פרוטוקול הקפאה-מתישה לעיבוד כפות העכבר כדי להעריך מסלולים מולקולריים של דלקת רקמות במודל דלקת מפרקים קולגן המושרה

סיכום

שיטה מתישה קריוגניים כדי לעבד כפות מורתיות באמצעות טחנת חנקן נוזלי המקפיא פותחה כדי לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון שחולצו מן הרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים דלקתיות תגובות.

תקציר

יצירת פרופילים של שינויים מולקולריים ברקמות המקומיות חיונית להבנת המנגנון (ים) של פעולה של מועמדים טיפוליים בvivo. בתחום של מחקר דלקת פרקים, מחקרים רבים מתמקדים המפרקים דלקתית המורכבת תערובת מורכבת של עצם, סחוס, שריר, סטרומה תאים ותאים חיסוניים. כאן, הקמנו שיטה מכנית אמינה ואיתנה כדי לשבש כפות העכבר מודלק לתוך דגימות הומוגנית מרוסק בסביבה מבוקרת קריובית. חלבון ו-RNA lysates היו מעובדים כדי לאפשר את נקודות הקצה של פרוטאומית וטרנססקריפט ואפיון מולקולרי של מסלולים רלוונטיים למחלות ברקמה המקומית.

מבוא

דלקת מפרקים שיגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית מערכתית עם דלקת סימטרי מתמשך במפרקים ומעורבות נוספת של איברים כגון העור, הלב, הריאות, ועיניים¹. למרות הביטויים מערכתית של התגובה החיסונית ניכרת בחולים אנושיים, אחד הסימנים ההיכר של הפתולוגיה RA הוא הסתננות של תאים חיסוניים ברקמת אמתחת והתפשטות של תאים מערכת פיברונובקבוקון².

בדומה RA אנושי, העכבר קולגן המושרה דלקת מפרקים (CIA) מודל מעורר דלקת רקמה חזקה עם תגובות החיסון פעיל ברקמות אמתחת ו מערכתית תאים. הרגישות של זנים שונים של העכבר כדי CIA מודל קישורים לקומפלקס היסטליקציות העיקריים (mhc) haplotype ו אנטיגן מסוים תא T אינטראקציה עם תא^2,4. בנוסף, מסלולים פתוגניים רבים ב-RA האנושי, כולל הפקת נוגדן אוטומטי, מורכבות החיסון המערכת, הפעלת תא מיאלואידית, ביטויים פוליפרגניים והיווצרות pannoבקבוקון עם חדירה חיסונית מערכת, הם גם ברור במודל זה ^5,6. החוקרים המועסקים במודל זה מבוסס היטב CIA כדי לחקור את ההשפעות של טיפולי ציטוקין אנטי דלקתיות⁷. ביולוגי רבים מאושרים עבור מחלות אוטואימוניות או דלקתיות, כגון אנטי-tnfα ו anti-IL-6, נמצאים יעיל במודל ה-CIA^8,9.

יצירת פרופיל האינטראקציות של המערכת החיסונית ברקמת אמתחת היא חיונית כדי להבהיר מנגנונים מולקולריים הקשורים בפתוגנזה של RA. בסביבה הקלינית האנושית, מנהג נפוץ הוא לבצע ביופסיות מערכת המחט תחת הדרכתו של הדמיה אולטרסאונד. בהגדרות טרום קלינית, הארכיטקטורה הקטנה של המפרקים murine עושה הליכים ביופסיה הרבה יותר קשה אם לא בלתי אפשרי. לאחרונה, הדגמנו את הניצול של הדגם murine CIA כדי להעריך שילובים של תרופות כדי להשפיע על נקודות קצה שונים ולפתור את המחלה בגישה קומבינטורית¹⁰. מקפיא ההקפאה טחנת המכונה שיטת הטחינה היה מועסק כדי לעבד כפות מורתיות מודלק לתוך אבקות בסדר הומוגנית והקימו תהליכי הזרם כדי לחלץ RNA וחלבונים. שיטה זו מגינה על RNA וחלבונים מתהליכים degrative מגמטיים וכימיים ומאפשרת לנו להחיל שיטות אנליטיות מרובות על מקור יחיד הומוגניים.

פרוטוקול

כל ניסויי החיות נערכו בהתאם למדיניות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של ינסן R & D.

1. מקפיא קריוגני מיל מבוסס שיטת הטחינה

1. בסיום מחקר ה-CIA, עכברים להקריב עם 1.5% isof, ואחריו פריקה צוואר הרחם.
2. ביום עיבוד רקמות, מראש לצנן את כל המכשירים (מלקחיים, שחיקה בבקבוקונים, וכו ') על קרח יבש למינימום של 10 דקות. ללבוש כפפות תרמיות כדי למנוע נזק להקפיא.
3. חותכים כפות אחוריות עם מספריים בקו הפרווה כמתואר באיור 1א.
4. העבר כל כפה לתוך אחד 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת, לעצור את ההקפאה בחנקן נוזלי מיד, ולאחסן כפות קפואות ב-80 ° c. אין לשמור על הדוגמיות מוקפאות ליותר משבוע אחד.
5. מילוי טחנת המקפיא עם חנקן נוזלי כפי שמוצג באיור 1B ולתת לו לעבור לפחות 10 דקות.
6. שמרו על דגימה לא מעובד על קרח יבש והימנעו מחזורים להפשיר.
7. העברת אחד הרגליים האחוריות לתוך מקורר שחיקה פוליקרבונט גדול בקבוקון עם תקע הפלדה התחתונה, להכניס את impactor חקן טרום מקורר פלדה ולסגור את המבחנה פוליקרבונט שחיקה עם תקע העליון מקורר פלדה (איור 1ג).
8. העברת שיוף פוליקרבונט גדול מבחנות עם דגימות לתוך טחנת המקפיא מראש מלא נוזל ולסגור את המכסה עם אבזם גומי נמצא בחזית המכשיר.
9. תנו לדוגמיות להתקרר בחנקן נוזלי לדקה אחת.
10. להגדיר את טחנת המקפיא לתוכנית 1 דקה עם 10 מחזורי לשנייה ולחץ על כפתור התחל. לחכות לטחנת המקפיא כדי להשלים את המחזור שלה.
    הערה: המכונה גורמת לתיפוף להישמע כמו שחקן הפלדה נע הלוך ושוב. השתמש אטמי אוזניים כדי למנוע אובדן שמיעה.
11. פתח את המכסה של טחנת המקפיא, להוציא את המבחנה פוליקרבונט גדול שחיקה ולמקם אותו חולץ כפי שתוארה באיור 1D. הסר את תקע הפלדה העליון על-ידי הצבת לחץ כלפי מטה על הידית השחורה עד שהפלדה מחליק מתוך צינור הפוליקרבונט.
12. להעביר את שפתוח פוליקרבונט גדול שחיקה בקבוקון על קרח יבש. להסיר את המדחף פלדה עם מלקחיים טרום מקורר.
13. העבירו את האבקה הקפואה לצינור מקורר 50 mL.
14. משקל 30-50 מ ג של אבקה קפואה לתוך שפופרת קפוא 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה להפקת RNA ו 100-200 מ"ג של אבקה קפואה להפקת חלבון.
    הערה: האבקה הקפואה אמורה להיראות כמו לבנה או חול בהיר וורוד כמתואר באיור 1E.
15. לאחסן דגימות מרוסק ב-80 ° צ' ולהמשיך ל-RNA ולבודדים חלבון בתוך 24 h.

2. הפקת רנ א

1. הוסף 10 μL של β-mercaptoethanol (β-ME) לכל 1 מ"ל של מאגר RLT.
2. חישוב הנפח של מאגר RLT המתאים ליחס של 23.3 mL/mg של רקמות ולהוסיף את הנפח המתאים של מאגר RLT עם β-ME לצינור עם אבקה קפואה. יחס זה היה נחוש באופן אמפירי להיות אידיאלי עבור כפות העכבר.
3. מערבולת המדגם ב 3,000 RPM עבור 10 s.
4. מערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10 פעמים במרץ עם מצנעת 1 מ ל.
5. מערבולת המדגם שוב ב 3,000 RPM עבור 20 s.
6. צנטריפוגה את הצינור ב 13,000 x g עבור 2 דקות.
7. העבר 700 μL של supernatants לצינור טרי ולהוסיף 700 μL של 70% אתנול.
   הערה: אם < 700 μL הוא בתוך הצינור, זה מקובל להמשיך, עדיין הוספת כמות שווה של 70% אתנול.
8. טען 700 μL של המדגם לתוך טור טיהור של RNA.
9. צנטריפוגה את הצינור ב ≥ 10,000 x g עבור 30 s.
10. בטל את הזרימה וטען את החלק הנותר של הדגימה לעמודה RNeasy.
11. צנטריפוגה את הצינור ב ≥ 10,000 x g עבור 30 s.
12. למחוק את הזרימה ולשטוף את העמודה על ידי הוספת 700 μL של RW1 מאגר עם צנטריפוגה של ≥ 10,000 x g עבור 30 s. אם האפשרות ביצוע העיכול DNASE, 350 μL של RW1 מתווסף לפני הטיפול DNASE.  וגם 350 μL נוספים של RW1 מתווסף לאחר הטיפול DNASE.
13. אופציונלי) בצע צעד העיכול DNase בעקבות הוראות היצרן.
14. לשטוף את הצינור פעמיים על ידי הוספת 500 μL של מאגר RPE ואחריו צנטריפוגה ב ≥ 10,000 x g עבור 30 s. להיפטר לזרום בכל פעם.
15. יבש את העמודה על ידי צנטריפוגה ב ≥ 10,000 x g עבור 2 דקות.
16. אליוט RNA על ידי הוספת 50 μL מים עם צנטריפוגה ב ≥ 10,000 x g עבור 2 דקות. לאסוף זרימה דרך ולהעביר לתוך הצינור החדש 1.5 mL.
17. לקבוע את כמות ה-RNA בשיטת הבחירה של החוקר והחנות ב-80 ° c לפני ניתוח נוסף.

3. הפקת חלבון

1. לדלל את הפתרון המניה 10x לפירוק תאים ב 1x לפירוק תא פתרון מניות באמצעות תרבות התא מים כיתה.
2. מרכיבים מחדש את הקוקטייל פרוטאז מעכבי סט אני עם 1 מ ל של מים לעשות מלאי מעכב פרוטאז 100x.
3. הוסף 100 μL של פרוטאז המעכב כדי 9.9 mL של 1 x הליזה לבצע פתרון מלאי הסופי 1x.
4. הוסף 4 μL של קרח קר 1x מאגר לפירוק לרקמות mg (g., 800 μL של מאגר הליזה ל 200 מ ג של אבקת רקמות).
5. הוסף אחד 5 מ"מ מפלדת אל חלד לצינור.
6. מערבולת הצינור ב 3,000 RPM עבור 60 s. העבר את הצינור לקרח רטוב והמשך למדגם הבא.
7. מניחים את כל הצינורות לדוגמה בתיבה ולנענע את תיבת צנטריפוגה על הנדנדה ב 1,000 RPM, 4 ° צ' עבור 1 h.
   הערה: החוקרים עשויים לגלות כי הצבת תיבת אנכי יכול להקל על ערבוב טוב יותר עם חרוז.
8. צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x g ו 4 ° צ' עבור 15 דקות.
9. העבירו את הסופרנטנים לתוך צינורית טרייה והימנעו משכבת השומן בחלק העליון.
10. קבע את ריכוז החלבון הכולל. 10 עד 30-הדילול של חלבון ליפוסט הם אידיאליים עבור מבחן BCA.
11. מוסיף את המדגם לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות וחנות ב-80 ° צ' לפני ניתוח נוסף.

תוצאות

כאן, אנו מראים הדמיית תמונה מייצגת ג'ל של RNA שחולצו מן הכפות הקדמיות של עכברי ה-CIA באיור 2א. ה -28 rRNA ו-18 rRNA הלהקה מצביעים על כל הדגימות יש כמות מספקת של RNA שלם. לאחר מכן, אנו מציגים מגרש פיזור מייצג של ריכוזי חלבון סך מבוסס על ניתוח BCA חלבון באיור 2ב. ריכוזי חלבון מוחלטים מעכברים תמימים, עכברי CIA או עכברים מהסי. איי. אי תחת טיפולים שונים הם דומים לאורך קבוצות. כדי לקבוע את ריכוזי ציטוק...

דיון

למרות שיש הרציונל המדעי חזק להעריך מסלולים מולקולריים ברקמות אמתחת, דיווחים רבים על פרופיל החיסון של מודל ה-CIA murine התמקדו דם היקפי, בעוד חלבונים ו-RNA ניתוח נתונים של כפות מודלק הם מוגבלים למדי. ישנן מספר סיבות אפשריות להטיה זו: מפרקי הקרסול של מוריין אינם גדולים מ-~ 2 ס מ; האזורים המושפעים מורכב של עור, עצם ורקמות החיבור אשר לעתים קרובות קשה המגון באמצעות שיטות מסורתיות כמו מטחנות רקמה, מרגמה וטיט, סיליקה חרוז הפרעה, נשחקו או עיכול אנזימטי. שיטות אלה כתוצאה בדרך כלל המגון המלא שלם, חלבון נמוך או תשואה RNA, או איכות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חרוז נירוסטה 5 מ"מ	Qiagen	69989
בטא-מרקפטואתנול	סיגמא	M6250	חומר מפחית דגימה המעכב אנזימי RNASE
ערכת ביואנלייזר	Agilent	5067-1511	ערכת הסמכת RNA
b-מרקפטואתנול	סיגמא	M6250
קורנינג	מים בדרגת תרבית תאים	25-055-CI
תמיסת מלאי תא מים ליזה	איתות תאים	9803
צינור אפנדורף		צינורות	מיקרופוגה
צינור אפנדורף תיבת צנטריפוגה	Nalgene	5055	קופסה להחזקת צינורות אפנדורף בסידור צינור אופקי
Everlast 247 מהירות משתנה נדנדה	אמת מידה מדעית	BR5000
טחנת מקפיא	Spex Sample Prep	6875	מקפיא/טחנה לעיבוד כפות לאבקה מרוסקת
בקבוקון טחינה	Spex Sample Prep	6801	בקבוקון פוליקרבונט לעיבוד כפות לאבקה מרוסקת
ערכת פירס BCA	Pierce	23225	ערכה לכימות חלבון כולל
מעכב פרוטאז סט קוקטייל 1		מעכבי
פרוטאז Calbiochem 539131ערכת BCA חלבון	פירס	23225
ערכת קוונטיגן	Thermofisher	QP1013	ערכת ניתוח bDNA
בקירור מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	5417R	צנטריפוגה
RLT מאגר	Qiagen	79216	מיצוי RNA
מאגר RNeasy מיני ערכת	Qiagen	74104	כולל עמודת RNeasy, מאגר RLT ומאגר RW1
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	מרית נדנדה / שייקר
	VWR	10806-412	מרית להעברת אבקה
חרוז נירוסטה	Qiagen	69989	חרוז לערבוב במהלך מיצוי חלבון
מחלץ צינור	Spex מדגם הכנה	6884	חולץ להסרת החלק העליון של בקבוקון הטחינה
Vortexer	VWR	10153-838	ערבוב לדוגמא

22363204