מאמר שיטה

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

DOI:

10.3791/60202

⸱

27 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיתוף התרבות של התא שימש בשימוש נרחב ללימוד אינטראקציות תא תא בין סוגי תאים שונים כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של מחלות כולל סרטן. עם זאת, הוא מאתגר להבהיר את המנגנון המורכב של אינטראקציות בין-סלולריות באוכלוסיות תאים הטרוגניות ביותר באמצעות מערכות שיתוף התרבות המקובלת, מכיוון שטרוגניות של אוכלוסיית המשנה של התא מטושטשת מהערכים הממוצעים; ניתן להשתמש במערכות שיתוף התרבות המקובלות רק כדי לתאר את אות האוכלוסיה, אך אינן מסוגלות לעקוב אחר התנהגות של תאים בודדים. יתרה מזאת, שיטות נסיוניות רגילות של תא יחיד בעלות יעילות נמוכה בטיפול בתאים בגלל התפלגות פואסון. התקנים מיקרו-מפוברק הם טכנולוגיה מתפתחים למחקרים בעלי תאים בודדים, משום שהם יכולים לטפל במדויק בתאים בודדים בתפוקה גבוהה ולהפחית את הצריכה הכימית של המדגם. כאן, אנו מתארים את המושג ואת היישום של שבב מיקרופלואידיג עבור מספר רב של תאים בודדים-שיתוף תרבויות. השבב יכול ביעילות ללכוד סוגים מרובים של תאים בודדים בחדר התרבות (~ 46%) והוא בעל מרחב תרבותי מספיק שימושי לחקר התנהגות התאים (למשל, הגירה, התפשטות וכדומה) תחת אינטראקציה תא תא ברמת התא היחיד. תאים אנדותל הלימפה וקרצינומה של תאים אוראלי קשקש שימשו כדי לבצע ניסוי של תא יחיד שיתוף התרבות על פלטפורמת microfluidic עבור חיים מרובים בודד אינטראקציה מחקרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכידה יעילה של סוגים שונים של תאים בודדים ואספקת מרחב תרבותי מספיק נדרשים עבור ניסויים תא יחיד שיתוף התרבות של סוגים מרובים של תאים בודדים1. הגבלת דילול היא השיטה הנפוצה ביותר כדי להכין את התאים היחידים עבור ניסויים כאלה, בשל העלות הנמוכה של ציוד נדרש. עם זאת, בשל מגבלת התפלגות פואסון, ההסתברות המרבית לרכישת תא בודד היא רק 37%, מה שהופך את הפעולה הניסיונית לעמלולגזול זמןרב. לעומת זאת, שימוש במיון תאים המופעל באמצעות הזריחה (FACS) יכול להתגבר על מגבלת התפלגות פואסון כדי להכין תאים בודדים באופן יעיל ברמה3. עם זאת, FACS לא יכול להיות נגיש למעבדות מסוימות בשל עלות מכשור יקר ותחזוקה. התקנים מיקרו-מפוברק פותחו לאחרונה עבור השמנה של תא בודד4, זיווג של תא בודד5ויישומי תרבות תא בודדים. התקנים אלה מבוססים על יכולתם לטפל באופן מדויק בתאים בודדים6, לבצע ניסויים בתפוקה גבוהה, או להפחית את הצריכה הכימית של המדגם. עם זאת, ביצוע ניסויים בשיתוף עם תאים בודדים עם סוגי תאים מרובים עם מכשירים מיקרופלואידים הנוכחיים עדיין מאתגרים בשל הגבלת התפלגות פואסון1,7,8או אי-יכולת של התקנים כדי ללכוד יותר משני סוגים של תאים בודדים4,5,6,9,10.

לדוגמה, יון ואח ' דיווח על מכשיר מיקרופלואידיג למחקר האינטראקציה תא תא11. התקן זה משתמש בשיטה הפרוליסטית כדי לזווג תאים בחדר אחד. עם זאת, הוא יכול להשיג רק את הזיווג של שני סוגי תאים שונים עקב הגבלות גיאומטריות במבנה ההתקן. דו ח נוסף של לי ואח ' הפגין שיטה דטרמיניסטית ללכוד ולזווג תאים בודדים12. התקן זה מגביר את יעילות השיוך בשיטה הדטרמיניסטית, אך הוא מוגבל על-ידי זמן הפעולה הממושך הנדרש לזוג תאים. באופן ספציפי, לכידת התא השני יכול להתבצע רק לאחר שהתא הראשון שנלכד מחובר לפני השטח לאחר 24 שעות. זאו ואח ' דיווח על מכשיר מיקרופלואידיג מבוסס-droplet כדי ללכוד שני סוגים של תא אחד13. אנו יכולים למצוא כי מכשיר מיקרופלואידיג מבוסס-droplet עדיין מוגבל להתפלגות פואסון וניתן להשתמש בו רק בתאים שאינם מחוברים, ואין אפשרות לשנות את פתרון התרבות במהלך תהליך הטיפוח-תרגול.

בעבר, פיתחנו מיקרופלואידים "שבב שחרור הידרודינמי" כי מנצל כוחות הידרודינמיים דטרמיניסטי ללכוד סוגים מרובים של תא יחיד לתוך חדר התרבות, ולאחר מכן ניתן לבצע ניסוי שיתוף התרבות התא כדי לנתח התנהגות בודדת של העברת תאים תחת אינטראקציות תא תא14. שבב המעבר ההידרודינמי כולל מערך מסודר של יחידות, שכל אחד מהם מכיל ערוץ הומה-מעבר, אתר לכידת וחדר תרבות. על-ידי שימוש בשינוי בעמידות הזרימה בין הערוץ המיועד למעבר לבין חדר התרבות, והליך פעולה שתוכנן במיוחד, ניתן ללכוד שוב ושוב לתוך חדר התרבות. בעיקר, המרחב הגדול של חדר התרבות יכול לא רק למנוע את הריקון של התא במהלך לכידת התא, אלא גם לספק מספיק מקום עבור התאים כדי להפיץ, מתרבים ולהגר, ומאפשר התבוננות של לחיות אינטראקציה בין תאים בודד. במאמר זה, אנו מתמקדים בייצור של התקן זה ושלבי פרוטוקול מפורטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור עובש וופל על ידי ליתוגרפיה רכה

הערה: נתוני תבנית המסיכה זמינים בפרסום הקודם שלנו14.

  1. מייבשים 4-בעובי וופל סיליקון בתנור של 120 ° c במשך 15 דקות.
  2. ספין מעיל 4 גרם של SU-8 2 שלילי photoresist על 4-inch סיליקון וופל ב 1,000 rpm עבור 30 כדי ליצור 5 יקרומטר שכבה עבה (שכבה #1).
  3. שכבת אפיה רכה #1 בפלטה של 65 ° c במשך 1 דקות ולאחר מכן העבר שכבה #1 לפלטה של 95 ° c במשך 3 דקות.
  4. שכבה מגניבה #1 לטמפרטורת החדר, מניחים אותו על המחזיק של המסכה חצי אוטומטית מסכה, ולהתיישר עם השכבה #1 מצופה כרום (שכבת אתר לכידת).
  5. לחשוף את השכבה #1 עם אור UV 365 ננומטר במינון של 150 mJ/cm2.
  6. הסרת שכבה #1 מהתנינים ולאחר אופים בפלטה של 65 ° c במשך 1 דקות. שכבת העברה #1 לפלטה של 95 ° c במשך 1 דקות.
  7. שכבה מגניבה #1 לטמפרטורת החדר. לטבול ב-פרופילן גליקול מונואתיל אתר הפתרון אצטט לשטוף את photoresist uncrosslinked קושרים עבור 2 דקות. יבש בעדינות עם גז חנקן כדי לחשוף שכבה #1 סימון יישור.
  8. כסו את השכבה #1 סימון יישור על-ידי קלטת דבק, מעיל ספין 4 גרם של SU-8 10 שלילי photoresist אל השכבה #1 ב 1,230 rpm עבור 30 s כדי ליצור 25 יקרומטר שכבה עבה #2.
  9. הסירו את הקלטת, שכבת אפיה רכה #2 בפלטה של 65 ° c במשך 3 דקות ולאחר מכן העבר שכבה #2 לפלטה של 95 ° c במשך 7 דקות.
  10. שכבה מגניב #2 לטמפרטורת החדר, שכבת מקום #2 על המחזיק של המסכה חצי אוטומטי מסכה, וליישר את השכבה #2 מצופה כרום (לעקוף את שכבת הערוץ) לסמן #1 יישור השכבה.
  11. לחשוף את השכבה #2 עם אור UV 365 ננומטר במינון של 200 mJ/cm2.
  12. הסרת שכבה #2 מהתנינים ולאחר האפייה בפלטת 65 ° c במשך 1 דקות ושכבת העברה #2 לפלטה של 95 ° c במשך 3 דקות.
  13. שכבה מגניבה #2 לטמפרטורת החדר, ומכסים את השכבה #1 סימון יישור על-ידי דבק. מעיל ספין 4 גרם של SU-8 2050 שלילי photoresist אל שכבה #2 ב 1,630 rpm עבור 30 כדי ליצור שכבה 100 בעובי יקרומטר #3.
  14. הסירו את הקלטת, שכבת אפיה רכה #3 בפלטה של 65 ° c במשך 5 דקות, ולאחר מכן העבר שכבה #3 לפלטה של 95 ° c במשך 20 דקות.
  15. שכבה מגניבה מ#3 לטמפרטורת החדר, המקום שכבה #3 על המחזיק של המסכה חצי אוטומטי מסכה, וליישר את השכבה #3 מצופה כרום (שכבת קאמרית התרבות) השכבה #1 סימון יישור.
  16. לחשוף את השכבה #3 עם אור UV 365 ננומטר במינון של 240 mJ/cm2.
  17. הסרת שכבה #3 מהתנינים ולאחר האפייה בפלטה של 65 ° c במשך 5 דקות. שכבת העברה #3 לפלטה של 95 ° c במשך 10 דקות.
  18. שכבה מגניבה #3 לטמפרטורת החדר. לטבול את הפתרון פרופילן גליקול monomethyl כדי ששטף את photoresist בלתי מקושרים עבור 10 דקות, ויבש בעדינות עם גז חנקן.

2. הכנה להתקן PDMS ללכידת תאים בודדים מרובים

  1. מניחים את העובש וופל ואת הצלחת שקילה המכילה 100 μL של triכלור silane ב desiccator (רק עבור silaniטיזציה) ולהחיל ואקום (-85 kPa) עבור 15 דקות.
    הערה: Silanize משטח וופל עם triכלור silane ליצור משטח הידרופובי נכסים לפני PDMS castingso כי זה יכול להיות מאמץ להיות מקולף מן העובש PDMS וופל.
  2. לעצור את הוואקום, ולאחר מכן silanize עובש וופל בdesiccator (רק עבור silanize) ב 37 ° c עבור לפחות 1 h.
  3. מערבבים בסיס PDMS ו PDMS לריפוי הסוכן ביחס של 10:1. יוצקים סך של 20 גרם של PDMS מעורבת על עובש וופל בצלחת 15 ס מ.
  4. מניחים את המנה 15 ס מ לתוך desiccator ולהחיל ואקום (-85 kPa) עבור 1.5 דקות. לאחר מכן להסיר את המנה 15 ס מ מdesiccator. . שמרו על 20 דקות בטמפרטורת החדר לבסוף, להסיר בועות אוויר שיורית ב-PDMS עם גז חנקן.
  5. מניחים את הצלחת 15 ס מ בתנור ב 65 ° c עבור 2-4 h כדי לרפא PDMS.
  6. הסר את העותק המשוכפל PDMS מן העובש וופל, ולאחר מכן אגרוף 1.5 mm ו שקע 0.5 מ"מ ב-PDMS באמצעות הקוטר הפנימי 1.5 מ"מ ו מנקב בקוטר הפנימי של 0.5 mm (איור 1ג).
  7. נקה את העותק המשוכפל של PDMS ואת משטח השקופית עם סרט נשלף ולאחר מכן התייחס למשטח עם פלזמה חמצן (100 W עבור 14 s).
  8. יישר באופן ידני את העותקים המשוכפלים של PDMS עם השקופית והבא אותם במגע זה עם זה.
  9. הצב את השקופית PDMS בתנור של 65 ° c ליום אחד.
    הערה: התחברות קבועה בין השקופית לעותק המשוכפל של PDMS מושגת כדי ליצור את ההתקן.
  10. לטבול את המכשיר PDMS במיכל מלא מלוחים מאגור פוספט ומקום לתוך desiccator. לאחר מכן להחיל ואקום (-85 kPa) עבור 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
  11. מניחים את המכשיר PDMS במכסה של תרבות התא ולעקר את המכשיר עם אור UV (גל קל: 254 ננומטר) עבור 30 דקות.
  12. החלף את מאגר התקן PDMS עם בינוני (בינונית-F12 הבסיס מכיל 1% אנטיביוטיקה ו 10% סרום העובר העוברי) ו מודדת את המכשיר PDMS ב 4 ° צ' ליום אחד. פעולה זו מונעת מתאים לדבוק במשטח PDMS.

3. הכנת השעיית תא בודד

הערה: סוגי התאים כוללים תאי הלימפה האנושיים האדם (LECs), האדם OSCC TW 2.6 תאים מביע WNT5B הספציפי מרין (WNT5B sh4) ו-וקטור בקרה (pLKO-GFP) אשר התקבלו מן המחקר הקודם שלנו15. עיין בפרסום הקודם שלנו לקבלת צעדי טיפוח מפורטים.

  1. הסר את אמצעי התרבות כאשר התאים משיגים 70-80% זרימה. ואז לשטוף בעדינות את התאים עם 5 מ ל של PBS סטרילי שלוש פעמים.
  2. הוסף 1 מ ל של מדיום Dמאמ-F12 המכיל 1 צבע פלורסנט μM לתוך WNT5B sh4 ו pLKO-GFP תאים (להשתמש במדיום MV2 עבור LECs) ולאחר מכן הופך את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: LECs היו מוכתמים עם ירוק כלורמאטילתעין diacetate (CMFDA) לצבוע, תאים WNT5B sh4 היו מוכתמים עם כחול 7-אמינו 4-כלורמורמרין (CMAC) צבען ו pLKO-GFP היו מוכתמים בצבע פלורסנט אדום דיל.
  3. לשטוף בעדינות את התאים עם 5 מ ל של PBS סטרילי שלוש פעמים.
  4. הסר את ה-PBS והוסף 2 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין-EDTA עבור LECs).
  5. דגירה את התאים 4 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להקיש בעדינות את הצלחת תרבות הרקמה כדי לקדם את הניתוק התאים.
  6. הוסף 4 מ ל של מדיום Dמאמ-F12 כדי לפזר WNT5B sh4 ו pLKO-GFP תאים (עבור LECs להשתמש 3 mL של MV2 medium ו 1 מ ל של טריפסין פתרון מנטרל). ואז להעביר את התאים לתוך שפופרת 15 mL, וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות.
  7. הסר את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של מדיום DMEM-F12 בעדינות. לספור את מספר התאים החיים בתוך הטציטומטר באמצעות שיטת ההדרה הרגילה של טריקון כחול16. הכינו 1 מ ל של השעיית תא ב 3 x 105 תאים/הריכוז ML ב Dמאמ-F12 בינונית, ולאחר מכן לשמור על התאים בקרח כדי למנוע צבירת תאים.
    הערה: כדי לשפר את יעילות לכידת התא בודד, הכנה זהירה של השעיית התא היחיד עם הנתק היטב נדרש.

4. לכידת תא בודד ותלת-ממדי של תאים בודדים

  1. לחבר צינורית פולי-טטרמטאן, בין משקע ההתקן ומשאבת המזרק. הסר את המדיום ולהוסיף 1 μL של השעיית תא בריכוז של 3 x 105 תאים/mL לתוך השקע של התקן pdms.
  2. טען את ההשעיה התא לתוך המכשיר על ידי משאבת מזרק בקצב הזרימה של 0.3 μL/min (איור 2א). כיוון הזרימה הוא מהים אל השקע.
    הערה: טען מיד לאחר הוספת התא הבולם לתוך השקע כדי למנוע משקעי תאים.
  3. הוסף 1 μL של מדיום DMEM-F12 לתוך ההתקן של התקן PDMS לאחר שלב 4.2. לטעון את המדיום DMEM-F12 לתוך המכשיר על ידי משאבת מזרק בקצב הזרימה של 0.3 μL/min (איור 2B). כיוון הזרימה זורם מהים אל השקע.
  4. טען 0.3 μL של מדיום Dמאמ-F12 לתוך המכשיר על ידי משאבת מזרק בקצב הזרימה של 10 μL/min (איור 2ג). כיוון הזרימה זורם משקע החשמל.
  5. חזור על שלבים 4.1 כדי 4.4 כדי לטעון סוגי תאים אחרים לתוך ההתקן.
  6. לאחר השלמת לכידת התא, להשתמש במיקרוסקופ עם עדשת 4x לתמונה כל חדר תרבות.
    הערה: פליטת הקרינה הפלואורסצנטית של התאים שימש כדי לזהות ולספור את מספר התאים הבודדים בכל חדר תרבות.
  7. הסירו את מחסום הגוף ואטמו את השקע ואת הפורקן עם הקלטת של פוליופין כדי ליצור מערכת תרבות סגורה.
  8. להעביר את המכשיר PDMS לצלחת 10 ס מ תרבות ולהוסיף 10 מ ל של PBS סטרילי סביב המכשיר PDMS כדי למנוע אידוי של המדיום מהמכשיר.
  9. העבר את קערת התרבות לאינקובטור (37 ° C, 5% CO2 ו-95% לחות) לתרבות משולשת של תא בודד.
  10. להתבונן באופן מיקרוסקואני ולצלם צמיחת תאים כל 12 h.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקן כולל מבנה בן שלוש שכבות, כפי שמוצג על-ידי הצילום החתך של התקן PDMS שנחתך (איור 1א). השכבה הראשונה מכילה אתר לכידת (6.0 יקרומטר ברוחב ו 4.6 יקרומטר בגובה) המחבר את חדר התרבות ואת ערוץ ידי-pass. ההבדל בין התנגדות הזרימה בין חדר התרבות והערוץ של המעבר גורם לתאים לזרום לתנוחת הלכידה ולמלא את הכניסה לנתיב הקטן. לאחר שנלכד תא בתנוחת הלכידה, עמידות הזרימה של הנתיב הקטן מוגברת, וגורמות לתא הנכנס הבא לעבור לכיוון ולאורך ערוץ המעבר אל אתר הלכידה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציות התרבות של תאים שונים מיקרוסביבה הגידול לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות הגידול17. כדי להבין את המנגנון של אינטראקציות תא תא, מערכות שיתוף התרבות משמשות כשיטה אנליטית נפוצה. עם זאת, סוגי תאים מרובים והטרוגניות של התאים עצמם הובילו למורכבות ניסויית ולקשיים אנליטיים.

השבב ההידרודינמי מאפשר טעינה מרובה של תאים בודדים בחדר התרבות בשיטה דטרמיניסטית, מבלי להיות מוגבל על ידי הגבלת התפלגות הפואסון בשיטת הדילול ופלטפורמת המיקרוגל. על-ידי מתן יעילות גבוהה ללכידת תאים בודדת (ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענק ממשרד המדע והטכנולוגיה (105-2628-E-400-001-MY2), ואת תוכנית הדוקטורט בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, אוניברסיטת צ'ונג הסינג הלאומית ומכוני מחקר בריאות לאומית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3M מתקדם פוליאולפין אבחון מיקרופלואידית קלטת רפואית3M חברה9795R
אנטיביוטיקהBiowestL0014-100גלוטמין-פניצילין-סטרפטומיצין
AutoCAD תוכנהAutodeskAutoCAD LT 2011חלק מס' 057C1-74A111-1001
CellTracke כחול CMAC צבעInvitrogenC2110
CellTracker ירוק CMFDA צבעInvitrogenC7025
תנור קונבנציונאליחברת YEONG-SHINovp45
מייבשבל-ארט מוצריםF42020-0000מייבש ואקום חוסך מקום 190 מ"מ בסיס לבן
DiIC12(3) צבע קרום התאBD Biosciences354218משמש כגשש תאים
DMEM-F12 בינוניGibco11320-082
גידול תאי אנדותל בינוני MV 2PromoCellC-22022
סרום בקר עוברי HycloneThermoSH30071.03HI
מזרק זכוכית מסדרת המילטון 700 (0.1 מ"להמילטון80630100 ומיקרו; L, דגם 710 RN SYR, NDL נשלף קטן, 22 שניות ga, 2 אינץ', סגנון נקודה 2
אגרוף Harris Uni-Coreטד פלה בע"מ.15075בקוטר פנימי של 1.5 מ"מ
טד פלה בע"מ.15071עם 0.5 מ"מ קוטר פנימי
של חברת YOTECYS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
פלזמת חמצןNORDSON MARCHAP-300
מנקה פלזמהNordsonAP-300מערכת טיפול בפלזמה ספסל
ערכת פולידימתילסילוקסן (PDMS) ערכתDow corningSylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.קוטר פנימי TFT-23T, 0.51 מ"מ; קוטר חיצוני, 0.82 מ"מ
סרט נשלף3M חברתסקוטש נשלף 811
פרוסת סיליקוןEltech corperationSPE0039
ציפוי ספיןSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2 אינץ' ~ 6 אינץ'
סטריאומיקרוסקופLeica Microsystems LeicaE24
SU-8 10 פוטו-רזיסט שליליMicroChemY131259
SU-8 2 שלילי פוטו-רזיסטMicroChemY131240
SU-8 2050 שלילי פוטו-רזיסטMicroChemY111072
SU-8 מפתחGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCפרופילן גליקול מונומתיל אתר אצטט
משאבת מזרקהרווארד מכשיר703007
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. מסוכנים. מאכל לדרכי הנשימה, מגיב באלימות עם מים.
תמיסת נטרול טריפסיןGibcoR-002-100
) עם אגרוף Harris Uni-Core

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  3. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804(2008).
  4. Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
  5. Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).
  8. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  9. Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  10. Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
  11. Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
  12. Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  13. Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
  14. He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
  15. Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503(2016).
  16. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  17. Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
  18. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  19. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  20. Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Single Cell Co CulturePDMS

מאמרים קשורים