטוף בפעם הראשונה).
    6. צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות ב RT. חזור על הצעדים 3.1.4-3.1.6 לשטוף עוד פעם אחת.
    7. צנטריפוגה במהירות מלאה (17,900 x g) עבור 1 דקות ב-RT כדי להסיר כל נוזל שיורית מעמודת המסנן. קח בזהירות את עמודת המסנן מצינור האיסוף. הצב את עמודת המסנן בצינור אוסף חדש.
    8. הוסף 50 μL של מאגר הימנעות למרכז המסנן מבלי לגעת במסנן. מודקון ב 65 ° c עבור 10 דקות על מערבל תרמי.
    9. צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות בשעה RT. הסר את עמודת המסנן והתעלם ממנה.
  2. למדוד את הריכוז ואת הטוהר של mRNA, למשל, באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume כדי למדוד ספיגת ב 260 ו 280 nm.
    הערה: יחס A260/A280 של 1.8-2.1 מעיד על mRNA מטוהרים מאוד.
  3. ודא נוכחות של מוצר בודד, אורך תעתיק נכון ו-פולי (א) לעקוב אחר על ידי ניתוח האליבטים מתוך שלבים 2.5 ו 2.7 על ידי אגנה ג'ל אלקטרופורזה תחת התנאים המאחדים (למשל, השתמש ב1.2% agarose ג'ל המכיל 20 מ"מ 3-(N-גוורולינו) חומצה propanesulfonic [מגבים], 5 מילימטר אצטט נתרן, 1 מ"מ EDTA ו 20% פורמלדהיד ולרוץ 20 מ"מ מגבים, 5 mM אצטט נתרן, 1 מ"מ EDTA ו 0.74% פורמלדהיד ב 100 V קבוע זרם.
  4. אחסן את ה-mRNA הטהור בצינור האלויון ב-80 ° c עד לאחר החצייה. אם השימוש רק בכמויות נמוכות של ה-mRNA לאחר מכן, השתמש ב-mRNA כדי להימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאת ההקפאה.
    הערה: mrna ניתן לאחסן ב-80 ° c עבור 1 שנה.

4. הכנה למקרופאג

  1. המתת חסד C57/BL6 עכברים (להשתמש בעכברים של אותו מין ו של 6-24 שבועות של גיל) על ידי פריקה צוואר הרחם.
    הערה: העכברים אותו ניתן להשתמש עבור בידוד של PM (שלב 4.2) והדור של BMDM (שלבים 4.3 ו 4.4). לבידוד של השימוש ב-PM לפחות שני עכברים. אם רק BMDM יש ליצור עכבר אחד בדרך כלל הוא מספיק.
  2. העשרת מקרופאגים. בצפק מגנטיים
    1. מילוי מזרק 10 מ ל עם צינורית ב0.9 x 40 מ"מ עם 8 מ ל של תמיסת מלח באגירה קרה (PBS) ו-2 מ ל של אוויר. . רוקן את חלל הצפק עם הערוץ האוויר יהיה ליצור בועה כי ממזער את הדליפה של ה-PBS.
    2. לאסוף במהירות שאיפה הצפק עם מזרק אותו ולהעביר לתוך צנטריפוגה mL חרו50 א חרוט. לשלב תאים הצפק של עכברים מרובים במידת הצורך. . שמור על השעיית תא בקרח
    3. תא צנטריפוגה מושעה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 5 מ ל של 0.2% הנאגל עבור 30 s למטה כדוריות הדם האדומות.
    4. הוסף 5 מ ל של 1.6% לנפח כולל של 10 מ ל כדי להוות מחדש תנאי איזוטוניקה. צנטריפוגה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    5. למחוק את supernatant ולהשעות את הגלולה תא ב 97.5 μL של מיון תא מגנטי (MCS) מאגר (2 מ"מ חומצה ethylenediams התרופה [EDTA], 5% בסרום שור אלבומין [BSA] ב PBS) ל 1 שטיפה הצפק (למשל, אם שלושה עכברים היו סומק, להשהות ב 292.5 ).
    6. הוסף 2.5 μL של חרוזים פאראמגנטים מצוCD11b ל-נוגדן ספציפי לכל 97.5 μL של השעיית תא (למשל, להוסיף 7.5 μL כדי 292.5 μL).
    7. דגירה על קרח עבור 15 דקות ב 150 סל ד על שייקר מסלולית.
    8. תא צנטריפוגה מושעה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, למחוק את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא 1 מ ל של מאגר mcs.
    9. הוסף 4 מ ל של מאגר MCS לנפח כולל של 5 מ ל ולשטוף את התאים על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה שלוש פעמים.
    10. חזור על הצעדים 4.2.8 ו 4.2.9 פעמיים נוספות עבור סך של שלושה שלבים לשטוף.
    11. במהלך שלבי הכביסה מניחים עמודת LS במפריד תאים מגנטי (ראו טבלת חומרים). שטוף את העמודה עם 3 מ ל של מאגר MCS.
      הערה: להימנע כל בועות כמו אלה עשויים לסתום את העמודה.
    12. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מאגר MCS. הוסף 3 מ ל של מאגר MCS לנפח כולל של 4 מ ל, לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה שלוש פעמים.
    13. העבר את 4 mL של השעיית תא על עמודת LS שוטפים.
      הערה: שוב, להימנע כל בועות כמו אלה עשויים לסתום את העמודה.
    14. המתן עד שמאגר העמודה יהיה ריק לחלוטין. אל תוסיף נוזל נוסף עד שהעמודה תפסיק לטפטף.
    15. הוסף 3 mL של מאגר MCS אל העמודה. לאחר מכן, המתן עד שמאגר העמודה יהיה ריק לחלוטין. חזור על השלב 4.2.15 עוד פעמיים.
    16. הצב את עמודת LS בשפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל. החלת 5 מ ל של מאגר MCS על העמודה. המתן עד 2 מ ל של נוזל עבר דרך הטור, ואז להשתמש בבוכנה כדי לדחוף בעדינות את השבר הנותר לתוך הצינור.
    17. תא צנטריפוגה מושעה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהיפטר supernatant.
    18. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של DMEM בתוספת של 10% סרום עגל עוברי העובר בחום (FCS) (Dמאמ + FCS).
    19. לקבוע את מספר התאים הקיימא על ידי ספירה של הפתרון הכחול בתוך כדוריות התאים והזרעים של נויבאואר ב-Dמאמ + FCS לתוך לוחיות התרבות.
      הערה: זרעים PM בצפיפות של 100,000 תאים/גם בלוח מיקרוטיטר התחתון שטוח. אין להשתמש בלוחות שטופלו על-ידי הרקמה כאשר PM לא ניתן להתנתק מאלה. במקום זאת, השתמש בלוחות שאינם מטופלים.
  3. דור של BMDM
    1. הסרת העור והשרירים מהרגליים האחוריות באמצעות זוג מספריים. רוחצים כל רגל באמצעות שטיפה קצרה ב-70% אתנול.
    2. ניתוק הרגליים ופתיחת שני קצות עצם הירך והשוקה על ידי חיתוך עם מספריים.
    3. מילוי מזרק 5 מ ל ממולא בצינורית של 0.6 מ"מ x 30 מ"מ עם 5 מ ל של אנדוטוקסין נמוך מאוד (VLE) RPMI 1640 ולשטוף את מח העצם מתוך העצמות הפתוחות לתוך צלחת תרבות.
    4. שילוב מח עצם של עכברים מרובים אם נדרש על ידי שלבים חוזרים 4.3.1-4.3.3. העבר את מח העצם לתוך שפופרת 50 צנטריפוגה ל חרוט.
    5. צנטריפוגה את מח העצם ההשעיה ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהיפטר supernatant.
    6. השהה מחדש את הגלולה בתא 5 מ ל של מאגר פירוק של תא דם אדום (8.3% NH4Cl, 0.1 M טריס) ו דגירה עבור 5 דקות ב-RT כדי לעבור את כדוריות הדם האדומות.
    7. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 650 x g ב 4 ° צלזיוס עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
    8. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של VLE RPMI 1640 בינונית בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% HEPES, 1% נתרן פירובט ו 10 ng/mL רקומביננטי מקרופאג המושבה מגרה גורם (M-שדרתי) (RPMI++ + + +).
    9. הוסף 4 מ ל של RPMI+ + + + + לנפח כולל של 5 מ ל.
    10. הכינו 5 92 mm x 16 מ"מ מנות פטרי לא מטופלות עם מצלמות (לראות את הטבלה של חומרים) לכל עכבר על ידי ליטוף 7 מ ל של RPMI+ + + + + בינוני לתוך כל מנה.
    11. העבר את 1 מ ל של פתרון התא ל 5 מנות תרבות מוכנות ב-37 ° c ו-5% CO2.
    12. לאחר 4 ימים, האכילו את התאים על-ידי הוספת 4 מ ל של RPMI++ + + +. לאחר 6-7 ימים, התאים מח העצם מובחנים במלואם ל BMDM.
  4. קציר של BMDM
    1. הסירו לחלוטין את המדיום ממאכלי התרבות. הוסף 5 מ ל של חם 0.2 mM EDTA ב-PBS לכל מנה.
    2. מגרדים בעדינות את כל הצלחת עם מגרד התא כדי לנתק את BMDM. שלבו את השעיות התא בשפופרת צנטריפוגה של 50 mL.
    3. . רוקן את כל 5 המנות שוב השתמש באותו כמות של 5 mL של חם 0.2 mM EDTA ב-PBS עבור כל 5 מנות. שלב זה השעיה התא עם אחד מהשלב הקודם.
    4. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 650 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהיפטר supernatant.
    5. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של VLE RPMI 1640 בינונית בתוספת 10% FCS, 1% HEPES, 1% נתרן פירובט ו 10 ng/mL רקומביננטי M-שדרתי, אבל לא אנטיביוטיקה (RPMI++ + +).
    6. קבע את מספר התאים הפעילים על-ידי ספירת התמיסה הכחולה ב-RPMI+ + + לוחיות התרבות של נויבאואר.
      הערה: זרעי BMDM בצפיפות של 50,000 תאים/מקסימום היטב בלוח מיקרוטיטר התחתון שטוח. אל תשתמשו ברקמות הרקמה המטופלת כמעט לא ניתן להתנתק מאלה. במקום זאת, השתמש בלוחות שאינם מטופלים.

5. התמרה של מקרופאגים עם mRNA

  1. חישוב הנפח הנדרש של מאגר החצייה של mRNA.
    הערה: הנפח של מאגר החצייה mRNA הנדרש תלוי בגודל טוב: השתמש 200 μL עבור העברה בצלחת 6-באר, 100 μL בצלחת 12-באר וכן הלאה. תמיד להוסיף קצת נפח רזרבי בגלל אובדן ליטוף (אבל לא יותר מדי, כדי למנוע דילול מופרז של mRNA). לדוגמה, השתמש ב-450 μL במקום 4 x 100 μL = 400 μL כדי להשתמש ב-4 בארות של צלחת 12-היטב.
  2. חשב את הנפח הנדרש של מגיב החצייה של mRNA. התוספת הכימית של mRNA נוספת ביחס של 1:50. לדוגמה, 9 μL של מגיב העברה של mRNA נדרש עבור נפח סופי של 450 μL.
  3. חשב את הסכום הכולל של mRNA הנדרש. לפחות 100 ng לכל 100,000 מקרופאגים נדרשים עבור הזיהום יעיל, 200 ng עובד אפילו טוב יותר (למשל, 800 mRNA כדי transfection 400,000 מקרופאגים).
    1. הכפל את הסכום המחושב של mRNA הנדרש עם המספר הכולל של בארות שצריך להיות מנוכר (למשל, 4 בארות עם 400,000 מקרופאגים כל: 4 x 800 ng = 3,200 ng mRNA נדרש בסך הכל עבור כל הבארות). לדוגמה, אם מלאי mRNA הוא 426.8 ng/μL, 7.49 μL נדרשים עבור העברה אופטימלית של 4 בארות עם 400,000 מקרופאגים כל אחד.
  4. הוסף את אמצעי האחסון המחושב של מאגר החצייה של mRNA (שלב 5.1.) פחות את אמצעי האחסון עבור מגיב החצייה של mRNA (שלב 5.2) ו-mRNA (שלב 5.3) לשפופרת תגובה. לדוגמה, 450 μL-9 μL-7.49 μL = 433.51 μL.
  5. להפשיר את המניה mRNA ולערבב אותו על ידי היפוך עדין של צינור להתחמק. הוסף את אמצעי האחסון המחושב של mRNA (שלב 5.3) לצינור התגובה עם מאגר התגובה mRNA (בדוגמה המוצגת לעיל: 7.49 μL ב 433.51 μL).
  6. מערבולת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
  7. מערבולת הזיהום של mRNA מגיב עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
  8. הוסף את אמצעי האחסון המחושב של מגיב ההעברה של mRNA (שלב 5.2) לצינור התגובה המכיל את מאגר החצייה של mRNA ואת mRNA (בדוגמה המוצגת לעיל: 9 μL של מגיב החצייה של mRNA).
  9. מערבולת תערובת עבור 5 s ו ספין למטה עבור 2 s ב 2,000 x g.
  10. דגירה עבור 15 דקות ב RT.
  11. בינתיים, להחליף את מדיום התרבות של מקרופאגים עם מדיום טרי, התרבות החם (ראה שלבים 4.2.18. and 4.4.5).
  12. לאחר הדגירה שלב 5.10, להוסיף את תערובת התרגום לבארות המכילים את מקרופאגים בכרך המתאים לגודל של הבאר (ראה שלב 5.1). הוסיפו את התערובת הנפתחת בעיגול מבחוץ לאמצע הבאר.
  13. בעדינות לנדנד את הצלחת, הראשון באנכי ולאחר מכן בכיוון אופקי כדי להבטיח פיזור אחיד של תערובת הזיהום בבאר. ואז, הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2. סינתזה של חלבון מקודד על ידי mRNA מזוהמים יחל זמן קצר לאחר הזיהום. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הדגירה לפחות 6 h.
  14. לאחר הדגירה, לנתח את יעילות הזיהום על ידי (חיסונית) מיקרוסקופ פלואורסצנטית, זרימה cy, לנסות או כתמי החיסונית16, או להשתמש מקרופאגים מזוהמים לניסוי הבחירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור קידוד mRNA עבור הדגל-מתויג נמו ו IKKβ משתנים עבור העברה של מקרופאגים הראשי16. קידוד הפלמידים עבור דגל-מתויג פראי (נמוWT) ו C54/347a וטציה נמו (נמוC54/374a) (לראות את הטבלה של חומרים) כבר מכיל מקדם מקדם T7 בכיוון הנכון (איור 1א). כדי ליצור תבניות דנ א. לתמלול של מבחנה למטרה זו, 10 μg של ה-DNA פלמיד היו מתעכל עם 5 μL Xbal וכתוצאה מכך שינלון של הפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי בדרך כלל קשה ל-transfection עם העתק מחוץ לגופית mRNA. חשוב לציין, העברה של מקרופאגים באמצעות פרוטוקול זה לא לגרום למוות התאים או להפעיל איתות proinflammatory המציין כי לא מגיב החצייה או mRNA מנוכר מזוהים כמו לא עצמי.

איכות ה-mRNA היא בעלת חשיבות מרכזית עבור העברה מוצלחת של מקרופאגים באמצעות פרוטוקול זה. לכן, יש לקחת טיפול רב כי mRNA לא בא במגע עם RNAses למשל, דרך מאגרים מזוהמים או מבחנות). אם בספק, בדוק אם יש ירידה ב-mRNA (לדוגמה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה הזאת נתמכת על ידי הגרמני בפורשיגומיייסמייססביסי (SFB 670).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-מתיל-CTP (100 מ"מ)Jena BiosienceNU-1138Sמאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
פוספטאז אנטארקטיNew England BioLabsM0289מאוחסן ב-20 מעלות; C
מאגר תגובת פוספטאז אנטארקטי (פי 10)New England BioLabsB0289מאוחסן ב-20 מעלות; C
anti-NEMO/IKKγ נוגדןInvitrogenMA1-41046מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות;
נוגדן C אנטי-&בטא;-אקטיןSigma-AldrichA2228מאוחסן ב-20 מעלות; C
צלחות פטרי 92,16 מ"מ עם מצלמותSarstedt821,473מאוחסנות ב-RT
CD11b מיקרו-חרוזים עכבר ואדםMiltenyi Biotec130-049-601מאוחסנות ב-4 מעלות; C
Cre recombinase + T7-Promotor קדימה פריימרSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, מאוחסן ב-20° C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, מאוחסן ב-20°
ערכת טיהור DNA C: ערכת טיהור PCR QIAquickQiagen28104מאוחסנת ב-RT
eGFP + T7-Promotor קדימה פריימרSigma-Aldrich5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, מאוחסן ב-20° C
eGFP + T7-Promotor פריימר הפוךSigma-Aldrich5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, מאוחסן ב-20°; C
מאגר עיכול מהיר (פי 10)Thermo ScientificB64מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
פולימראז בנאמנות גבוהה עם הגהה: Q5 High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England Biolabs IncM0491Sמאוחסן ב-20 מעלות; C
IKKβ + T7-Promotor קדימה פריימרSigma-Aldrich5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, מאוחסן ב-20 ° C
IKKβ + T7-Promotor reverse primerSigma-Aldrich5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, מאוחסן ב-20°
ערכת שעתוק mRNA Cin vitro ערכת שעתוק mRNA: ערכת mRNA HiScribe T7 ARCA (עם זנב polyA)New England BioLabsE2060מאוחסן ב-20 מעלות; עמודות C
LSMiltenyi Biotec130-042-401מאוחסנות ב-RT
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303מאוחסנות
במאגר טרנספקציה ומגיב RT mRNA: jetMESSENGERPolyplus transfection409-0001DEמאוחסן ב-4 מעלות; C
מוטציה IKKΒ IKK-2S177/181E פלסמידAddgene11105מאוחסן ב-20 מעלות; C
Mutant NEMOC54/347A פלסמידAddgene27268מאוחסן ב-20 מעלות; C
pEGFP-N3 פלסמידAddgene62043מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
poly(I:C)Calbiochem528906מאוחסן ב-20 מעלות;
C pPGK-Cre פלסמידF.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, גרסאות חדשות של Cre recombinase הניתן להשראה: מוטציה חדשה של חלבון היתוך Cre-PR מציגה רגישות משופרת וטווח מורחב של השראה. חומצות גרעין Res. 29, 47e (2001). מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
פסאודו-UTP (100 מ"מ)Jena BiosienceNU-1139Sמאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; מפריד C
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976מאוחסן
בנוגדנים RT Rat-anti-mouse CD11b, BioLegend מצומד APC101212מאוחסן ב-4 מעלות; C
נוגדן עכברוש-אנטי-עכבר F4/80,eBioscience12-4801-82מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
רקומביננטי M-CSFPeprotech315-02מאוחסן ב-20 מעלות;
ערכת טיהור C RNA: ערכת ניקוי שעתוק MEGAclearThermoFisher ScientificAM1908מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות; C
חומר פעילי שטח משפיל RNAse: RnaseZAPSigma-AldrichR2020מאוחסן ב-RT
Ultrapure LPS מ-E.coli O111:B4Invivogenמאוחסן ב-20 מעלות; C
Wild מסוג IKKΒ פלסמידAddgene11103מאוחסן ב-20 מעלות; C
פלסמיד NEMO מסוג פראAddgene27268מאוחסן ב-20 מעלות; ג
מצומד PE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

mRNAPolyA

מאמרים קשורים