פתרון מים, חלבונים ושומנים מ ב Vivo Confocal ראמאן ספקטרום של שכבה הקרנית באמצעות גישה כימומטרית

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אוסף של מוקד ראמאן ספקטרום מן הנושאים האנושיים במחקרים קליניים בשילוב עם גישות כימומטרי עבור הסרת ספקטרליר להסרת ואת החילוץ הבא של תכונות מפתח.

תקציר

פיתוח זה ב vivo קונפוקלית וקד ראמאן הספקטרוסקופית השיטה מאפשרת מדידה ישירה של מים, חלבונים, ושומנים עם רזולוציה עומק בנושאים אנושיים. מידע זה חשוב מאוד למחלות הקשורות לעור ולאפיון ביצועי מוצר לטיפוח העור. פרוטוקול זה ממחיש שיטה לאוסף ראמאן ספקטרום מוקד ואת הניתוח הבא של ערכת הנתונים ספקטרלית מינוף כימומטריקה. מטרת שיטה זו היא ליצור פרוטוקול סטנדרטי עבור איסוף נתונים ולספק הדרכה כללית לניתוח נתונים. עיבוד מקדים (למשל, הסרת ספקטרום חריג חשוד טעות) הוא צעד קריטי בעת עיבוד ערכות נתונים גדולים ממחקרים קליניים. כדוגמה, אנו מספקים הנחיה המבוססת על ידע מוקדם של ערכת נתונים כדי לזהות את סוגי הoutliers ולפתח אסטרטגיות ספציפיות כדי להסירם. מבוצעת ניתוח של רכיב ראשי, וספקטרום הטעינה מושווה לספקטרום מחומרי התייחסות כדי לבחור את מספר הרכיבים המשמשים בניתוח רזולוציית עקומת העקומות הסופית (MCR). גישה זו מוצלחת להפקת מידע משמעותי מערכת נתונים ספקטרלית גדולה.

מבוא

במחקרים קליניים, ב vivo קונפוקלית ראמאן ספקטרוסקופית הראה את היכולת הייחודית שלה לקביעת שכבה עובי של הקרנית ותוכן מים^1,2,3,4, מעקב אחר חדירת חומרים פעילים למריחה על העור,^5,6. כגישה שאינה פולשנית, ספקטרוסקופיית ראמאן מזהה אותות מולקולריים המבוססים על מצבי רטט. לכן, אין צורך בתוויות⁷. ב vivo קונפוקלית וקד ראמאן ספקטרוסקופית מספק מידע כימי עם רזולוציה עומק מבוסס על האופי הקונקמוקד של הטכניקה. מידע זה תלוי עומק שימושי מאוד ללמוד את ההשפעות של מוצרי טיפוח העור^4,8, הזדקנות^9,10, שינויים עונתיים³, כמו גם מכשול העור פונקציה מחלות, כגון אטופיק דרמטיטיס^11,12. יש הרבה מידע באזור בתדר גבוה של מיקוד ראמאן (2500 – 4000 ס"מ^-1), שם המים מייצרת פסגות נפרדות באזור בין 3250 – 3550 ס"מ^-1. עם זאת, פסגות ראמאן של חלבונים ושומנים, אשר ממורכזים בין כ 2800 – 3000 ס"מ^-1, חופפים זה לזה כי האותות מיוצרים בעיקר מ מתילן (-ch₂-) ו מתיל (-ch₃) קבוצות¹³ . מידע חופף זה מציג אתגר טכני בעת קבלת כמויות יחסיות של מינים מולקולריים בודדים. התאמת שיא^14,15 ו שיא סלקטיבי מיקום^12,16 גישות שימשו כדי לפתור את האתגר הזה. עם זאת, קשה לשיטות מבוססות-שיא אלה לחלץ מידע של רכיבים טהורים משום שפסגות ראמאן מרובות משינוי אותו רכיב בו¹⁷. בפרסום האחרון שלנו¹⁸, הציעו גישת mcr להבהיר את מידע הרכיבים הטהורים. באמצעות גישה זו, שלושה מרכיבים (מים, חלבונים, ושומנים) חולצו מ vivo קונפוקלית וקד הנתונים הספקטרוסקופית ראמאן.

ההוצאה להורג של מחקרים קליניים גדולים יכול להיות תובעני על אנשים האוספים נתונים vivo ספקטרוסקופיים. במקרים מסוימים, רכישה ספקטרלית יכולה לדרוש ציוד הפעלה במשך שעות רבות ביום והמחקר יכול להאריך עד שבועות או חודשים. בתנאים אלה, נתונים ספקטרוסקופיים עשויים להיווצר על ידי מפעילי ציוד כי חוסר המומחיות הטכנית לזהות, לכלול, ונכון עבור כל המקורות של ממצאים ספקטרוסקופיים. ערכת הנתונים שתיווצר עשויה להכיל חלק קטן מהמידע הספקטרוסקופי הדרוש לזיהוי ולהוצאה מהנתונים לפני הניתוח. נייר זה ממחיש בפרוטרוט תהליך ניתוח כימומטרי כדי "לנקות" ערכת נתונים של ראמאן קלינית לפני ניתוח הנתונים עם MCR. כדי להסיר בהצלחה את החלק החיצוני, את סוגי המיירס ואת הסיבה הפוטנציאלית עבור הדור של ספקטרום outliers צריך להיות מזוהה. אז, גישה מסוימת ניתן לפתח כדי להסיר את היעד המיועד. זה דורש ידע מוקדם של הנתונים, כולל הבנה מפורטת על תהליך יצירת הנתונים ועיצוב המחקר. בערכת נתונים זו, רוב המכריע של החוצה הם האותות האות אל הרעש, מקורם בעיקר 1) ספקטרום שנאסף מעל פני העור (6,208 מתוך 30,862), ו 2) תרומה חזקה לספקטרום של אור בחדר פלורסנט (67 מתוך 30,862). ספקטרה נאסף מעל פני השטח העור לייצר תגובה ראמאן חלשה, כמו נקודת מוקד לייזר מתקרב למשטח העור הוא בעיקר בחלון המכשיר מתחת לעור. ספקטרה עם תרומה חזקה של אור בחדר הפלורסנט נוצרות עקב שגיאה או אופרטור המכשיר או התנועה הנושא, אשר מייצרת מצב שבו חלון אוסף ראמאן מוקד לא מכוסה במלואו על ידי אתר הגוף של הנושא. למרות סוגים אלה של ממצאים ספקטרלים יכול להיות מזוהה לתיקון במהלך רכישת ספקטרלי על ידי מומחה ספקטרוסקופי בזמן רכישת נתונים, מפעילי כלי מיומן המשמשים במחקר זה הונחו לאסוף את כל הנתונים אלא אם כן כישלון קטסטרופלי נצפתה. המשימה לזיהוי וללא כלילת החוצה משולבת בפרוטוקול ניתוח הנתונים. הפרוטוקול שהוצג פותח כדי לפתור את האתגר הזה. כדי לטפל בספקטרום של האות לרעש הנמוך מעל פני העור, המיקום של משטח העור צריך להיקבע תחילה כדי לאפשר הסרה של ספקטרום שנאסף מעל פני השטח של העור. מיקומו של משטח העור מוגדר כמו עומק שבו נקודת מוקד לייזר ראמאן הוא חצי בעור וחצי מתוך העור כפי שמודגם באיור המשלים 1. לאחר הסרת ספקטרום של אות לרעש נמוך, ניתוח מרכיב ראשי (PCA) מיושם כדי לחלץ את הפקטור הנשלט על ידי פסגות אור בחדר פלורסנט. מיירס זה מוסרים על בסיס ערך הניקוד של הפקטור המקביל.

פרוטוקול זה מספק מידע מפורט לגבי האופן שבו שישה רכיבים עיקריים נקבעים בתהליך MCR. הדבר נעשה באמצעות ניתוח pca ואחריו השוואת צורה ספקטרלית בין עמסות עבור מודלים שנוצרו עם מספר שונה של רכיבים עיקריים. התהליך הניסיוני לאיסוף נתונים של חומרי ייחוס, כמו גם לנושאים אנושיים מוסבר בפרוטרוט.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית החולים לילדים של בייג בציות להנחיות האתיות של 1975 הצהרת הלסינקי. היא נערכה על פי ההנחיות לפרקטיקה קלינית טובה. המחקר התקיים ממאי עד יולי 2015.

1. אוסף של vivo קונפוקלית ראמאן ספקטרום מתוך נושאים אנושיים עם דרמטיטיס אטופית

1. כלול נושאים בהתאם לקריטריונים הבאים.
   1. כלול נושאים בין הגילאים 4 – 18.
   2. כלול נושאים עם מתון עד בינוני דרמטיטיס אטופית (ציון של 2 או 3 על פי הערכה הכללית של הרופא) עם תסמיני המחלה הפעילים על 5% – 30% של פני השטח, עם לפחות שתי נגעים על הזרועות.
   3. כלול נושאים הנמצאים במצב בריאותי טוב, למעט סימפטומים הקשורים ישירות למחלת ה-AD.
   4. כלול נושאים המספקים הסכמה מושכלת בכתב.
   5. כלול נושאים בעלי ערך טופולוגיה בודד (ITA) גבוה מ-40 במיקום הבדיקה.
2. אל תכלול נושאים העונים על כל אחד מהקריטריונים הבאים.
   1. אל תכלול נושאים המשתתפים כעת או שהשתתפו בעבר במחקר קליני בכל מתקן בדיקה במהלך 4 השבועות הקודמים.
   2. אל תכלול נושאים עם סרטן או שאובחנו או טופלו עבור סרטן בתוך 5 שנים לפני המחקר.
   3. אל תכלול נושאי סוכרת.
   4. אל תכלול נושאים שיש להם חיסוני או מחלה זיהומית שיכולים למקם את הנושא בסיכון או להפריע לדיוק של תוצאות המחקר (כלומר, צהבת, שחפת, HIV, איידס, זאבת, או דלקת מפרקים שגרונית).
   5. אל תכלול נושאים בעלי מצבי עור שעלולים להפריע למדידות אינסטרומנטליים או למנוע הערכה ברורה של העור רק לדלקת עור אטופית. דוגמאות כוללות עור יבש במיוחד, עור פגום, חתכים, שריטות, כוויות שמש, כתמי ליום, קעקועים, הצטלקות נרחבת, פריחות, צמיחת שיער מוגזמת, או אקנה.
   6. אל תכלול נושאים המשתמשים בתרופות מדכאים חיסוני אוראלי, אנטיביוטיקה, או טיפולים מערכתית אחרים בחודש האחרון, למעט סמי הרגעה קלים.
   7. אין לכלול נושאים בתנאים רפואיים אחרים, שלפי דעתו של החוקר, מונע מהם להשתתף בלימוד.
   8. אל תכלול נושאים עם פיגמנטציה גבוהה יותר באזור הבדיקה.
3. תווית את אזור הנגע של משתתף המחקר דרמטיטיס אטופית ולסמן עם שטח 3 ס"מ x 4 ס מ על או ליד האתר נגע כפי שמוצג באיור 1.
4. התווית את האזור שאינו נגע עם אותו סמן באתר הגוף המקביל (למשל, זרוע שמאל לעומת זרוע ימין) כמוצג באיור 1B.
5. מניחים את אתר הגוף המסומן בקשר קרוב עם החלון של vivo קונפוקלית וקד מכשיר ראמאן כפי שמוצג באיור 2A ואיור 2ב. כסו את כל החלון כדי למנוע את השפעת אור החדר באתר הגוף.
6. בצע את איסוף הנתונים ראמאן.
   הערה: המכשיר יש ברזולוציה ספקטרלית של 2 ס"מ^{-1 ו-} 50x מטרה מיקרוסקופ (NA = 0.9 שמן טבילה), באמצעות 671 לייזר nm עם כוח של 17 mW. אורך הגל מכויל באמצעות הספקטרום של מנורה מובנית של ארגון ניאון. כיול האינטנסיביות נעשה על-ידי מדידת הספקטרום של מתקן לכיול זכוכית (המכון הלאומי לתקנים).
   1. להעביר את המוקד עד ספקטרום כפי מומחש באיור 2C הוא נצפתה, ולאחר מכן להעביר את המוקד מן פני העור 10 μm.
   2. הפעל את אוסף הנתונים עבור 26 שלבים עם גודל הצעד 2 יקרומטר ב-2,510 ס"מ^-1-4,000 ס מ^-1 באזור התדר. השתמש בזמן חשיפה של 1 s ולמדוד שמונה משכפל עבור כל אזור שנמשך ~ 10 – 15 דקות בסך הכל.

2. אוסף של ספקטרום ראמאן מתוך חומרי ייחוס

1. מניחים את חומרי הייחוס, את המרכיבים העיקריים של העור האנושי שכבה הקרנית¹⁹, על החלון של המכשיר ראמאן מוקד (ראה טבלת חומרים: סרום בשור (bsa), מים מוכי (די מים), ceramide, כולסטרול, חינם חומצת שומן וסקוואלן).
2. לאסוף את חומרי הייחוס ראמאן ספקטרום ברציפות מן החיצוני של החומר למרכז החומרים באמצעות פרמטרי אוסף זהה כמתואר לעיל.
3. לשלב את האזור תחת כל ספקטרום ראמאן בין טווח של 2510 – 4000 ס"מ^-1 ולזהות את שלוש נקודות הערך המקסימלי העליון ב -26 המידות. ממוצע ספקטרום ראמאן מתוך שלוש נקודות אלה כדי להשיג את ספקטרום חומר התייחסות הסופי.

3. הסרת ספקטרום החיצוני באמצעות ניתוח כימומטריקה

1. לקבוע את משטח העור ולהסיר את ספקטרום מחוץ לעור.
   1. שנה את סיומת הקובץ מ-'. ric ' ל-'. mat ' וטען את קובץ ה-. mat לפלטפורמת התוכנה MATLAB.
   2. תקן את התוכנית הבסיסית באמצעות תוכנית בסיסית (ריבועים לפחות משוקללים) על-ידי לחיצה ימנית על קבוצת הנתונים המיובאת תחת נתח | כלים אחרים | עיבוד מקדים בתוכנת PLS_Toolbox עם הגדרת ברירת המחדל.
   3. סכם את הערכים בין 2910 – 2965 ס"מ^-1 כדי לקבל את ערכי העוצמה שמתחת לכל קשת ראמאן ממדידת המדידה של 26 השלבים העוקבים כפי שמוצג באיור 3A באמצעות הפונקציה sum ב-MATLAB.
   4. מבצעת אינטרפולציה בערך ההיסט של המכשיר (ערך בציר ה-X באיור 3ב) מתוך 26-260 באמצעות פונקציית הרווח linspace ב-MATLAB.
   5. אינטרפולציה בערך העוצמה בין 26 ל-260 באמצעות שיטת ליטת חיבור ב-MATLAB, מינוף ערכי המיקום החדשים שנוצרו ב-260.
   6. השתמש בפונקציות POLYFIT ו polyfit כדי לקבל את הסט החדש של ערכי עוצמה עם 260 נקודות. ראשית, השתמש בערכי המיקום והעוצמה של 260 כתשומות X ו-Y עבור הפונקציה polyfit , בהתאמה. הגדר את ערך המידה ל-20. לאחר מכן, השתמש במקדמים הפלט ובערכי המיקום המורחבים 260 כקלט עבור polyval כדי להשיג את ערכי העוצמה הסופית 260.
   7. השתמש בפונקציות max ו- min של MATLAB כדי לזהות את הנקודות המרביות והמינימליות מערכי העוצמה החדשים ש260 אינטרפולציה.
   8. חשב את ערך העוצמה הממוצע על-ידי חלוקת הסכום של ערך העוצמה המרבי והמזערי בשתיים.
   9. זהה את ערך העוצמה מערכי העוצמה 260 (שחושבו משלב 3.1.6) הקרוב ביותר לערך העוצמה הממוצע והגדר את ערך המיקום התואם שלו כמשטח המעטפת. הגדר ערך מיקום זה כנקודת האפס בציר ה-X כפי שמודגם באיור 3ב.
   10. שנה את כל ערכי המיקום האחרים בהתאם לנקודת האפס וגודל הצעד הידוע 2 יקרומטר.
   11. הסר את כל הספקטרום שנאסף מעל פני העור בהתאם לערך המיקום שלהם.
   12. יבא את שאר הנתונים ל-PLS_Toolbox כדי ליצור ערכת נתונים ולשנות את שמו "RamanData. mat".
2. הסירו את הספקטרום החיצוני. עם אפקט האור בחדר
   1. טען את קבוצת הנתונים ראמאן ספקטרה (RamanData. mat) לאחר הסרת ספקטרום מחוץ לעור וליישם את ניתוח PCA.
   2. טען את ערכת הנתונים לתוך תוכנת PLS_Toolbox תחת פלטפורמת MATLAB ולחץ לחיצה ימנית על קבוצת הנתונים כדי לבחור באפשרות ' נתח ' | PCA.
   3. בחר באפשרות ' נרמל ' כגישה לעיבוד מקדים ובחר ' ללא ' עבור האימות הצולב.
   4. השתמש בשלושת הרכיבים עבור ניתוח פירוק ה-PCA כמוצג באיור המשלים 2.
   5. הסר את המכסה על vivo חלון אוסף של מכשיר ראמאן ולאסוף את ספקטרום אור החדר באזור בתדר גבוה באמצעות אותם פרמטרים המשמשים את חומרי הייחוס נתונים איסוף.
   6. זהה את גורם אפקט האור בחדר בהשוואה לספקטרום הרקע של החדר כמוצג באיור המשלים 3.
   7. הסר את הספקטרום עם ערך ניקוד גבוה באופן משמעותי יותר מהרגיל (יותר מ 99.8% של ערכי הניקוד של ערכת הנתונים כולה, שהוא 0.16 במחקר זה).

4. בחירת מספר הרכיבים בניתוח הפירוק של MCR

1. תקן את הבסיס ראמאן ספקטרה באמצעות אותה גישה שתוארה לעיל (סעיף 3.1.2).
2. בצע את ניתוח ה-pca בערכת הנתונים המעובדת מראש כמתואר לעיל (סעיף 3.2), למעט בחירת "pqn" – "מרכז ממוצע" ולא "לנרמל", ולהתוות את ערכי ערכים קנה מידה לוגריתמי יחד עם מספר הרכיבים (20) כמספר ברירת המחדל ב ניתוח הפירוק על-ידי לחיצה על לחצן בחירת רכיבים ובחירת יומן רישום (ערכי eigenvalues כערך Y. בחר שלוש עד שמונה כמספר הרכיבים המשמשים לניתוח MCR.
3. בצע ניתוח MCR.
   1. טען את ערכת הנתונים לתוך תוכנת MCR_main²⁰ באמצעות לחצן בחירת המידע .
   2. בחר את מספר הרכיבים (שלושה עד שמונה) על-ידי לחיצה על קביעת מספר הרכיבים .
   3. לחץ על הלחצן הנקי תחת הכרטיסיה שערוך התחלתי , בחר באפשרות ריכוז תחת הכיוון של הכרטיסיה בחירת משתנים ולחץ על לחצן בצע .
   4. לחץ על לחצן אישור ולאחר מכן המשך לחצן לעמוד הבא.
   5. לחץ על המשך בעמוד הבא ולאחר מכן בחר fnnls ו- 6 תחת היישום ו -Nr. של מינים עם כרטיסיות פרופילים לא שליליות , בהתאמה. לחץ על לחצן המשך .
   6. בחר את אותם הפרמטרים כמו המקטע 4.3.5 עבור דף זה ולחץ על המשך.

תוצאות

במחקר קליני זה, vivo קונפוקלית וקד ראמאן ספקטרום נאספו מ 28 נושאים מ 4 – 18 בן. סך של 30,862 ספקטרום ראמאן נאספו עם פרוטוקול איסוף נתונים שהוזכרו לעיל. זו ערכת נתונים ספקטרלית גדולה מכיל 20%החוצהספקטרלי כפי שמוצג באיור 4א. לאחר קביעת משטח העור ולאחריה PCA הוסרו האותות הנמוכים של האות לרעש. הגורם השלישי במודל PCA זה מזוהה פסגות אור החדר. זה מאושר על ידי השוואה של ספקטרום הטעינה של פקטור 3 עם ספקטרום של אור בחדר פלורסנט שנאסף בנפרד באתר המחקר באמצעות אותו מוקד מכשיר ראמאן (ראה איור

דיון

במהלך איסוף הנתונים, כפי שמתואר בסעיף 2 ו-3 של הפרוטוקול, כל פרופיל עומק נאסף באזור עם מגע בין חלון המכשיר לבין העור על ידי מציאת האזורים הכהים יותר מהתמונות המיקרוסקופיים המסומנים בעיגולים האדומים ב איור 2ג. ברגע שאזורים אלה היו ממוקמים, זה היה קריטי להתחיל את פרופיל העומק מעל פני השטח העור כדי לקבוע במדויק את המיקום של משטח העור עבור הליך ניתוח נתונים. מיקום משטח העור שימש לאחר מכן כדי לקבוע את העומק היחסי של כל ספקטרום בפרופיל העומק המתאים. כפי שהוזכר בסעיף 1 של הפרוטוקו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר אלבומין	סיגמא-אולדריץ
כולסטרול	סיגמא-אולדריץ
3-סולפט נתרן	סיגמא-אולדריץ'
D-אריתרו-דיהידרוספינגוזין	סיגמא-אולדריץ'
DI מים			מטוהרים עם מיליפור (18.2MΩ)
מנתח עור Gen2-SCA	River Diagnostics, רוטרדם, הולנד	Gen2
Matlab 2018b	Mathwork	2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosine	Avanti Polar Lipids, Inc.
N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine (ceramide)	Avanti Polar Lipids, Inc.
חומצה אולאית	סיגמא-אולדריץ
		חומצה
פלמיטולאית	סיגמא-אולדריץ
PLS_Toolbox גרסה 8.2	Eigenvector Research Inc.	8.2
RiverICon	River Diagnostics, רוטרדם, הולנד	גרסה 3.2
סקוואלן	סיגמא-אולדריץ
חומצה סטארית	סיגמא-אולדריץ'

' ' חומצה פלמיטית '' '