Method Article

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

DOI:

10.3791/60147

⸱

February 27th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Molecular Sciences and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston, 2Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto, Mississauga, 3Department of Laboratory Medicine, Brampton Civic Hospital Campus, William Osler Health System, 4Latner Thoracic Surgery Research Laboratories

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים טכניקות לבידול אינדוקציה של שני קווי אפיתל השד, HC11 ו EpH4. בעוד ששניהם דורשים סרום עגל עוברי, אינסולין, ו פרולקטין לייצר חלבונים חלב, EpH4 תאים יכולים להבדיל באופן מלא לתוך ממוגרפיה בתרבות תלת ממדית. המודלים המשלימים הללו שימושיים למחקרים של הneoplasia בידול ומדידה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קדהרנס ממלאים תפקיד חשוב בוויסות בידול התא וכן בneoplasia. כאן אנו מתארים את המקורות ואת השיטות של אינדוקציה של הבידול של שני העכבר שורות האפיתל התאים, HC11 ו EpH4, ואת השימוש שלהם ללמוד בשלבים משלימים של התפתחות בלוטת החלב וטרנספורמציה נאופלסטית.

שד HC11 העכבר קו האפיתל מקורו בלוטת החלב של עכבר Balb/c בהריון. זה מבדיל כאשר גדל למפגש מחובר משטח צלחת פטרי פלסטיק בינוני המכיל סרום עגל עוברי ו- Hydrocortisone, אניNsulin ו PROLACTIN (מדיום היפ). בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר את החלבונים בחלב β-קזאין, חלבון חומצי מי גבינה (WAP), בדומה לתאי הנקה המניקה התאים, וצורות בלוטת החלב בצורת בלוטה הנקרא "כיפות".

קו התא EpH4 נגזר באופן ספונטני בלוטת החלב של העכבר תאים אפיתל מבודדים מעכבר Balb/c בהריון. שלא כמו HC11, תאים EpH4 יכולים להבדיל באופן מלא לתוך spheroids (המכונה גם ממוגרפיה) כאשר התרבות תחת תלת מימדי (3D) תנאי גדילה במדיום HIP. תאים הם טריסינטזציה, התלויה ב 20% מטריצה המורכבת מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי אנגלברב-הולם-נחיל (EHS) עכבר בתאי סרקומה, מצופה על גבי שכבה של ציפוי מטריצה מרוכזת צלחת פטרי או צלחת multiwell יטב, מכוסה בשכבה של 10% מטריקס מכיל מדיום הירך. בתנאים אלה, תאי EpH4 מהווים מספרואידים חלולים המוצגים קוטביות-בסיס, לומן חלול, ומייצרים β-קזאין ו-WAP.

באמצעות טכניקות אלו, התוצאות שלנו הראו כי עוצמת האות של קדהרין/מירוץ היא קריטית עבור הבידול של תאים HC11. בעוד Rac1 הוא הכרחי עבור בידול ורמות נמוכות של מירוץ המופעלרובוטית v12 להגדיל את הבידול, מירוץ גבוהרובוטית v12 רמות לחסום בידול תוך גרימת neoplasia. לעומת זאת, תאי EpH4 מייצגים שלב מוקדם יותר בידול האפיתל הפטמות, אשר מעוכב על ידי רמות נמוכות אפילו שלמרובוטית v12מירוץ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברקמות רגילות או גידולים, לתאים יש הזדמנויות נרחבות הדבקה לשכניהם בארגון תלת מימדי, וזה מחקה בתרבות על ידי צמיחת תאים בצפיפות גבוהה. הדבקה תא לתא מתווכת בעיקר באמצעות קולטני קדהרין, המגדירים את ארכיטקטורת התאים והרקמה. מעניין, זה הוכיח לאחרונה כי cadherins גם לשחק תפקיד רב עוצמה התמרה האות, במיוחד הישרדות איתות1. אופן פרדוקסאלי, חלק האותות האלה תא לתא הדבקה הנובע cadherins נמצאו לאחרונה להיות משותפים על ידי בידול וגם neoplasia2. כאן, אנו מתארים שיטות של אינדוקציה והערכה של בידול שני סוגים של הנציג של שד העכבר האפיתל קווים, HC11 ו EpH4.

שד HC11 העכבר האפיתל קו התאים יכול לספק מודל שימושי למחקר ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציפוי תאים HC11

  1. במכסה של זרם למינארי באמצעות טכניקות סטרילי להכין בקבוק עם 50 mL של HC11 cell בינונית: RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 5 μg/mL אינסולין, ו 10 ng/mL EGF (ראה לוח חומרים).
  2. צלחת כ 400,000 תאים לכל 3 ס מ צלחת פטרי: לעבור 2 10 ס"מ, 50% confluent מנות פטרי לתוך עשרים 3 ס"מ מנות במדיום HC11. את התאים יש לפזר היטב אך יש להימנע מייבוש.
    1. לשאוב את המדיום לתוך בקבוקון. בעזרת משאבת ואקום
    2. הוסף 250 μL של טריפסין (ראה טבלת חומרים) לכל לוחית 10 ס מ. מערבולת ולהכות את הצלחת מהצדדים תוך שמירה על אופקי כדי לפזר את טריפסין ולהוציא את התאים המחוברים
    3. להתבונן תחת מיקרוסקופ ניגודיות פא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה זמן רב ידוע כי הבידול של תאים אפיתל ו adipocytes דורש המפגש וההתחייבות של קדהרנים2. אנחנו ואחרים הדגמנו שההזיה הסלולרית והאירוסין של E-או N-קדהרין ו קדהרין-11, כפי שהוא מתרחש עם המפגש של תאים מתורבתים, מפעיל עלייה דרמטית בפעילות של מירוץ הקטן gtpases וחילוק התא בקרת חלבון 42 (Cdc42), ותהליך זה מוביל להפעלת interleukin – 6 (IL6) משפחה ציטוקינים ו Stat3 (מתמר האות ו activator של תמלול-316,17)1,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התאים הHC11 מתאימים באופן אידיאלי לחקר הבידול בשילוב עם טרנספורמציה נאופלסטית. יתרון נוסף הוא כי תאים HC11 הם בקלות infectable עם מו-MLV מבוססי וקטורים retroviral יעיל לבטא מגוון של גנים. בידינו, תאים EpH4 היו קשים יותר להדביק עם אותו וקטורים retroviral יעיל מאשר HC112.

מגע מתאים לתאים ומעצר גדילה הם תנאי מפתח עבור בידול התא HC11. כך, כדי להשיג בידול אחיד על פני שכבת התא, חשוב להשיג התפלגות אחידה של תאים בצלחת פטרי בזמן זריעה. דבר זה חשוב במיוחד אם רצוי לכמת את הבידול. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קו התא HC11 המסופק באדיבות ד ר ד. מדינה (יוסטון, TX). המחברים אסירי תודה ד ר אנדרו קרייג מאוניברסיטת המלכה עבור הצעות רבות של ריאגנטים ובעלי ערך. תאי EpH4 היו מתנה מדר ' ר. רוסקללי (ונקובר). קולין Schick סיפק סיוע טכני מעולה ללימודי תרבות תלת-ממדית.

הסיוע הכספי של מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR), הקרן הקנדית לסרטן השד (CBCF, אונטריו פרק), סרטן השד הקנדי הברית המחקר , מרכזי אונטריו של מצוינות, סרטן השד פעולה קינגסטון (BCAK) ואת הקרן קלייר נלסון עיזבון באמצעות מענקים LR הוא הודה בהכרת. להיות מקבל תמיכה מענקים CIHR, CBCF, BCAK האגודה לחקר הסרטן Inc. PTG נתמך על ידי יו ר מחקר קנדה, הקרן הקנד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
30% אקרילאמיד/0.8% תמיסת ביסביו ראד1610154ארנב נוגדן נגד
ציקלין D1, סנטה קרוזsc-717עכבר נוגדן נגד p120 ווסטרן בלוטינג
סנטה קרוזsc-373751ווסטרן בלוטינג
אנטי-ובטא; עכבר נוגדן אקטין, טכנולוגיית איתות תאים3700ווסטרן בלוטינג
אנטי ובטא; עז נוגדן קזאין, סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-17971Western Blotting
AprotininBio ShopAPR600מאגר ליזה
תמיסת חומצה ביקינצ'וניניתSigmaB9643-1L-KCקביעת חלבון
סרום בקר אלבומיןBio ShopALB007.500קביעת חלבון
בהירות מצע ECL מערביBio Rad170-5061Western Blotting
Copper (II) סולפטסיגמאC2284-25MLקביעת חלבון
DAPIThermofisher ScientificD1306צביעת
DigitoninCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd14952-500צביעת
EDTABio ShopEDT001.500
גורם גדילה אפידרמיססיגמאE9644מדיום לתאי HC11
סרום עגל עובריPAAA15-751תרבית תאים בינונית
עז- אנטי ארנב-HRPסנטה קרוזSC-2004Western Blotting
Hepatocyte Growth Factor רקומביננטיGibcoPHG0321
HepesSigma7365-45-9תרבית תאים
סוס נגד עכבר HRPטכנולוגיית איתות תאים7076Western Blotting
HydrocortisoneSigmaH0888HIP
אינסוליןSigmaI6634
HIP מכסה מנוע זרימה למינריתBioGard HoodCell Culture
LeupeptinBio ShopLEU001.10מטריצת חיץ ליזה
(מטריצת Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)קורנינגCACB 354230
עכבר נגד עזים HRPסנטה קרוזsc-8360Western Blotting
Mowiol 4-88 ריאגנטCalbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd475904-100GMמכתים
מיקרוסקופ קונפוקלי רב פוטוןLeica TCS SP2
Na3VO4Bio ShopSOV850מאגר ליזה
Na4P207Sigma125F-0262מאגר ליזה
NaClBio ShopSOD001.1Western Blotting
NaFFisher Scientific7681-49-4מאגר ליזה
מצלמה דיגיטלית ניקוןCoolpix 995
ניטרוצלולוזהBio Rad1620112Western Blotting
NP-40Sigma9016-45-9
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4
מיקרוסקופ ניגודיות שלבאולימפוס IX70תרבית תאים
פנילמתילסופוניל פלואורידסיגמא329-98-6מאגר ליזה
pMX GFP Rac G12VAddgene14567
פרולקטיןסיגמאL6520HIP בינוני
RPMI-1640סיגמאR8758תא תרבית תרבית רקמות
בינונית צלחת 35Sarstedt83.3900.תרבית תאים
צלחת תרבית רקמות -24 בארSarstedt83.1836.300מנגנון העברת תרבית תאים
CBS Scientific CoEBU-302Western Blotting
Tris AcetateBio ShopTRA222.500Western Blotting
TrypsinSigma9002-07-7.תרבית תאים
Tween-20Bio ShopTWN510.500Western Blotting
Veritical Gel Electrophoresis SystemCBS Scientific CoMGV-202-33Western Blotting
, בינוני בינונית צביעה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
  2. Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Breast Epithelial CellsHC11 Cell DifferentiationEpH4 Cell DifferentiationHIP Medium Treatment3D Matrix CultureWestern Blot AnalysisPhase Contrast MicroscopyConfocal MicroscopyRac Signal RegulationMammosphere Formation

Related Articles