אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

Vivek Bhaskaran; Pierpaolo Peruzzi

doi:10.3791/60215

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

5.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60215

⸱

4 באוקטובר 2019

Vivek Bhaskaran¹ , Pierpaolo Peruzzi¹

¹Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

תקציר

הרלוונטיות הביולוגית של microRNAs (miRNAs) בבריאות ובמחלות מסתמך באופן משמעותי על שילובים ספציפיים של מירנאס רבים בו בו במקום הפעולה של Mirnas יחיד. האפיון של אלה מודולים miRNAs ספציפיים הוא צעד בסיסי למקסם את השימוש בהם בטיפול. זה רלוונטי מאוד כי התכונות הקומבינטורית שלהם יכול להיות מנוצל כמעט. המתואר כאן היא שיטה להגדיר חתימה ספציפית miRNA רלוונטי השליטה של כרומטין repressors הכרומטוגניים ב glioblastoma. הגישה הראשונה מגדירה קבוצה כללית של miRNAs כי הם הפונים בגידולים בהשוואה לרקמות נורמלי. הניתוח מעודן עוד יותר על-ידי תנאי תרבות דיפרנציאלים, והבקיע קבוצת משנה של miRNAs אשר מבוטאים בו במהלך מדינות סלולר ספציפיות. בסופו של דבר, miRNAs כי לספק מסננים אלה משולבים לתוך הטרנסגנים מלאכותיים polycistronic, אשר מבוסס על פיגום של הגנים הקיימים מירונה אשכולות, לאחר מכן משמש ביטוי יתר של אלה מודולים Mirnas לתוך מקבל תאים.

מבוא

mirnas מציעים הזדמנות ללא תחרות לפיתוח של גישה טיפולית רחבה למחלות רבות¹^,²^,³, כולל סרטן⁴^,⁵. זה מבוסס על מספר תכונות ייחודיות של מולקולות ביולוגיות אלה, כולל גודל קטן שלהם⁶, biogenesis פשוט⁷, ונטייה טבעית לתפקד באסוציאציה⁸. מחלות רבות מתאפיינות בביטויים ספציפיים של ביטוי miRNA, אשר לעתים קרובות להתכנס על התקנה של פונקציות ביולוגיות מורכבות⁹. מטרת שיטה זו היא הראשונה להגדיר אסטרטגיה כדי לזהות קבוצות של miRNAs הקשורים בסינרגיה לפונקציות סלולריות ספציפיות. כתוצאה מכך, הוא מספק אסטרטגיה להקמת מחדש של שילובים כאלה של miRNA במחקרים ויישומים במורד הזרם.

שיטה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של miRNAs מרובים בבת אחת, מינוף על המיקוד הסימולטני שלהם של מספר רב של mRNAs, ובכך ללכוד את הנופים המורכבים של מחלות. גישה זו הועסק לאחרונה כדי להגדיר קבוצה של שלושה miRNAs כי 1) הם בו מוסתות בו בסרטן המוח 2) להראות דפוס חזק ביטוי שיתוף במהלך בידול עצבי, כמו גם בתגובה ללחץ גנוטוקסיידי קרינה או . סוכן די. אנ. איי קומבינטורית re-ביטוי של מודול זה של שלושה miRNAs על ידי שיטת האשכול המתואר להלן תוצאות הפרעה עמוקה עם הביולוגיה של תאים סרטניים ניתן להשתמש בקלות כאסטרטגיה ריפוי גנטי למחקרים פרה-קליניים¹⁰. פרוטוקול זה עשוי להיות מעניין במיוחד לאלה המעורבים במחקר miRNA ויישומים הטרנסלבותית שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. אפיון מירכי הקשורים פונקציונלית בגלינובלסטומה

ניתוח של ביטוי נרחב miRNA הדיפרנציאלי במוח גלנובלסטומה
1. ראשית, בדוק את מירנאס החוצה. באופן משמעותי ביותר בגידול ניתן להשיג זאת באמצעות לפחות שלוש שיטות שונות:
  1. שלי הגנום אטלס הסרטן, נמצא ב https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, עבור רצף נתונים¹¹.
  2. לבצע ניתוח microarray מתוך מדגם פעיל חדש¹².
  3. השתמש בערכות נתונים שפורסמו בעבר¹³.
    הערה: באיזו שיטה נבחר, הפלט מספק קבוצה גורפת של miRNAs אשר הביטוי הוא מתאם סטטיסטית (או ישירות או הפוך) עם ביולוגיה של הגידול. קבוצה ראשונית זו מהווה את מאגר miRNAs שנותחו עוד לזיהוי קבוצת משנה של miRNAs המציגה את השיוך התפקודי הקפדני ביותר על-ידי ביצוע ניתוח דינמי יותר של שינויי ביטויים, כפי שמתואר להלן.
ניתוח ביטוי מיוחד לתנאי miRNA
1. אינדוקציה של בידול התא:
  1. השתמש במנות פלסטיק מצופות מראש ללייזין (PDL) כדי להעדיף את היווצרות התרבות המונאולייר. עבור ציפוי צלחת, לפזר PDL במים בריכוז של 100 μg/mL. השתמש 1 mL של פתרון לכל 25 ס"מ על פני שטח². לשטוף 2x עם PBS 6 h לאחר היישום של פתרון PDL.
  2. צלחת בתאי גזע עצביים האדם בכמויות שוות (100,000 תאים/5 mL) או בינונית תא גזע (נוירובלית בינונית + B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), בידול astrocytic (DMEM דיום + 10% FGF), או מדיום בידול עצבי (נוירובסיס בינונית + B27 תוספת, + 2 חומצות μM retinoic)¹⁴. הפרוטוקול עבור אוליגודנדרוציטים בידול דורש תוספת IGF-1 (200 ng/mL) לאחר הסרת egf/fgf¹⁴^,¹⁵.
  3. לאחר ציפוי תא, מקום בחממה לשבוע 1 ב 37 ° c, 5% CO₂.
2. הוצאת רנ א:
  1. לאחר 7 ימים, להסיר את התאים מהאינקובטור ולהסיר את המדיום.
  2. שטוף את התאים עם PBS (5 מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 1 מ ל של מגיב לפירוק (ראה טבלת חומרים) כדי lyse את התאים ומגרד את התאים לתוך 1.5 mL microfuge הצינור באמצעות מגרד התא. שמור את הצינורות המכילים את התאים למטה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
  3. המשך לבידוד RNA מוחלט בעקבות הוראות היצרן.
3. ניתוח ביטוי miRNA:
  1. לכמת את הביטוי הדיפרנציאלי של miRNAs ספציפיים שזוהו בשלב 1.1 בקרב שלושת דפוסי הבידול על ידי ה-PCR בזמן אמת, באמצעות בדיקה TaqMan ובעקבות פרוטוקולי היצרן עבור תמלול והגברה PCR ( איור 1).
אימות מושבות miRNA על ידי אתגרים ספציפיים למתח
1. תרבות G34 גלנובלסטומה בתאי גזע בינונית נוירובסיס + B27 תוספת + 20 ng/mL EGF/FGF. התחל עם 1 x 10⁶ תאים 5 מ ל ב 25 ס מ² בקבוקון מצורף נמוך.
2. החל 48 h לאחר ציפוי, להוסיף ריכוזי ההכפלה של הסוכן temozolomide al, הסוכנת של DNA (TMZ) כל 5 ימים, כדלקמן:
  1. התחל עם 5 μM במשך 5 ימים. לאחר 5 ימים, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום טרי ללא temozolomide, כדי לאפשר לתאים ששרדו להתאושש. לאחר 48 h, להוסיף 10 μM TMZ ו הדגירה עבור עוד 5 ימים.
  2. חזור על שלב 1.3.2.1, הכפלת TMZ הריכוז בכל פעם, עד ריכוז של לפחות 100 μM הגיע ותאים להיות עמידים בפני הסם¹⁰.
3. בניסוי מקבילי, מקרין G34 תאים כדלקמן:
  1. החל 48 h לאחר ציפוי 1 x 10⁶ תאים ב 5 מ ל ב 25 ס מ² בקבוקון מצורף נמוך, הפעלת תאים עם 2 Gy של אנרגיה (כל הקרנת מתן לפליטת פוטון הוא מקובל). החזר את התאים אל החממה ואל תפריע. לאחר 48 h, להקרין את התאים שוב עם 2 Gy של אנרגיה נוספת.
  2. חזור על השלב 1.3.3.1 4x עד סך של 10 Gy של אנרגיה מנוהל.
  3. להחזיר את התאים לחממה ולתת להם להתאושש בינוני טרי לפחות 5 ימים לפני ניתוח במורד הזרם.
4. לאחר אינדוקציה של התנגדות, התאים lyse באמצעות מגיב לפירוק לחלץ כולל RNA על פי פרוטוקול של היצרן.
5. לנתח את הביטוי של miRNAs מסוימים שזוהו בסעיפים 1.1-1.2 כפי שמתואר בשלב 1.2.1 (איור 2).
אפיון ההתכנסות הפונקציונלית של מירנאס באשכולות
1. השג את המיקוד החזוי של כל miRNAs מוגדר בסעיפים 1.2-1.3 המתקבלים באמצעות Mirnas כלים חיזוי היעד.
  הערה: אנחנו בדרך כלל האתר TargetScan, כפי שאלגוריתם שלה מתעדכן מדי פעם¹⁶. כלים נוספים לחיזוי הם מירנדה¹⁷, mirdb¹⁸, ו דיאנה-mirdb¹⁹. כל התוכניות הללו הן יישומים מבוססי אינטרנט ללא תשלום.
  1. מהעמוד הקדמי של Targetscan, בחר באפשרות miRNA של עניין מהתפריט הנפתח שאוכלס מראש. לחץ על לחצן Submit .
  2. הורד את רשימת היעדים המתקבלת כגיליון אלקטרוני באמצעות הקישור לטבלת ההורדות (איור משלים 1).
  3. כדי להקטין את הסיכויים של תחזיות חיוביות שקריות, כלול רק מטרות בתוך עמודת האתרים ששומרו בניתוחי במורד הזרם. כמו כן, ניתן להשיג היתר נוסף באמצעות תוכניות חיזוי miRNA נוספות (ראה לעיל) ורק כולל מטרות המשותפות לכל האלגוריתמים.
2. לסווג את היעד המתקבל על פי קטגוריות האונטולוגיה של גנים באמצעות ToppGene סוויטה²⁰ כדי להעריך עבור העשרה של מסלולים המשותפים לכל mirna.
  1. הדבק את רשימת היעדים שהושגו משלב 1.4.1 בחלון "ערכת הגן הדרכה", באמצעות סמל HGNC כסוג הערך. לחץ על שלח ≫ התחל. התוכנית תספק טבלת פלט המציגה את הקטגוריות "Go" המשמעותית ביותר עבור רשימת הגנים המוזנים (איור משלים 2).
3. כדי לקבוע לבסוף את התרומה של כל miRNA לוויסות של מסלול משותף או תהליך הסלולר (במקרה זה, תקנה כרומטין), לבדוק כל היעד המתקבל בשלב 1.4.1 נגד הרשימה המלאה של גנים המעורבים בתהליך הסלולר הספציפי ( i.e., רגולציה כרומטין), באמצעות הפונקציה של דיאגרמת הקבוצות המסופקת באתר האינטרנט http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
  הערה: תוכנית זו מאפשרת הצטלבות של קבוצות מרובות בעת ובעונה אחת (איור 3). המטרות הייחודיות הספציפיות שסופקו על ידי כל miRNA מסומנים ונבחרו לניסויים פונקציונליים במורד הזרם.
  1. בעמוד הראשון של התוכנית, להעלות או להעתיק/להדביק את הרשימה אם היעד mRNAs עבור כל miRNA או עניין בחלונות המתאימים. שם כל רשימה עם מזהה ייחודי.
  2. לחץ על שלח. התוכנית תספק פלט חזותי של דיאגרמת חיתוך קבוצות עם מספר גנים בכל סקטור, כמו גם רשימה מלאה של mRNAs עבור כל שילובי משנה והצטלבות.

2. הרכבת מודולים miRNA לתוך אשכול הטרנסגניים הפוליפוניים

הכנת הגרדום הטרנסגניים על בסיס מקום האשכול מיר-17-92
1. להשיג את הרצף נוקלאוטיד של האשכול מיר-17-92 מדפדפן הגנום Ensembl²¹. בחר את ~ 800 בסיס זוג בסיסי "רצף" המקיף את כל ששת הפינים מקודד miRNA של מקום ולפחות 200-נוקלאוטיד מאגפים רצפים הן במעלה (5 ') ו במורד הזרם (3 ') של רצף הליבה.
2. הדבק את הרצף למעלה לכל תוכנית עריכת מילה.
3. הגדירו את הרצף של כל אחד מששת סיכות השיער הילידים על ידי מחזורם ב-miRBase²². סמן כל אחד מרצפים אלה בטווח של רצף "הליבה" שזוהה בעבר. כל רצף בין כל צורה של סיכת מייצג רצפי מרווח, אשר חשובים לעיבוד הנכון של המשגר.
4. הסירו את רצפי העצם המקוריים מרצף ה"ליבה", למעט 3-5 נוקלאוטידים בשני הקצוות של 5 ' ו-3 ', שישמשו כקבלה לסיכות השיער החדשות.
בניית הקידוד החדש של מירגנים מרובים של בחירה
1. לקבל רצפים סיכת ראש של miRNAs נועד להיות מבוטא יתר על השימוש ב-הטרנסגנים מ Mirnas. שים לב לנוקלאוטידים הספציפיים שבהם נמצאים האתרים של פצילות מיקרו-מעבד.
2. החלף את סיכות השיער שהוסרו (שלב 2.1.4) עם רצפי סיכת ראש של miRNAs הרצוי שהתקבלו בשלב 2.2.1.
3. הוסף רצפי הגבלה רצוי בשני האזורים האגפים של הטרנסגנים כדי להקל על שכפול משנה לתוך וקטורים מסירה של בחירה. ודא שרצפי ההגבלה שנבחרו אינם נוכחים ברצף עצמו.
4. עבור פקדים שליליים, להשתמש 20-נוקלאוטיד רצפים מקושקשות להחליף את הטבעי 20-נוקלאוטיד רצף של כל miRNA בוגרת. צור רצפי מקושקשות אלה באמצעות כלי מקוון כגון https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
אימות המבנה הדו-מימדי של הטרנסגנים
1. העתק את רצף הטרנסגניים המלא לתוך תוכנת החיזוי של מבנה RNA RNAweb קפל²³.
2. באמצעות הגדרות תוכנית רגילה, לחץ על המשך.
3. לנתח את הפלט הגרפי, במיוחד לנוכחות סיכות השיער מוגדרים היטב ונוכחות של מבני גזע כפול תקועים לפחות 11 נוקלאוטידים האבוטיים לאתר המחשוף מיקרו. כמו כן, חפשו את היעדר נקודות הסתעפות בתוך רצפי הראש (איור 4).

3. קבלת טרנסגנים על ידי סינתזה DNA

לאחר העיצוב באימות סיליקו של האשכול הצ miRNA, לקבל את רצף העבודה באמצעות סינתזה DNA מספקים מסחריים²⁴ ולהמשיך עם שיבוט במורד הזרם לתוך וקטורים ומסירה טרנסגנטית. השתמשנו וקטורים ויראליות עבור במסירה מחוץ למבחנה¹⁰ ו-adeno הקשורים וירוסים (aavs) עבור במסירה vivo גולגולתית²⁵.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה miRNAs כי הם בעקביות מוסדר בגידולים במוח, אשר מבוטא במיוחד במהלך בידול עצבי (איור 1) ומעורב בתגובת הישרדות הגידול לאחר (איור 2). הדבר מתבצע על-ידי ויסות מסלול דכאואני כרומטין מורכב. תבנית הביטוי המשותף הציעה פעילות סינגיסטית חזקה בקרב שלושת מירנאס (איור 3). כתוצאה מכך, ניצול הגודל הקטן והביוגנזה הפשוטה של miRNAs, החלק השני של פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לעצב trans...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מבוסס על הרעיון כי במקום לתפקד בבידוד, miRNAs הם רלוונטיים ביולוגית על ידי עבודה בקבוצות, וקבוצות אלה נקבעים באמצעות ההקשרים הסלולריים הספציפיים²⁶. כדי להצדיק גישה זו מנקודת מבט טרנסלתית, פרוטוקול המשך טיפול המאפשר בילוי של דפוס זה multi-miRNA בתאים/רקמות הוא הציג. זה אפשרי על ידי ניצול של ביוגנזה פשוטה יחסית של miRNAs, לפיו ההכרה של סיכת הראש האופיינית Mirnas על ידי מעבד הוא הכרחי ומספיק עבור עיבוד הנכון Mirnas²⁷. במקביל, זו דרישה מינימלית מאפשר להשתמש הגרדום ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה הארווי קושינג נוירו אונקולוגיה לתמיכה וביקורת בונה. עבודה זו נתמכת על ידי NINDS מענקים K12NS80223 ו K08NS101091 ל P. P.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.4% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז	IBI Scientific	IB70058
0.45 ומיקרו; יחידת סינון סטרילית	M Merck Millipore	SLH033RS
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	Eppendorf	22431081
צלחות 6 בארות	Greiner Bio-One	657160
עכברים אתימיים (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 תוסף	Thermo Fisher Scientific	12587010
בקבוק תרבית תאים	Greiner Bio-One	660175
מגרד תאים, 16 ס"מ	Sarstedt	83.1832
צזיום 137 irradiator	JL Sheperd and Associates	(בית הספר לרפואה של הרווארד)
כלורופורם	סיגמא-אולדריץ'	439142-4L
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט	תרמו פישר סיינטיפיק	11995040
דולבקו s מי מלח חוצץ פוספט	ג'יבקו	14190144
Eosin Y תמיסה	Sigma-Aldrich	E4009
סרום בקר עוברי	Sigma-Aldrich	F9665
	Sigma-Aldrich	HT501128
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1573
תמיסת המטוקסילין	Sigma-Aldrich	1051750500
תאים דמויי גזע של גליומה ראשונית אנושית (GBM62)			מסופק על ידי ד"ר א. א. צ'יוקה (בריגהם ונשים) s בית חולים, בוסטון, מסצ'וסטס)
תאים דמויי גזע של גליומה ראשונית אנושית (MGG4)			מסופק על ידי ד"ר הירואקי ווקימוטו (בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בוסטון, מסצ'וסטס)
וקטור לנטי-ויראלי pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	System Biosciences	CD511B-1
ליפופקטמין 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
מיקרוצנטריפוגה מקוררת	אפנדורף	דגם מס' 5424 R, מס' קט' 5404000138
מדיום הרכבה	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Nalgene צינורות צנטריפוגה תחתונים עגולים פוליקרבונט במהירות גבוהה	תרמו פישר סיינטיפיק	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
תאי אב עצביים (NPC)			מסופק על ידי ד"ר ג'ייקוב גודלבסקי (בריגהם ונשים s בית חולים, בוסטון, מסצ'וסטס)
מדיום נוירובזאלי	Thermo Fisher Scientific	21103049
Nikon eclipse Ti מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונעת	Nikon, Japan	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985088
צינורות PCR	סיגמא-אולדריץ'	CLS6571-960EA
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122
פטרי-מנות 94/16	גריינר ביו-וואן	632180
פולי-די-ליזין	סיגמא- אולדריץ'	P4707
EGF אנושי רקומביננטי	פפרוטק	AF-100-15
רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי	פפרוטק	AF-100-18B
חומצה רטינואית	Gibco	12587-010
ערכת רנ"א מיני-פרפ	Direct-zol	R2050
S1000 מחזור תרמי	Bio-Rad	1852196
מיקרו רדיאטור מונחה תמונה לבעלי חיים קטנים	Xstrahal Life Sciences, מתקן הליבה הבריטי	(מכון הסרטן דנה-פרבר, בוסטון, מסצ'וסטס)
Sorvall WX+ אולטרה-צנטריפוגה	תרמו פישר סיינטיפיק
StemPro Accutase	תרמו פישר סיינטיפיק	A1110501-StepOne
מערכת PCR בזמן אמת	יישומית ביו-סיסטמס
ארון הבטיחות הביולוגית SterilGARD	The Baker Company	SG403A-HE
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
T98-G	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך	Thermo Fisher Scientific	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4324018
Temozolomide	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek טמפרטורת חיתוך אופטימלית	פישר סיינטיפיק	NC9636948
ריאגנט טריזול	Thermo Fisher Scientific	15596026	מגיב ליזה
U251-MG	סוג אמריקאי קולקטי תרבות	ATCC HTB-17
U87-MG	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression System	תרמו פישר סיינטיפיק	K4970-00
מים, HPLC כיתה	פישר	W54
קסילן	סיגמא-אולדריץ'	534056

מתקן הליבה של תמיסת פורמלין תוסף תזונה 750001004376357

מקורות

Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767(2018).
Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442(2019).
Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).
Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).
Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).
Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).
Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודולי MicroRNA טיפול בגליובלסטומה טראנסגנים פוליציסטרוניים מלאכותיים פיגום miR-17-92 ניתוח TargetScan חליפת ToppGene פונקציית תרשים ונ חיזוי מבנה RNA עמידות לטמוזולומיד תאי גזע עצביים

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי