שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את התצורה של היווצרות droplet (LD) של השומנים במבנה המעי האנושי על גירוי עם חומצות שומן. אנו דנים כיצד משתמשים באותה שיטת לכימות היווצרות LD, וכיצד ניתן להשתמש בה עבור הקרנת תפוקה גבוהה עבור תרופות המשפיעות על היווצרות LD.

Abstract

ליפידים תזונתיים נלקחים כמו חומצות שומן חינם (בדרך) על ידי אפיתל המעי. אלה מintracellularly המרה לתוך הטריגליצרידים (TG) מולקולות, לפני שהם ארוזים לתוך chylomicrons לצורך הובלה לימפה או לתוך השומנים טיפות ציטוסולג (המוני) עבור אחסון תאיים. צעד מכריע עבור היווצרות של ה-"השלד" הוא הפעילות הקטליטית של הדיליליגליל (DGAT) בשלב הסופי של הסינתזה TG. המורדים חשובים לחיץ מינים רעילים השומנים ולווסת את חילוף החומרים הסלולרי בסוגי תאים שונים. מאז אפיתל המעי האנושי הוא התעמת באופן קבוע עם ריכוזים גבוהים של שומנים, היווצרות LD הוא בעל חשיבות רבה כדי לווסת הומאוסטזיס. כאן אנו מתארים את הבקשה הפשוטה לאפיון וככמת של היווצרות LD (LDF) על גירוי עם חומצת שומן בלתי רווי הנפוץ ביותר, חומצה אולאית, ב אורגנואידים המעי האנושי. שיטת ה-ldf מבוססת על הצבע הפלורסנט הספציפי LD LD540, אשר מאפשר כימות של הזדהות על ידי קונפוקלית מיקרוסקופ מיקוד, הקורא צלחת הפלורסנט, או הזרימה cy, try. שיטת LDF ניתן להשתמש כדי לאפיין את היווצרות LD בתאי האפיתל המעי האנושי, או ללמוד אנושי (גנטי) הפרעות המשפיעות על מטבוליזם LD, כגון DGAT1 מחסור. יתר על כן, ניתן להשתמש באפשרות זו גם בצינור תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרכובות טיפוליות הרומן, אשר לשחזר פגמים ביצירת LD במעיים או סוגים אחרים של אורגנואידים.

Introduction

שומנים הם מרכיב חיוני של התזונה האנושית ולשחק תפקיד חשוב אחסון אנרגיה מערכתית ומטבוליזם. כאשר בלע, ליפידים תזונתיים הם מושפל לתוך חומצות שומן בחינם (FFAs) ו monoglycerides (MGs) על ידי lipases הלבלב. מצעים אלה נלקחים לאחר מכן על ידי הנוציטים של האפיתל המעי, שם הם הראשונים מחדש לדיגלידים (DG) על ידי אנזימים מונגליד (MGAT) ולאחר מכן לטריגליצרידים (TG) על ידי diacylגליצרול (DGAT1)¹. לבסוף, האלה משולבים ב-טי. אס. או chylomicrons לייצוא למערכת הלימפה או טיפות השומנים ציטוסולג (השלד) עבור אחסון תאיים^2,3. למרות שchylomicrons נחוצים להפצת שומנים תזונתיים לאיברים אחרים, החשיבות של אחסון שומן תאיים ב-השלד אינה ברורה לחלוטין. עם זאת, המכונה הוכחו לבצע פונקציה תקינה במעי, כפי שהם לאט לשחרר שומנים לתוך המחזור עד 16 h אחרי ארוחה⁴. יתר על כן, המוני הוכחו להגן מפני ריכוזי חומצות שומן רעילים, כגון במהלך התנאים לפני העכבר⁵.

חלבון DGAT1 ממוקם על הממברנה האנדופלזמית (ER) וממלא תפקיד מכריע ב-LD היווצרות ב אפיתל המעי. מוטציות Homozygous ב DGAT1 להוביל שלשול מוקדם התפרצות חמורה ו/או הקאות, היפואלבומין, ו/או (קטלני) חלבון מאבד בידור עם כישלון מעיים על צריכת שומן, הממחישות את החשיבות של DGAT1 הומאוסטזיס השומנים של האדם , אפיתל המעי^6,7,8,9,10 מאז התרחשות של DGAT1-מחסור בבני אדם הוא נדיר, הגישה לתאים שנגזר מטופל הראשי כבר נדיר. יתר על כן, התרבות ארוכת טווח של תאים אפיתל המעי כבר זמן רב מוגבלת קווי הגידול נגזר התאים אשר מייצגים את הפיזיולוגיה נורמלי רק להאריך מוגבל. לכן, היווצרות DGAT1-בתיווך LD למדו בעיקר בפיברותקיעות או בעלי חיים שמקורם שורות תא^7,10,11,12. בתור כזה, זה היה לאחרונה הראו כי DGAT1-לקויה מטופלים נגזר פיברוטים לצבור פחות התעודות לעומת תאים בריאים לאחר גירוי עם חומצה אולאית (OA)⁸.

בעבר, פרוטוקולים הוקמו בתאי גזע האפיתל התרבות מכל איבר העיכול בצורה של תלת מימדי (3D) אורגנואידים¹³. מעיים אלה ניתן לשמור בתרבות במשך תקופה ארוכה של¹³, ולאפשר את המחקר הפונקציונלי של המטופל-ואת המעיים מיקום ספציפי מאפיינים האפיתל¹⁴. הם גנטית, פנופנטיות בדרך כלל יציבה וניתן לאחסן, המאפשר הרחבה ארוכת טווח ו biobanking¹³.

לאחרונה הדגמנו כי היווצרות LD ניתן למדוד בקלות בתוך אורגנואידים המעי האנושי במערך LD (LDF) שיטת⁶. כאשר הם חשופים OA עבור 16 h, אורגנואידים ליצור התעודות כדי להגן על התאים מפני רעילות המושרה ליפיד. כאשר ריכוזי OA גבוהים מדי, התאים מתים על ידי caspase-תיווך ואפופטוזיס⁶. שיטת LDF הוצגה בעבר להיות תלויה במידה רבה ב DGAT1 כפי שצוין על ידי אורגנואידים נגזר מהחולים DGAT1-מוטנטים ועל ידי שימוש במעכבי DGAT1 ספציפיים⁶.

עבור שיטת ה-LDF המתוארת בפירוט כאן, אורגנואידים תלת-ממדיים הם מתורבתים מפני ביופסיות מעיים ומהווים שבועי באמצעות הפרעה לתאים בודדים היוצרים בקלות אורגנואידים חדשים. עבור הפעלת שיטת LDF, ~ 7,500 התאים היחידים הנגזרים אורגאיד מצופים בכל טוב של צלחת 24-הבאר. אורגנואידים נוצרות לאורך מספר ימים, מודלבן לילה עם OA 1 מ"מ ו ויטראז ' עם LD540, תא פלורסנט-מוגדר-LD לצבוע ספציפי המקל הדמיה. היווצרות LD הוא לאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לוחית הפלורסנט קורא, או לזרום cy, לנסות.

על-ידי שינוי קנה מידה זה היווצרות זיהוי LD לפורמט 96-ובכן, הטיפול יכול לשמש גם עבור ניתוח תפוקה גבוהה של היווצרות LD למסך תרופות הרומן המשפיעות על היווצרות LD בתרבויות המעי האנושי מחלות, או ללמוד (האדם הגנטי) הפרעות המשפיעות על . מטבוליזם של LD

Protocol

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות שתוארו במסמך זה אושרו על ידי הוועדה האתית במרכז הרפואי האוניברסיטאי אוטרכט (UMCU). הסכמה מושכלת לאיסוף רקמות, הדור, האחסון והשימוש באורגנואידים הושגו ממטופלים בבית החולים לילדים וילהלמינה (WKZ)-UMCU.

1. הכנת המדיה התרבותית

הערה: הפרוטוקול הזה צריך להתבצע. בתוך ארון בטיחות יש לטפל באורגנואידים על פי ההנחיות הסטנדרטיות לתרבות התא.

1. הכינו את מדיום התרבות הבזליים.
   הערה: בינונית תרבותית ללא גורמי גדילה מכונה בינונית-בסיס (BM).
   1. הוסף 5 מ ל של HEPES (1 M), 5 מ ל של L-glutamin (100x) ו 5 מ ל של פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 U/mL) כדי 500 mL של מתקדם בינונית מתקדמת של דולבקה עם תערובת מזינים של Ham F-12 כדי להכין מדיום BM.
   2. אחסן את מדיום ה-BM המוכן ב-4 ° c והשתמש בו למשך מקסימום 2 חודשים.
2. הכן את R-החתן והראש הבינוני (CM) לפי פרוטוקול היצרן.
   1. בקצרה, לגדול את התאים לכמות הרצויה היפרמבחנות עם 5 x 10⁷ תאים ב 555 mL בינונית ללא אנטיביוטיקה סלקטיבית לכל בקבוקון.
   2. לגדל את התאים 4 ימים עד שוטפת.
   3. החלף את המדיום באמצעות BM ותרבות למשך 8 ימים נוספים.
   4. לאחר 8 ימים של תרבות ב 37 ° c, לאסוף את בינוני התרבות צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g כדי גלולה כל התאים הנותרים.
   5. מסננים מעקר את הסופרנטאנט, ומאחסנים את מאגר ה-R-שדין או את הראש ב-20 ° c למשך שישה חודשים לכל היותר.
3. הכינו Wnt3A-CM לפי Boj ואח '¹⁵.
   1. בקצרה, לגדול את התאים לכמות הרצויה במנות 145 מ"מ עם 2 x 10⁶ תאים בינונית 20 מ ל ללא אנטיביוטיקה סלקטיבית לכל מנה. לעטוף כל מנה עם רדיד פלסטיק כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות.
   2. לאחר 8 ימים של תרבות ב 37 ° c, לאסוף את בינוני התרבות צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g כדי גלולה כל התאים הנותרים.
   3. המסנן מעקר את הסופרנטאנט ומאחסן את הWnt3A-CM ב -4 ° c למשך מקסימום 2 חודשים.
4. הכן מדיום הרחבה אורגאיד.
   הערה: בינונית הרחבה ארגונית מעיים האדם קטן (ראה מתכון בטבלה משלימה 1) מכונה HSI-EM. השלבים הבאים יפיקו נפח סופי של 1 L hSI-EM, וניתן לשנות את גודלם למעלה או למטה כנדרש.
   1. מתמוסס 1.46 g של ניטינאמיד ב 12 מ ל של תרבות תא כיתה פוספט באגירה מלוחים (PBS) כדי ליצור דילול הסופי של 1 M.
   2. לפזר 245 מ"ג של n-מרחריל ציסטאין ב 3 מ ל של תרבות התא PBS כיתה כדי ליצור דילול הסופי של 500 mM.
      הערה: כדי להאיץ את היווצרות הפתרון, ניתן לשלב את הניטינאמיד ו-n-מרחלין באמבט מים ב-37 ° c. ניתן להכין את שני הפתרונות באצווה, מצוטטים ומאוחסנים ב-20 ° c לשימוש עתידי.
   3. מסנן לעקר את שני הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך שפופרת סטרילי 15 מ"ל.
   4. הוסף 167 mL של BM ל סטרילי 500 mL תרבות בקבוקון בינוני. הוסף 200 mL של R-החתן-CM, 100 מ ל של ראש-CM, ו 100 μL של רקומביננטי mEGF (500 μg/mL) לריכוז הסופי של 50 ng/mL.
   5. הוסף 10 מ ל של הפתרון ניטינאמיד מעוקר ו 2.5 mL של הפתרון שאינו מעוקר n-מרחלי. הוסף 20 מ ל של B27 מוסף (50x).
      הערה: בשלב זה, המדיום מכונה hSI-EM ללא היה (Wnt3A ס"מ, A83-01, ו SB202190), והוא יכול להיות מצוטט ומאוחסן ב-20 ° c. אם המדיום מצוטט לנפחים קטנים יותר, התאם את ריכוזי השלבים הבאים בהתאם.
   6. כדי 500 mL של hSI-EM ללא היה, להוסיף 10 מ ל של Wnt3A ס מ של האצווה האחרונה טרי ו 10 מ ל של Wnt3A-CM של האצווה השנייה האחרונה כדי למזער את שינויי ההשתנות בתנאים Wnt3A-CM.
   7. הוסף A83-01 לריכוז הסופי של 500 nM, ו SB202190 לריכוז הסופי של 10 μM.
   8. לאחסן את hSI-EM המוכנים (עם היה) ב -4 ° c ולהשתמש למשך מקסימום 2 שבועות.
      הערה: הוסף Y-27632 נוספים לריכוז הסופי של 10 μM (המכונה hSI-EM + Y) כאשר הקריפטטים או תאים בודדים הם מתורבתים או אורגנואידים התחילו מהקריוגנית.
5. הכן מאגר מיון תאים המופעל על-ידי פלורסנט (FACS).
   1. הוסף 10 מ ל של סרום עגל עוברי (FCS) כדי 40 mL של PBS ללא Ca^{2 +}/Mg^{2 +} עבור ריכוז סופי של 10% fcs.
      הערה: FCS מונע תאים הקפדה על labware.

2. הליכי התרבות לאורגנואידים המעי האנושי

הערה: הפרוטוקול הזה צריך להתבצע. בתוך ארון בטיחות יש לטפל באורגנואידים על פי ההנחיות הסטנדרטיות לתרבות התא. בעת טיפול בתאים מאורגנואידים או בתאי מאורגנואיד, יש לשמור על התאים בקרח כאשר הדבר אפשרי. התאים יישארו קיימא במשך כמה שעות לאחר הקציר כאשר זה מובטחת. אורגנואידים צריך להיות תרבותי בחממה סטנדרטית לתרבות התא ב 37 ° c עם 5% CO₂. תנאים אלה חלים על כל שלבי הדגירה עם אורגנואידים מוטבע מטריצות קרום מרתף (BMM; כלומר, מטריצות) לאורך פרוטוקול זה. המחברים השתמשו אורגנואידים הנגזרים התריסריון עבור אלה מספר.

1. משתני הפסנואידים
   הערה: לכל תרבות ארגונית יש זמן הכפלה משלה. בדרך כלל, מאבנואידים מעיים קטנים יכולים להיות מעבר לגיל 1:3-1:5 כל 7-10 ימים. כאשר מדובר בתאים בודדים, יעילות passaged יכולה להיות עד 1:20, בהתאם לצפיפות התא. לצורך הקמה ואחזקה, אורגנואידים מתורבתים בצלחות של 24 שעות ביממה; עבור שיטת ה-LDF, בלוחות בנות 24 או 96.
   1. כנה
      1. לפני החום הארוזה לוחות 24-היטב הרקמה בחממה ב 37 ° c, 5% CO₂ לפחות לילה ורצוי 5 ימים מראש.
         הערה: מחמם את לוחיות התרבות של הרקמה בחממה התרבות התאית מבטיח היווצרות והחזקה של מבנה המכיל של טיפות BMM.
      2. כדי להפחית את מספר מחזורי הקפאת ההקפאה, הכינו 1 מילימטר mL של BMM ואחסן ב-20 ° c. הפשרת בקבוקון של BMM על הקרח לפחות 30 דקות לפני הפעלת הליך מעבר אורגנואיד.
      3. לשמור על שפופרת 50 mL של BM על הקרח כמו כביסה בינונית.
      4. הכינו את hSI-EM כמתואר בסעיף 1.4, והכינו כמות מתאימה של hSI-EM + Y, לדוגמה, 15 מ"ל לצלחת מלאה של 24 שעות ביממה.
   2. לאסוף אורגנואידים.
      1. מתיף בזהירות את המדיום תרבות מבלי להפריע טיפות של BMM.
      2. הוסף 500 μL של מוניטור קר לבאר הראשונה של אורגנואידים, ולשבש את טיפות BMM עם אורגנואידים על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה עם P1000 pipetting.
      3. חזור על הליך זה עם מדיום זהה הבאה גם הנדרש, אבל לא לקצור יותר 2 בארות לכל 500 μL של BM.
      4. לאסוף את האורגנואידים בתוך מחייב נמוך 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ספין למטה בצנטריפוגה שולחן מיני עבור 15 לאחד-20 (מקסימום. 2,000 x g). ולהוריד את החלק האחרון של בינוני עם P200 pipet.
         הערה: כאשר התרבויות האורגנואידים נראים נקיים תחת מיקרוסקופ ולא מכילים תאים מתים או פסולת אחרת, טיפות BMM ניתן לקצור ישירות בטריפסין במקום BM בשלב 2.1.2.2. לאחר שלב 2.1.2.3, המשך ישירות לדגירה בשלב 2.1.3.1.
   3. הנתק את האורגנואידים. לתאים בודדים
      1. הוסף 400 μL של טריפסין לתוך הסובב אורגנואידים. מודקון את האורגנואידים ב 37 ° c עבור 5 דקות באמבט מים.
      2. לשבש את האגרגטים הנותרים של תאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה בעדינות עם P200 pipetting. שוב, מודג את האורגנואידים ב-37 ° c עבור 5 דקות באמבט מים.
      3. בדוק את ההתקדמות של דיסוציאציה של התא תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 4x. חזור על שיבוש ידני ודגירה כאשר גושים גדולים של תאים נשארים.
      4. כאשר רק תאים בודדים נשארים, להוסיף 1 מ ל של BM ו ספין למטה את התאים בצנטריפוגה שולחן מיני עבור 15 ל-20.
      5. . מרוב את הסופרנטאנט לחלוטין השהה מחדש את התאים היחידים ב-200 μL של hSI-EM טריים באמצעות P200 pipet. הוסף תוספת 800 μL של hSI-EM.
      6. לספור את מספר התאים בהשעיה.
         הערה: במעבדת המחברים, ספירה ידנית של התאים האורגנואיד המונתק תשואות תוצאות אמינות יותר מאשר מונה תאים אוטומטי. כאשר נעשה שימוש במונה תאים אוטומטיים, צפיפות התא עבור יישומי במטה צריך להיבדק בתוך הבית ולהתאים אם קטן מדי או יותר מדי אורגנואידים לגדול.
   4. אורגנואידים זרעים עבור תחזוקה או השומנים היווצרות ליפיד שיטת.
      1. חשב את נפח התאים הדרוש עבור צפיפות התא הסופית.
         הערה: כ 250 תאים/μL הוא צפיפות מתאימה. בצלחת 24-הבאר, 30 μL הוא הנזרע בכל הבאר, בעוד 5 μL הוא נזרע לכל טוב של צלחת 96-באר.
      2. להוציא את הנפח המתאים של ההשעיה ולהתאים את הצפיפות 750 תאים/μL (או ספין למטה ולהשעות כאשר הצפיפות נמוכה מדי).
      3. הוסף BMM להשעיה התא ביחס של 2:1. צפיפות התא הסופית בתערובת זו היא 250 תאים/μL. בעדינות לערבב את ההשעיה על ידי ליטוף, בזהירות הימנעות כל בועות.
      4. בתוך לוחית טרום מחומם של התרבות הרקמה, הזרע החוצה 3 10 μL טיפות לכל טוב בצלחת 24-באר או אחד 5 μL droplet לכל טוב בצלחת 96-באר.
      5. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c, 5% CO₂ עבור 10-15 דקות כדי לגבש את טיפות bmm. בינתיים, לחמם את הסכום המתאים של hSI-EM + Y באמבט מים ב 37 ° c.
      6. בקפידה להוסיף 500 μL של טרום מחומם hSI-EM + Y לכל טוב של צלחת 24-באר או 100 μL לכל טוב של צלחת 96-באר. מרחיב את התאים בחממה ב 37 ° c, 5% CO₂ ואחרי 2-3 ימים לשנות את המדיום כדי hsi-EM (בלי Y) ולרענן 2-3 פעמים בשבוע.
         הערה: לאחר 7-10 ימים, יש לחזור על תרבות תחזוקה של אורגנואידים.

3. שיטת השומנים של היווצרות Droplet

1. הכנת חומצה אולאית המשלים
   הערה: מאז חומצה אולאית (OA) הוא הידרופובי ולא מסיסים במים, היא מצוערת לאלבומין סרום של שור (BSA). BSA יכול לאגד מולקולות חומצות שומן מרובות והוא במקרה זה בשימוש ביחס 1:8 כדי להפוך חומצה אולאית נגיש לתאי המעיים. חומצות שומן חינם BSA יכול לאגד גם labware פלסטיק. על מנת להבטיח ריכוז סופי מתאים, השתמש בצלוחיות זכוכית והכל כאשר אפשר.
   1. שוקל 0.2 גרם של חומצה אולאית נוזלית בטמפרטורת החדר. להוסיף 1.5 mL של התרבות כיתה מעוקר PBS ולחמם את התערובת ל 70 ° צ' עבור 1 h. מערבולת לסירוגין.
   2. שוקלים 5.89 גרם של BSA ללא חומצות שומן ומתמוסס ב 33.9 mL של PBS. חמם את התערובת באמבט מים ב-37 ° c עד ה-BSA מומס במלואו.
   3. מערבולת התערובת OA שוב כדי ליצור אמולסיה של טיפות בסדר מיד להוסיף אותו לפתרון BSA באמצעות pipet זכוכית. שמור את הפתרון הסופי קרוב ל 37 ° צ' לאחר הוספת OA. התערובת הסופית מורכבת 20 מ"מ מ OA ב 2.5 mM BSA.
   4. שמרו על התערובת ב-37 ° c למשך 30 דקות עד שיישאר פתרון צהבהב ברור.
   5. המשלים OA-BSA יכול להיות מצוטט וקפוא ב-20 ° c עבור לפחות 6 חודשים. בשעה שהיא מתפרקת, מודסת אותה ב-37 ° c עד שהוא מתמוסס והתערובת ברורה שוב.
      הערה: בגלל החלבון הגבוה ותוכן השומנים של הפתרון הסופי, התערובת לא יכולה להיות מסנן מעוקר או אוטוקלבד. כאשר המרכיבים טופלו בזהירות, במכסה הזרימה המבינארי כאשר הדבר אפשרי ובשימוש ב-PBS מעוקר, המחברים לא חוו זיהומים מיקרוביאלית.
2. שיטת החיבור של LDF
   1. הכנה לדוגמא
      1. מעבר אורגנואידים כמתואר בסעיף 2.1. הזרע החוצה את התאים היחידים הנגזרים מאורגאיד בצלחת שחורה בצבע 96-בהיר.
      2. ביום 6 של התרבות על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל 1 mM OA-BSA המשלים.
      3. דגירה את התאים עבור 16-17 שעות (לילה) ב 37 ° c בנוכחות או היעדרות של 0.1 μM DGAT1 מעכב. כלול בקרת רכב של 2.5 mM BSA.
      4. לאחר 16 עד 17 שעות, מנושף את המדיום מבלי להפריע לטיפות BMM. התיקונים האורגנואידים על ידי הוספת 100 μL של 4% פורמלדהיד באגירה ניטרלי לבארות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
         הערה: פורמלדהיד יהיה חלקית לפזר את BMM, בעוד האורגנואידים לשקוע לתחתית ולדבוק בתחתית הצלחת.
      5. הסר את פורמלדהיד בעדינות, ובזהירות לשטוף את הבארות עם 150 μL של PBS לכל טוב.
      6. כתם תאים עבור ה0.025 mg/mL LD540 ו-4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      7. שטפו את הבארות בזהירות בערוץ PBS.
         הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן בעת הצורך. שמרו את הדגימות מכוסות ב-PBS בחשיכה ב -4 ° c. LD540 הצביעת יישארו יציבה למשך שבוע. ניתן לבצע שחזור זה באמצעות תאים חיים, כדי לפקח על היווצרות LD לאורך זמן. בשביל זה, יש להשמיט את הקיבעון מהפרוטוקול, ולהחליף את ה-DAPI בצביעת הואכסט. LD540 יכול להכתים את התעודות בתאי החיים באותו ריכוז כפי שמתואר.
   2. הדמיה קונפוקלית
      הערה: ניתן לבצע את ההדמיה על דגימות מוכנות מאורגאיד בצלחת השחורה 96-בסדר גמור.
      1. לתמונות מבט כולל של אורגנואידים שלמים, השתמש במטרה 40x מתאים לדימות פלורסנט ממוקד.
      2. הגדר את המיקרוסקופ כדי לדמות את ערוץ DAPI ב 405 ננומטר, ca. 410-535 ננומטר גל של פליטה. עבור LD540 לבחור לייזר עירור ב 540 ננומטר (543 nm הוא אופטימלי) ולהגדיר את מסנני פליטה 545-700 ננומטר.
         הערה: בפרוטוקול זה, מערכת בסריקת לייזר קונפוקלית וקד עם לייזר אור לבן, מפצל קרן acousto-אופטי (aobs), 10x/20x המטרה, ו מערכת איתור ספקטרלית שימש. הדבר מאפשר כוונון מדויק של אורכי הגל הספציפיים. אם מערכת דומה אינה זמינה, בחרו קווי לייזר ומסנני למעבר קצר/ארוך בקרבת המפרט שלעיל. עבור הדמיה שלמה-אורגאיד, רזולוציה של 512 x 512 או 1024 x 1024 מספיקה עבור ניתוח תמונה במורד.
      3. הגדר את גודל הנקב ליחידה אוורירית אחת (AU) עבור רזולוציה מספקת של ציר z.
      4. כדי לדמות מחצית אחת של אורגאיד כדורית, הגדר את מחסנית z ל-85 μm בקירוב.
   3. אנליזת תמונות
      הערה: לניתוח תמונה, פיג'י/imagej^16,17 שימש להפקת תחזיות מרביות. ניתן לבצע את הניתוח בכל חבילת תוכנה לניתוח תמונה המאפשרת הקרנה מקסימלית, סף ידני וניתוח חלקיקים.
      1. באמצעות פיג'י/ImageJ, הפוך את מחסנית z של כל אורגנואיד להקרנה מרבית: תמונה | ערימות | Z-פרוייקט.
      2. הגדר את הסף של ההקרנה המקסימלית לרמה שבה אין אות LD540 לעין במדגם בקרת הרכב BSA: תמונה | כוונן | הסף. השתמש בהגדרות אלה כדי לעבור לסף כל תמונה.
      3. למדוד את השטח הכולל של הזריחה עבור כל הקרנה מקסימלית באמצעות הפונקציה לנתח | ניתוח חלקיקים.
         הערה: למרות שרזולוציית השיטת הפעולה טובה יותר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית, ניתן לנתח את השיטה גם באמצעות קורא לוחית פלורסנט עם מסננים דומים. כדי לנרמל את הספירה לאחר ספירת האורגנואיד, יש לחלק את האות LD540 באות DAPI. לבסוף, יש לחיסור את האות של פקד הרכב BSA כדי לנרמל את המידות. גישה זו מאפשרת לשנות את היכולת להיות משתנה לקראת תבנית צלחת 96.
3. שיטת הזרימה
   1. הכנה לדוגמא
      1. מעבר אורגנואידים כמתואר בסעיף 2.1. הזרע את התאים היחידים הנגזרים מאורגאיד בצלחת תרבות של 24 שעות ביממה. שתי בארות בכל תנאי מספיקה עבור cy, הזרימה הציטונסה.
      2. ביום 10 של התרבות על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל 1 mM OA-BSA המשלים.
         הערה: לעומת ניתוח מוקד, 10 ימים של צמיחה ב-EM נבחר עבור שיטת הזרימה cy, try במקום 6 ימים. 4 הימים הנוספים של התרחבות יגרמו לאורגנואידים חופפים שהיו מסבכים את הצורה המבוססת על מיקרוסקופ. עם זאת, מספר גדול יותר של תאים מאפשר זרימה cy, לנסות ניתוח.
      3. דגירה את התאים עבור 16-17 שעות (לילה) ב 37 ° c בנוכחות או היעדרות של 0.1 μM DGAT1 מעכב. כלול בקרת רכב של 2.5 mM BSA.
      4. לאחר 16 עד 17 שעות, לאסוף את האורגנואידים כמתואר בסעיף 2.1.2.
      5. הנתק את האורגנואידים לתאים בודדים כמתואר בסעיף 2.1.3.
         הערה: למרות שאין צורך באופן מדויק, מומלץ לבדוק את ספירת התא בכל אחת מהדוגמאות. מספר כולל של 10,000 תאים לכל מדגם הוא המינימום הנדרש לרזולוציה מספקת. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש בתאים ca. 50,000-100,000.
      6. סובב את התאים בצנטריפוגה. מיני עבור 15 לעשרים
      7. כתם כל מדגם עם 500 μL של 0.025 mg/mL LD540 ו-1 μg/mL Hoechst ב-PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      8. לסובב את התאים בצנטריפוגה שולחן מיני עבור 15 למעלה ולשטוף 3x עם PBS.
      9. תיקונים התאים על ידי השעיית אותם ב500 μL של 4% פורמלדהיד באגירה ניטרלי עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      10. לסובב את התאים ולשטוף 3x עם מאגר FACS.
      11. לשטוף מראש את צינורות FACS עם מאגר FACS כדי למנוע תאים הדבקים בקיר הצינור.
      12. השהה מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS והעבירו את ההשעיה הסלולרית לצינורות ה-FACS שוטפים מראש.
   2. ניתוח ציטומטלי זרימה
      1. הגדר את הפרמטרים כדי להוציא תאים מתים וגושים של תאים (עיין בסעיף התוצאות המייצג).
      2. באוכלוסייה הסופית מגודרת, למדוד לפחות 10,000 תאים עבור תוצאות אמינות.
         הערה: מאוכלוסיה זו, את עוצמת הפלורסנט הממוצע (MFI) של LD540 ואת ממוצע האות של האס. פי. או מספקים מידה של הנפח הכולל של היווצרות LD לכל תא.

Results

לניתוח הנכון של היווצרות LD, האורגנואידים לא צריך להיות הנזרע בצפיפות רבה לפני גירוי עם OA והכתים הבאים. הדבר מהווה חשיבות במיוחד עבור מוקד הקריאה וקורא הצלחות, כיוון שהאורגנואידים החופפים עלולים להפריע לזריחה. דוגמה לצפיפות מתאימה של זריעה אורגאידית (איור 1א) ותרבות עם אורגנואידים חופפים מוצגת (איור 1B). כדי למזער את השונות בגירוי לדוגמה עם OA, גודל האורגנואיד וצפיפות הזריעה צריכים להיות מקבילים...

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לקבוע את היווצרות LD במעי האנושי אורגנואידים על הדגירה עם חומצה אולאית. שיטה זו מבוססת על LD ספציפי לצבוע פלורסנט LD540¹⁸, אשר מאפשר אפיון וכימות של הנפח הכולל של טיפות השומנים בתוך תרבות אורגאידית. ההליכים להקמת ולתחזוקה של תרבויות בעלי מעיים אנושיים פורסמו לפני¹³, ומדריך חזותי של פרוטוקול זה זמין גם הוא¹⁵.

הצעדים הקריטיים בפרוטוקול זה הם התרבות של אורגנואידים המעי האנושי, ואת הקוניוגציה הנכונ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תוסף DMEM/F12 מתקדם	Gibco	12634-028
B27	Gibco	17504-044
מטריצת ממברנת הבסיס (מטריג'ל)	BD Biosciences	356231
מעכב DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG
DGAT1 (AZD 3988)	Tocris Bioscience	4837/10
ללא חומצות שומן BSA	Sigma-Aldrich	A7030
פורמלדהיד	קליניפת	4078-9001
גלוטמין (GlutaMAX, 100x)	Gibco	15630-056
HEPES (1 מ')	Gibco	15630-080
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר	Leica	SP8X
LD540			סופק באדיבות על ידי ד"ר ב. ספי, אוניברסיטת אוטרכט
mEGF	Peprotech	315-09_500ug
N-אצטיל ציסטאין	סיגמא-אולדריץ'	A9165-100G
ניקוטינאמיד	סיגמא-אולדריץ'	N0636-500G
תאים המייצרים נוגין (תאי HEK293-mNoggin-Fc)			MTA עם J. den Hertog, מכון הוברכט
חומצה אולאית	סיגמא-אולדריץ'	O1008-5G
p38 מעכב MAPK (p38i) (SB202190)	סיגמא-אולדריץ'	S7067-25MG
PBS	סיגמא-אולדריץ'	D8662-500 מ"ל
PBS ללא Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 יחידות / מ"ל)	Gibco	15070-063
תאים המייצרים R-spondin (תאי Cultrex HA-R-Spondin1-FC 293T)	R& D systems	3710-001-01
24 צלחות באר מטופלות TC	Greiner-One	662160
TC מטופלות בשחור שקוף 96 לוחות באר	Corning Life Sciences	353219
מעכב קולטן TGFb מסוג I (A83-01)	Tocris Bioscience	2939/10
טריפסין (TrypLE Express)	Life Technologies	12604021
תאים המייצרים WNT-3A (תאי L-Wnt-3A)			MTA עם J. den Hertog, מכון הוברכט
Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב Rho kinase)	Abcam	ab120129-10