הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

8.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60147

⸱

27 בפברואר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים טכניקות לבידול אינדוקציה של שני קווי אפיתל השד, HC11 ו EpH4. בעוד ששניהם דורשים סרום עגל עוברי, אינסולין, ו פרולקטין לייצר חלבונים חלב, EpH4 תאים יכולים להבדיל באופן מלא לתוך ממוגרפיה בתרבות תלת ממדית. המודלים המשלימים הללו שימושיים למחקרים של הneoplasia בידול ומדידה.

תקציר

קדהרנס ממלאים תפקיד חשוב בוויסות בידול התא וכן בneoplasia. כאן אנו מתארים את המקורות ואת השיטות של אינדוקציה של הבידול של שני העכבר שורות האפיתל התאים, HC11 ו EpH4, ואת השימוש שלהם ללמוד בשלבים משלימים של התפתחות בלוטת החלב וטרנספורמציה נאופלסטית.

שד HC11 העכבר קו האפיתל מקורו בלוטת החלב של עכבר Balb/c בהריון. זה מבדיל כאשר גדל למפגש מחובר משטח צלחת פטרי פלסטיק בינוני המכיל סרום עגל עוברי ו- Hydrocortisone, אניNsulin ו PROLACTIN (מדיום היפ). בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר את החלבונים בחלב β-קזאין, חלבון חומצי מי גבינה (WAP), בדומה לתאי הנקה המניקה התאים, וצורות בלוטת החלב בצורת בלוטה הנקרא "כיפות".

קו התא EpH4 נגזר באופן ספונטני בלוטת החלב של העכבר תאים אפיתל מבודדים מעכבר Balb/c בהריון. שלא כמו HC11, תאים EpH4 יכולים להבדיל באופן מלא לתוך spheroids (המכונה גם ממוגרפיה) כאשר התרבות תחת תלת מימדי (3D) תנאי גדילה במדיום HIP. תאים הם טריסינטזציה, התלויה ב 20% מטריצה המורכבת מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי אנגלברב-הולם-נחיל (EHS) עכבר בתאי סרקומה, מצופה על גבי שכבה של ציפוי מטריצה מרוכזת צלחת פטרי או צלחת multiwell יטב, מכוסה בשכבה של 10% מטריקס מכיל מדיום הירך. בתנאים אלה, תאי EpH4 מהווים מספרואידים חלולים המוצגים קוטביות-בסיס, לומן חלול, ומייצרים β-קזאין ו-WAP.

באמצעות טכניקות אלו, התוצאות שלנו הראו כי עוצמת האות של קדהרין/מירוץ היא קריטית עבור הבידול של תאים HC11. בעוד Rac1 הוא הכרחי עבור בידול ורמות נמוכות של מירוץ המופעלרובוטית v12 להגדיל את הבידול, מירוץ גבוהרובוטית v12 רמות לחסום בידול תוך גרימת neoplasia. לעומת זאת, תאי EpH4 מייצגים שלב מוקדם יותר בידול האפיתל הפטמות, אשר מעוכב על ידי רמות נמוכות אפילו שלמרובוטית v12מירוץ.

מבוא

ברקמות רגילות או גידולים, לתאים יש הזדמנויות נרחבות הדבקה לשכניהם בארגון תלת מימדי, וזה מחקה בתרבות על ידי צמיחת תאים בצפיפות גבוהה. הדבקה תא לתא מתווכת בעיקר באמצעות קולטני קדהרין, המגדירים את ארכיטקטורת התאים והרקמה. מעניין, זה הוכיח לאחרונה כי cadherins גם לשחק תפקיד רב עוצמה התמרה האות, במיוחד הישרדות איתות1. אופן פרדוקסאלי, חלק האותות האלה תא לתא הדבקה הנובע cadherins נמצאו לאחרונה להיות משותפים על ידי בידול וגם neoplasia2. כאן, אנו מתארים שיטות של אינדוקציה והערכה של בידול שני סוגים של הנציג של שד העכבר האפיתל קווים, HC11 ו EpH4.

שד HC11 העכבר האפיתל קו התאים יכול לספק מודל שימושי למחקר של בידול התא אפיתל. תאי HC11 הם קו שנגזר באמצעות פסיקים-1D, שמקורם בבלוטת החלב של עכבר באמצע ההיריון בגודל Balb/c3. בניגוד אחרים פסיקים-1D שיבוטים נגזרים, HC11 שיבוט אין דרישה לשימוש באופן אקסוגנטי מטריצה מוסף או טיפוח עם סוגי תאים אחרים עבור האינדוקציה מחוץ לשני של הגן האנדוגניים β-קזאין על ידי הורמונים lactogenic3. קו תא זה נעשה שימוש נרחב במחקרים בידול כי הוא שמרו מאפיינים חשובים של אפיתל הפטמות נורמלי: HC11 תאים יכול באופן חלקי ליצור מחדש את האפיתל ductal בתוך משטח שומן החלב העבה4. יתר על כן, הם יכולים להבדיל בתרבות דו-ממדית (2d) כאשר גדל למפגש המצורפת משטח צלחת פטרי פלסטיק בנוכחות של סטרואידים כגון Hydrocortisone או דקאמתאסone, בנוסף אניnsulin ו Prolactin (היפ בינוני) חסר גורם גידול עוריות (egf), מעכב של בידול5,6,7. בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר חלבונים חלב כגון β-קזאין ו-WAP, אשר מ על ידי בלוק המערבי בתוך 4 ימים לאחר האינדוקציה. באותו זמן, חלק של תאים HC11 צורות בלוטת הפטמות בצורת בלוטה הנקרא "כיפות" באופן סטוכסטי. כיפות גלויות 4 – 5 ימים לאחר האינדוקציה ולהגדיל בהדרגה בגודל של עד היום 10, במקביל עם גידול בייצור β-קזאין8. מעניין, HC11 תאים בעלי מוטציה p539, ולכן מייצגים מדינה preneoplastic. מסיבה זו, המודל HC11 מתאים באופן אידיאלי כדי לחקור רשתות איתות של בידול בשילוב עם neoplasia באותה מערכת התא.

EpH4 תאים, נגזרת של התאים IM-2, הם קו תא התאים המקורי נגזר במקור באופן ספונטני בלוטת החלב העכבר תאים אפיתל בודד מ באמצע בהריון Balb/c העכבר10. תאים EpH4 טופס אפיתל מונאולאיירס בתרבות 2D, אבל לא להבדיל לתוךמבנים כמו בלוטות 10,11. עם זאת, בעקבות צמיחה תלת-ממדית בחומר המורכב מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי תאים EHS העכבר סרקומה12 (EHS מטריקס, מטריקס, או מטריצות, ראה טבלה של חומרים), בנוסף גירוי עם היפ, EpH4 תאים יכול ללכוד את השלבים הראשוניים של בלוטת החלב בידול. בתנאים אלה, תאי הEpH4 היוצרים בצורת הספרואידים (המכונים גם ממוגרפיה) המוצגים קוטביות-בסיס ולומן חלול, ומסוגלים לייצר את חלבוני החלב הβ-קזאין ו-WAP, בדומה לתאי האפיתל מניקות. בניגוד HC11 תאים, אשר מובחן, וכמה סמנים mesenchymal מהיר13, תאים EpH4 להציג מורפולוגיה גרידא הלומיאל14. תאים EpH4 גם דיווחו לייצר חלבונים חלב בתרבות דו-ממדית באמצעות גירוי עם דקאמתאס1, אינסולין, ו פרולקטין15. עם זאת, גישה זו מונע את המחקר של השפעות רגולטוריות המחקים את מיקרואקולוגיה של בלוטת החלב בתרבות תלת-ממדית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ציפוי תאים HC11

  1. במכסה של זרם למינארי באמצעות טכניקות סטרילי להכין בקבוק עם 50 mL של HC11 cell בינונית: RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 5 μg/mL אינסולין, ו 10 ng/mL EGF (ראה לוח חומרים).
  2. צלחת כ 400,000 תאים לכל 3 ס מ צלחת פטרי: לעבור 2 10 ס"מ, 50% confluent מנות פטרי לתוך עשרים 3 ס"מ מנות במדיום HC11. את התאים יש לפזר היטב אך יש להימנע מייבוש.
    1. לשאוב את המדיום לתוך בקבוקון. בעזרת משאבת ואקום
    2. הוסף 250 μL של טריפסין (ראה טבלת חומרים) לכל לוחית 10 ס מ. מערבולת ולהכות את הצלחת מהצדדים תוך שמירה על אופקי כדי לפזר את טריפסין ולהוציא את התאים המחוברים
    3. להתבונן תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה 4x כדי לוודא את התאים החלו להתנתק מהקצוות לפני ליטוף.
    4. מנושף כ 1.5 מ ל של HC11 בינוני בתוך סטרילי, 9 פסטר בגודל אינץ ' ולהתיז אותו אנכית נגד התאים. לסובב את הצלחת פטרי בעוד גמירה להוציא את כל התאים. אתה חייב לעבוד מהר כדי למנוע ייבוש של התאים.
    5. העבר את כל התאים לבקבוק עם HC11 בינוני ומערבולת.
    6. פיפטה 2 מ ל של השעיית תאים בכל צלחת פטרי 3 ס מ. נענע את מנות פטרי בצורה שווה להתפשט. מניחים את התאים ב 37 ° c, 5% חממה2 .
  3. למחרת, או כאשר התאים הם ~ 90-100% confluent, לשאת את המדיום, ולהחליף אותו עם בינוני עם FBS ואינסולין אבל חסר EGF.

2. הבדלה, ניטור וכימות הHC11 תאים

  1. לאחר גידול התאים בינונית חסר EGF עבור 24 שעות, להוסיף את המדיום בידול (HIP בינונית) עד עשרה 3 לוחות ס מ: RPMI-1640 שיושלם עם 10% FBS, 1 μg/mL hydrocortisone (ראה טבלת חומרים), 5 Μg/ml אניnsulin ו 5 μg/ml Prolactin (ראה לוח חומרים) עד 10 ימים.
  2. לשמור על 10 השני לוחות ס מ כפקדים: שינוי למדיום עם 10% FBS ו 5 μg/mL אינסולין חסר EGF ו היפ.
  3. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים שני התאים מטופלים היפ ופקדים. פיפטה בינוני בזהירות כדי לוודא כי תאים לא לנתק.
  4. כדי לנטר בידול (כלומר, היווצרות "כיפות"), התבונן בתאים הנמצאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור 1א', פאנל שמאלי). אם התאים הם ביטוי חלבון פלואורסצנטית ירוק (GFP), להתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (עירור = 485/20; פליטה = 530/25; הגדלה 240x; 20x המטרה) (איור 1A, הלוחהימני).
  5. כדי לכמת את מידת הבידול, יש לחלץ חלבונים מצלחת פטרי אחת בכל אחד מהתאים והבקרות שטופלו בהיפ-הופ, פעם ביום למשך 10 ימים ולבדוק את הגושים המערביים לβ-קזאין (ראו טבלת חומרים) (איור 1B).
    1. גרד את התאים על הקרח עם 1.5 mL קר פוספט באגירה-מלוחים (PBS) לתוך שפופרת צנטריפוגה מפלסטיק של 1.8 mL.
    2. צנפה את התאים בשעה 350 x, 1 דקות, 4° c.
    3. שטוף במהירות את הגלולה 2x עם הקרח קר הערוץ. . רוקן את כל השאריות
    4. לעשות מאגר פירוק: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 מ"מ ביותר, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"מ Na4P2O7, 1% NP-40, 100 Mm naf, 2 מ"מ Na3VO4, 0.5 mm פנילמתילסוליווריד (pmsf), 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml לוקיטין16. הוסף 100 μL לכל 3 ס מ צלחת פטרי.
    5. להבהיר את הליפוסט על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 10 דקות בקור.
    6. קביעת ריכוז חלבון (ראה טבלת חומרים) וטען 10 – 20 μg של חלבון מכל מדגם ל-10% פוליאקרילאמיד-sds ג'ל.
    7. אלקטרופורזה עבור 15 h ב 45 V, או ב 100 V עבור ~ 2 – 2.5 h.
    8. העברה אל הממברנה התאית או ממברנה PVDF באמצעות מנגנון העברת אלקטרולותרפיה (ראה טבלת חומרים).
    9. בלוק עם החלבון 5% בסרום אלבומין (BSA) ב-Tris מלוחים באגירה עם 0.1% רצף-20 (TBST).
    10. הוסף את הנוגדן העיקרי, עז נגד β-קזאין מדולל 1:2000 או העכבר נגד β אקטין מדולל 1:1000 (ראה טבלת חומרים).
    11. כביסה 3x עם TBST, 5 דקות בכל פעם.
    12. הוסף את הנוגדן המשני, חזרת peroxidase (HRP) מקושרים חמור נגד עז מדולל 1:2500, או HRP מקושרים נגד הסוס נוגדן מדולל 1:10000.
    13. כביסה 3x עם TBST, 5 דקות בכל פעם.
    14. הוסף את הריאגנטים ECL לקרום בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

3. ציפוי וצמיחה תלת-ממדית של תאים EpH4 ב EHS מטריקס

הערה: המטריצה נוזלית בטמפרטורות < 10 ° c ומוצקה בטמפרטורות שלעיל. חנות ב-80 ° c. להפשיר ב 4 ° c בלילה לפני השימוש. טרום לצנן את לוחיות התרבות הרקמה והפיפטה טיפים ב-20 ° c לפני הטיפול ולשמור על מטריקס, צלחות, ו פיפטה טיפים על הקרח כדי למנוע את זה מליצוק.

  1. לגדל תאים EpH4 ב 2D ב RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS ו 5 μg/mL אינסולין (EGF אינו נדרש).
  2. להכין EpH4 הצמיחה בינונית בתוספת 10% (v/v, 3,500 μL) או 20% (v/v 2,000 μL) מטריצה ב2 50 ליטר חרוטי. לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש.
  3. מעיל 10 בארות (1 ס מ2 כל אחד) של 24 צלחת עם 150 μl של מטריצה בלתי מדולל. הפיצו את המטריצה בעזרת עצת פיפטה. להימנע מיצירת בועות. הקש בעדינות את צדי הלוח תוך החזקת האופקי כדי להבטיח שמטריצה תהיה מופצת באופן שווה לאורך החלק התחתון של הבאר.
  4. מודקת את הצלחת 24 הבאר ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי לאפשר את המטריצה כדי לגבש.
  5. טריסילזציה EpH4 תאים כפי שמתואר לעיל עבור HC11 תאים ולספור אותם עם הומוציטוטומטר. העברה 5 x 104 תאים לכל טוב עד 1.5 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה והספין החרוטי ב-250 x g עבור 5 דקות.
  6. . ומניחים את השפופרת על הקרח
  7. השעיית תאים מחדש ב-350 μL של EpH4 בינוני גדילה שיושלם עם 20% מטריצה באמצעות טיפ 1 מ ל צינור בזמן שמירה על שפופרת חרוט על קרח. להימנע בועות. חשוב להבטיח השעיית תא בודד.
  8. לאחר מטריצה השכבה התחתונה התחזק (המטריצה צריכה להופיע שקוף ובהיר בצבע לעומת הציפוי הראשוני של הבארות), להוסיף את 350 μL של השעיית התא לכל מצופה היטב ומקום בחממה2 שכונתיות ב 37 ° צ' עבור ~ 1 h כדי לאפשר את שכבת מטריצה 20% כדי לחזק.
    1. שימו לב לתאים המיקרוסקושים בניגוד לשלב עם מטרת 4x. על תאים בודדים להיות גלויים.
  9. הוסף 200 μL של EpH4 בינונית המכילה 10% מטריצה מעל 350 μL של תאים מושעה 20% מטריצה. מודטה ב 37 ° c.

4. בידול אינדוקציה של תאים EpH4 גדל ב 3D (איור 2)

הערה: מלבד בידול, תאים EpH4 יכול גם לעבור tubulogenesis כאשר מגורה עם HGF (הגידול גורם הצמיחה) בתרבות תלת-ממד. Outgrowths צינורי ניתן לראות לאחר 10 ימים של היפ ו-HGF גירוי.

  1. התחל בידול השראה של תאים EpH4 1 יום לאחר ציפוי במטריצה. הסר בזהירות 150 μL של המדיום העליון המכיל 10% מטריצה מבארות באמצעות קצה הצנרת פלסטיק. הוסף 200 μL של EpH4 בינוני המכיל היפ ו 10% מטריצה.
  2. החלף את המדיום 10% מטריקס-היפ מדי יומיים עד 10 ימים. לגדול בתאי שליטה באותו 10% בינונית מטריצה ללא HIP.
  3. הצגמערך ממוגרפיהלפי ניגוד פאזה (איור 3A, לוח תחתון).

5. tubulogenesis אינדוקציה של תאים EpH4 גדל ב 3D (איור 3A ו 3d)

  1. הכינו 24 צלחות ותאים EpH4 לצמיחה במטריצה כמפורט בשלבים 3.1 – 3.9. היום לאחר ציפוי התאים במטריצה, להסיר את 150 μL של EpH4 בינוני המכיל 10% מטריצה מבארות באמצעות קצה הצינורות פלסטיק. הוסף 200 μL של EpH4 בינוני המכיל 10% מטריצה, היפ, ו 20 ng/mL HGF (ראה לוח חומרים).
  2. להחליף את 10% מטריקס/היפ/HGF בינונית כל 2 ימים עד 12 – 14 ימים.
  3. הצג כדורית מיקרוסקוקטאני באמצעות מטרה 20x או 40x (איור 3a, הלוח הימני).

6. כימות הבידול: בβ המערבי לקזאין

  1. פיפטה בזהירות מתוך מדיום 10% מטריקס-היפ מבארות. לשטוף את 20% שכבת מטריצה 2x עם 350 μL של קרח קר PBS. הרוהרואידים צריכים עדיין להיות נוכחים בשכבת המטריקס.
  2. הוסף 700 – 1000 μL של PBS קר קרח עם 1 מ"מ חומצה ethilenedimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiia בעדינות לנתק את השכבה התחתונה של 100% מטריקס מבאר עם קצה הצנרת כדי לשחזר spheroids נוכח בשכבה זו. טלטל בעדינות למשך 30 דקות ב-4 ° c.
  3. העבר בזהירות את השעיית הספרואיד לשפופרת חרוט. לשטוף את הבארות עם ~ 500 μL של PBS-EDTA לשחזר את הספרואידים שנותרו בבארות ולהוסיף לצינור חרוט.
  4. רוק על קרח עבור 30 דקות נוספות. ודא כי המטריצה התפרקה לחלוטין. אם ניתן לראות את הגושים הגלויים של המטריצה, הוסיפו יותר PBS-EDTA או נענעי יותר.
  5. צנטריפוגה את הפתרון כדי לצנפה את הspheroids ב 350 x g עבור 5 דקות.
  6. מנושף את הסופרנטאנט, מעלה את הספרואידים במאגר לפירוק קרח קר, ומחפש לβ-קזאין, ציקלא D1, וp120RasGAP על ידי המערב כמו בשלב 2.5 מעל16. כמו נוגדנים העיקרי, להשתמש עז נגד β-קזאין מדולל 1:2000, ארנב אנטי ציקלב D1 מדולל 1:2000, ועכבר anti-p120 מדולל 1:2000. עבור נוגדנים משנית, השתמש HRP החמור מקושרים נגד עז מדולל 1:2500, HRP מקושרים החמור נגד הארנב מדולל 1:2500, ו HRP מקושרים סוס נגד העכבר מדולל 1:10000.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זה זמן רב ידוע כי הבידול של תאים אפיתל ו adipocytes דורש המפגש וההתחייבות של קדהרנים2. אנחנו ואחרים הדגמנו שההזיה הסלולרית והאירוסין של E-או N-קדהרין ו קדהרין-11, כפי שהוא מתרחש עם המפגש של תאים מתורבתים, מפעיל עלייה דרמטית בפעילות של מירוץ הקטן gtpases וחילוק התא בקרת חלבון 42 (Cdc42), ותהליך זה מוביל להפעלת interleukin – 6 (IL6) משפחה ציטוקינים ו Stat3 (מתמר האות ו activator של תמלול-316,17)1,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התאים הHC11 מתאימים באופן אידיאלי לחקר הבידול בשילוב עם טרנספורמציה נאופלסטית. יתרון נוסף הוא כי תאים HC11 הם בקלות infectable עם מו-MLV מבוססי וקטורים retroviral יעיל לבטא מגוון של גנים. בידינו, תאים EpH4 היו קשים יותר להדביק עם אותו וקטורים retroviral יעיל מאשר HC112.

מגע מתאים לתאים ומעצר גדילה הם תנאי מפתח עבור בידול התא HC11. כך, כדי להשיג בידול אחיד על פני שכבת התא, חשוב להשיג התפלגות אחידה של תאים בצלחת פטרי בזמן זריעה. דבר זה חשוב במיוחד אם רצוי לכמת את הבידול. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים לגלות.

תודות

קו התא HC11 המסופק באדיבות ד ר ד. מדינה (יוסטון, TX). המחברים אסירי תודה ד ר אנדרו קרייג מאוניברסיטת המלכה עבור הצעות רבות של ריאגנטים ובעלי ערך. תאי EpH4 היו מתנה מדר ' ר. רוסקללי (ונקובר). קולין Schick סיפק סיוע טכני מעולה ללימודי תרבות תלת-ממדית.

הסיוע הכספי של מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR), הקרן הקנדית לסרטן השד (CBCF, אונטריו פרק), סרטן השד הקנדי הברית המחקר , מרכזי אונטריו של מצוינות, סרטן השד פעולה קינגסטון (BCAK) ואת הקרן קלייר נלסון עיזבון באמצעות מענקים LR הוא הודה בהכרת. להיות מקבל תמיכה מענקים CIHR, CBCF, BCAK האגודה לחקר הסרטן Inc. PTG נתמך על ידי יו ר מחקר קנדה, הקרן הקנדית לחדשנות, CIHR, NSERC והחברה הקנדית הסרטן. MN נתמך על ידי הספינה מתוך תוכנית ההכשרה טרי פוקס במחקר טרנסמשמעתי סרטן מ-NCIC, בוגר פרס (QGA), ופרס של דיקן מאוניברסיטת המלכה. ה-MG נתמך על ידי מלגות דוקטורט מתוכנית סרטן השד בארה ב, משרד המחקר והחדשנות של מחוז אונטריו וועדת המחקר המייעצת של אוניברסיטת המלכה. VH נתמך על ידי מלגת דוקטורט של CBCF ומלגת דוקטורט מתוכנית ההכשרה של קרן טרי פוקס בחקר הסרטן הטרנסמשמעתי בשותפות עם CIHR. Hanad אדן היה המקבל של הקיץ NSERC הסירה. BS הייתה נתמכת בתואר בוגר אוניברסיטת המלכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
30% אקרילאמיד/0.8% תמיסת ביסביו ראד1610154ארנב נוגדן נגד
ציקלין D1, סנטה קרוזsc-717עכבר נוגדן נגד p120 ווסטרן בלוטינג
סנטה קרוזsc-373751ווסטרן בלוטינג
אנטי-ובטא; עכבר נוגדן אקטין, טכנולוגיית איתות תאים3700ווסטרן בלוטינג
אנטי ובטא; עז נוגדן קזאין, סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600מאגר ליזה
תמיסת חומצה ביקינצ'וניניתSigmaB9643-1L-KCקביעת חלבון
סרום בקר אלבומיןBio ShopALB007.500קביעת חלבון
בהירות מצע ECL מערביBio Rad170-5061Western Blotting
Copper (II) סולפטסיגמאC2284-25MLקביעת חלבון
DAPIThermofisher ScientificD1306צביעת
DigitoninCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500צביעת
EDTABio ShopEDT001.500
גורם גדילה אפידרמיססיגמאE9644מדיום לתאי HC11
סרום עגל עובריPAAA15-751תרבית תאים בינונית
עז- אנטי ארנב-HRPסנטה קרוזSC-2004Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor רקומביננטיGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9תרבית תאים
סוס נגד עכבר HRPטכנולוגיית איתות תאים7076Western Blotting
HydrocortisoneSigmaH0888HIP
אינסוליןSigmaI6634
HIP מכסה מנוע זרימה למינריתBioGard HoodCell Culture
LeupeptinBio ShopLEU001.10מטריצת חיץ ליזה
(מטריצת Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)קורנינגCACB 354230
עכבר נגד עזים HRPסנטה קרוזsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 ריאגנטCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMמכתים
מיקרוסקופ קונפוקלי רב פוטוןLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850מאגר ליזה
Na4P207Sigma125F-0262מאגר ליזה
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4מאגר ליזה
מצלמה דיגיטלית ניקוןCoolpix 995
ניטרוצלולוזהBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4
מיקרוסקופ ניגודיות שלבאולימפוס IX70תרבית תאים
פנילמתילסופוניל פלואורידסיגמא329-98-6מאגר ליזה
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
פרולקטיןסיגמאL6520HIP בינוני
RPMI-1640סיגמאR8758תא תרבית תרבית רקמות
בינונית צלחת 35Sarstedt83.3900.תרבית תאים
צלחת תרבית רקמות -24 בארSarstedt83.1836.300מנגנון העברת תרבית תאים
CBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.תרבית תאים
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis SystemCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting
, בינוני בינונית צביעה

מקורות

  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
  3. Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
  4. Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
  5. Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
  6. Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
  7. Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598(2015).
  8. Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265(2009).
  9. Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
  10. Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
  11. Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
  12. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
  13. Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26(2009).
  14. Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
  15. Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127(2013).
  16. Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
  17. Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
  18. Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
  19. Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
  20. Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
  21. Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
  22. Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
  23. Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
  24. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
  25. Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  26. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  27. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  28. Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
  29. Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
  30. Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
  31. Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי אפיתל של שד עכברהתמיינות תאי HC11התמיינות תאי EpH4טיפול במצע HIPתרבית מטריצה תלת-ממדיתאנליזת Western Blotמיקרוסקופיית ניגודיות מופעמיקרוסקופיית קונפוקליתויסות אות Racיצירת ממספירות
הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.