הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60234

⸱

9 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

במאמר זה

סיכום

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

תקציר

המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.

מבוא

כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,3,4,5.

נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס מייצרים ATP כדי לנהוג בתגובות תאיים ולייצר את אבני הבניין הדרושות לסינתזה מקרומולקולה. מאז HSPCs יש מסה נמוכה מיטוכונדריאלי בהשוואה לתאים הבדיל6 והם מקיימים השקט בגומחות במח ארוי העצם, hspcs מסתמכים בעיקר על גליקוליזיס. ההפעלה של HSPCs משפר את חילוף החומרים היטוכונדריאלי שמוביל לאובדן השקט והכניסה הבאה שלהם לתוך מחזור התא. הפלסטיות המטבולית הזאת של hspcs מאפשר תחזוקה של בריכת hspc לאורך חיי מבוגרים6,7,8,9,10,11,12. לכן, זה קריטי לחקור את פעילויות חילוף החומרים שלהם, כגון שיעור צריכת החמצן (OCR; אינדקס של זירחון חמצוני) ואת שיעור חמצה מסירה (ECAR; אינדקס של גליקוליזיס) כדי לנתח את ההפעלה HSPC ואת מצב הבריאות. הן OCR ו-ECAR ניתן למדוד בו זמנית, בזמן אמת, באמצעות מנתח השטף החילוץ. עם זאת, השיטה הנוכחית דורשת מספר גדול של תאים וממוטבת עבור תאים מחסיד13. מאז HSPCs לא ניתן לבודד בכמויות גדולות מעכברים14, דורשים מיון כדי להשיג אוכלוסייה טהורה, הם תאים לא חסיד15, ואין אפשרות להיות מתורבת לילה מבלי להימנע בידול16, זה היה קשה למדוד את ה-OCR ואת ecar של hspcs. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות ללוות וידאו מבוססי הדרכות על איך למדוד נשימה מטבולית ו גליקוליזיס של כמה אלפי העצם מוריין מחמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי הילדים ברחבי המדינה טיפול בבעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).

הערה: הפרוטוקול מתואר בסדר כרונולוגי המתפרס במשך יומיים. השתמש ריאגנטים טרי כפי שמתואר בפרוטוקול להלן.

1. הכנת ריאגנטים ביום שלפני השיטת הזמן

  1. . מימה את מחסנית החיישנים
    1. דגירה 5 מ ל של הכייל (לוח חומרים) ב2 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך הלילה.
    2. פתח את ערכת שיטת השטף (טבלת חומרים) והפרד את מחסנית החיישן (ירוק; למעלה) מלוח כלי השירות (שקוף; למטה). הבא, למקם את מחסנית חיישן הפוך וצמוד לצלחת השירות.
    3. באמצעות מים סטריליים, למלא את הבארות של צלחת השירות (200 μL) ואת התאים סביב הבארות (400 μL).
    4. לטבול את מחסנית חיישן לתוך צלחת השירות וודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מים. ברז 3x כדי למנוע את היווצרות של בועות.
    5. מניחים את המחסנית מתחת לצלחת כלי השירות בחממה בלתי-משותפת של2 37 ° c. כדי למנוע אידוי של המים, ודא כי החממה מחולל כראוי. מניחים גביע פתוח המכיל את H2O כאמצעי זהירות נוסף ליד צלחת כלי הדיו, במיוחד אם משתמשים בתנור רגיל.
  2. . הכן את צלחת השיטת ההכנה
    1. לחטא את פני השטח של הקבינט אבטחה טיחות מחלקה 2 באמצעות 70% אתנול. . פתח את לוחית הכיסוי מתחת למכסה המנוע
    2. הוסף 40 μL של מסחרית זמין 0.01% (w/v) הפתרון פולי-L-ליזין (PLL) לכל הטוב של צלחת שיטת הנתונים מתחת למכסה המנוע.
    3. כסו את צלחת המערכת עם המכסה המסופק בערכה. מודקת את הלוחית הסגורה בטמפרטורת החדר (RT) מתחת למכסה המנוע במשך 1 h.
      הערה: המטרה של הדגירה היא לתת PLL לחלוק את פני השטח של צלחת השיטת כדי להקל על הדבקה של תאים ההשעיה על פני השטח של צלחת השיטת.
    4. לאחר 1 h הדגירה של צלחת השיטת, להסיר את הפתרון העודף עם מייבש ואקום סטרילי מבוסס ואוויר יבש היטב מתחת למכסה המנוע.
      הערה: זה לוקח ~ 30-60 דקות לאוויר יבש את הבארות של צלחת השיטה בעקבות הסרת PLL מוגזם באמצעות מייבש.

2. יום השיטת הזמן

  1. הכן את מיכל הדיו.
    1. הרם את מחסנית החיישן. מניחים אותו הפוך במכסה התרבותי של הרקמה ולהשליך את המים מן הצלחת כלי השירות.
    2. למלא את הצלחת השירות בארות עם 200 μL של טרום מחומם.
    3. ממלאים את התאים סביב הבארות עם 400 μL של כאשר.
    4. לטבול את מחסנית חיישן לתוך צלחת כלי השירות, וודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מכייל. ברז 3x כדי למנוע את היווצרות של בועות.
    5. באמצעות מחסנית חיישן מתחת לצלחת השירות בתוך מיכל שאינו CO2 37 ° c בחממה עבור 45-60 דקות.
  2. לקצור מח עצם ממורין.
    1. כדי להכיל מספר משכפל ביולוגי מספיק, תכנן להשתמש ב-HSPCs הנגזר מעכבר אחד לכל היותר בלוח השימוש.
      הערה: זו שיטת האיסוף מח עצם מספק ~ 50,000 ל80000 LSK HSPCs מכל עכבר. פרוטוקול זה כדי למדוד השטף החילוץ ממוטב עבור ~ 70,000 LSK HSPCs לכל טוב של 96 היטב צלחת.
    2. עכברים המתת חסד באמצעות שיתוף מנת יתר של2 ו צוואר הרחם, בעקבות שיטות IACUC מקומיות מאושרות.
    3. לחטא את פני השטח של כלים מבתר ואת הספסל באמצעות 70% אתנול.
    4. עבור כל עכבר, למלא מראש צלחת פטרי אחת עם מלוחים 1 x פוספט באגירה (PBS) המכיל 2% חום בלתי פעיל מופעל סרום העובר (FBS) ב RT.
      הערה: אין להשתמש ב-PBS מקורר כפי שהוא ייצור גושים בשלבים הבאים.
    5. תרסיס 70% אתנול (v/v) על העכבר כולו מורדמים. לבודד את כל העצמות, כולל גפיים העליון והתחתון, היפ עצמות, עצם החזה, צלעות, ושדרה, מהעכבר17,18. משוך החוצה חומר לבן מחוט השדרה של העכבר כפי שהוא יכול לזהם תאים LSK. הצב את כל העצמות ב-1x PBS (+ 2% FBS), כאשר הם נאספים, בצלחת פטרי עד לשימוש נוסף.
    6. היפוך צינור חרוט 50 mL (חדש בכל פעם) ולהשתמש בו כדי קצוצות עצמות שקוע ב-1x PBS (+ 2% fbs) בצלחת פטרי.
    7. באמצעות הצנרת 10 מ ל, פיפטה למעלה ולמטה (~ 10x) כדי לרוקן בצורה אחידה את התאים מעצמות, לאחר ריסוק עצמות.
    8. מניחים מסננת של תא 40 יקרומטר בשפופרת מלאה של 50 mL. טרום להרטיב את פני השטח של מסננת ידי העברת 1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS).
    9. מח עצם קציר-השעיית התא נגזר משלב 2.2.7 ולהעביר אותו דרך משטח רטוב מראש של מסננת התא כדי להסיר פסולת עצם.
    10. חזור על שלבים 2.2.6 דרך 2.2.9 עד כל חומרי העצם להפוך לבן כסמן כי רוב התאים מח עצם נאספים 50 mL חרוט.
      הערה: זה לעתים קרובות לוקח 2 50 mL שפופרות חרוט לכל העכבר כדי לאסוף את כל מח עצם נגזר התאים.
    11. צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות חרוטי המכילים מח עצם-תאים נגזר עבור 5 דקות ב 500 x g ו RT.
    12. . הסר את הסופרנטאנט להשעות את מח העצם-תאים נגזר (לשלב את התוכן של שניהם 50 mL) ב 5 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) כאמצעי אחסון סופי לשמור על תאים ב RT.
  3. . בסדר.
    1. הוסף 5 מ ל של צפיפות בינונית (כלומר, פיקדול) ל-15 מ"ל לצינור חרוט. ואז לאט להוסיף 5 מ ל של ההשעיה תא מח העצם. ודא שתאים נשארים כשכבה מעל למדיום מעבר הצבע של הדחיסות.
    2. צנטריפוגה עבור 30 דקות ב 500 x g ו RT. . אל תשתמש בבלם בצנטריפוגה ודא שצנטריפוגה נמצאת בהאצה הנמוכה ביותר האפשרית (לדוגמה, 1 האצה ו-0 האטה).
    3. לקצור את הממשק האמצעי של תאים מונונוכטיים (צבע לבן) לאחר צנטריפוגה לתוך צינור חדש 15 מ ל חרוט.
    4. לשטוף את התאים, שנקטפו מתוך צפיפות בינונית הדרגתי, עם 5 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . הסר את הסופרנטאנט
    5. חזור על שלב ה2.3.4.
    6. השהה מחדש את תוכן התא של הצינור ב-300 μL של 1x PBS (+ 2% FBS). מחבר 10 μL של השעיית תא עבור שליטה בלתי מוכתמת או צבע יחיד בצינור FACS.
  4. . מתאי מח עצם מורקיים
    1. הפוך קוקטייל של ביוטין-נוגדנים על-ידי ערבוב 3 μL לכל מדגם של הנוגדנים הבאים: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. הוסף 15 μL של קוקטייל הנוגדן biotin כדי 300 μL של תאים במח העצם מונונולי.
      הערה: כל נוגדן משמש ב1:100 דילול.
    2. מודלת תאים עם קוקטייל biotin-נוגדן במשך 30 דקות ב -4 ° צ' עם עצבנות כדי למנוע תאים בתחתית הצינור.
    3. הוסף 10 מ ל של מקורר 1 x PBS (+ 2% FBS) לתאים מעורבבים עם קוקטייל biotin-נוגדן.
    4. צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-400 μL של 1x PBS (+ 2% FBS). מחלקים 10 μL עבור streptavidin-בקרת צבע אחת.
    5. בקצרה מערבולת נגד biotin מיקרוחרוזים (טבלת חומרים) לפני השימוש. הוסף 80 μL של מיקרוחרוזים לכל דגימת תא (של 400 μL). מערבבים היטב ומשלבים במשך 20 דקות נוספות ב -4 ° c, עם עצבנות.
    6. הוסף 10 מ"ל של מקורר 1 x PBS (+ 2% FBS) לתאים. צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c.
    7. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). החנות ב -4 ° c בעת הגדרת יחידת הפרדה מגנטית.
    8. הצב עמודה (טבלה של חומרים) בשדה המגנטי של מפריד התא בסיוע מגנטי (מקינטוש) ב -4 ° c. הכן את הטור להפרדה מגנטית על ידי שטיפה עם 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) תחת זרם הכבידה ב 4 ° c.
    9. הוסף את ההשעיה של התא משלב 2.4.7 לעמודה שלפני הרטוב ב-4 ° c. הניחו לתאים לעבור דרך הטור ב-4 ° c ולאסוף קולחים בשפופרת חרוט של 15 מ ל.
      הערה: השבר עם תאים בלתי מסומנים בקולחים כגון זה מייצג את תאי השושלת המועשרת שליליים.
    10. שטוף עמודה עם 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) ב -4 ° c. חזור על 3x. לאסוף את הזרימה ולשמור אותו ב 4 ° c. לספור את התאים הקיימא על ידי טריקון כחול הדרה באמצעות הומוציטומטר.
    11. צנטריפוגה את הצינור החרוט 15 מ"ל המכיל את הזרימה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט השהה תאים מחדש ב-0.5 mL של 1x PBS (+ 2% FBS) והעבר את התוכן לשפופרת של FACS.
    12. הוסף 24 μL של קוקטייל הנוגדן LSK לכל 107 תאים. קוקטייל הנוגדן מכיל ריכוז שווה של 450-streptavidin נוגדן, PE-CY7-Sca1 נוגדן, ו-APC-c-Kit נוגדן.
    13. דגירה של 1 h ב 4 ° צ' עם עצבנות מתחת לחשיכה (מכוסה ברדיד פח).
    14. הוסף 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) לצינור FACS. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    15. השעיה מחדש של תאים מתויג באמצעות נוגדן 1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). הוסף 1 μL של 1 מ"ג/mL propidium יודיד להשעיה התא ממש לפני מיון.
    16. מסנן תוכן של צינור facs באמצעות מסננת 40 יקרומטר ימינה לפני מיון תאים lsk.
    17. לאסוף תאים LSK, באמצעות מיון FACS, לתוך צינור 1.5 mL המכיל 0.5 mL של מדיה מלאה בתוספת של 2 מ"מ גלוטמין, 3 מ"ג/mL גלוקוז, 1 מ"מ פירובט, 1x הטרובטין (TPO), הגורם הראשון של תא גזע (SCF), 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 7.4 pH

3. נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס אסאמר של LSK HSPCs

  1. לאחר זריעה של LSK
    1. התאים צנטריפוגה LSK משלב 2.4.17 עבור 5 דקות ב 500 x ו RT. לבטל את הסופרנטאנט.
    2. השהה את התאים מחדש במדיה מלאה לריכוז סופי של לפחות 70,000 תאים/40 μL.
    3. תוכן הזרעים של 40 μL מדיה (המכיל 70,000 תאים) בצלחת מצופה PLL 8-באר משלב 1.2.4. . השאר את כל הבארות הפינתיות ריקות
    4. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 450 x ו RT. . אל תחיל את הבלמים ודא כי תאים מחוברים לתחתית היטב באמצעות המיקרוסקופ הפוך.
    5. הוסף 135 μL של מדיה מלאה לתאים בכל באר עבור אמצעי אחסון סופי של 175 μL. הוסף 175 μL של מדיה מלאה לשתי פינות הלוחית כחללים ריקים.
    6. מודטת התאים בחממה שאינה CO2 עבור 2 h ב 37 ° c.
    7. הגדר תוכנית להוסיף תרופות לכל טוב של צלחת הבאר במנתח באמצעות מדד המתואר בטבלה 2 (מבחן מיטוכונדריאלי) ושולחן 3 (מבחן הלחץ של גליקוליזיס).
      הערה: בזמן שתאים מודלים, הפעל את המכשיר וודא שהוא נמצא ב-37 ° c.
  2. מבחן מצוקה מיטוכונדריאלי
    1. להכין 45 μM פתרונות מניות של oligomycin, 50 μM קרבקסיל ציאניד 4-(טריפלורנומטוקסיק) פנילהידרזיט (FCCP) ו -25 μM פתרונות מניות של rotenone/antimycin A. כדי להכין 45 μM oligomycin מניות פתרון, לפזר את התוכן של הנרתיק הזמין מסחרית ב 280 μL של המדיה המלאה. כדי להכין פתרון מניות 50 μM FCCP, לפזר את התוכן של הנרתיק הזמין מסחרית ב 288 μL של המדיה המלאה. כדי להכין 25 μM rotenone/antimycin פתרון מניות, לפזר את התוכן של הכיס הזמין מסחרית ב 216 μL של המדיה המלאה.
    2. קח את מחסנית חיישן בצלחת השירות מתוך החממה ולטעון את היציאות שלה (A, B, ו-C) כך שכל טוב יהיה ריכוז סופי של 2 μM oligomycin, 1.5 μM FCCP, ו 0.5 μM של rotenone/antimycin A לפי הצורך, בעקבות דילול מדדים המתוארים בטבלה 4 (עבור שיעור צריכת החמצן)
    3. הסר את המכסה מן המחסנית חיישן התאספו לוחית השירות ומניחים אותו על מגש המכשיר. הפעל את הכיול שייקח 20 דקות.
    4. לאחר הכיול, הסר את צלחת כלי השירות והחלף אותו בצלחת היישום המכילה תאי LSK, הנמצאים כעת בתחתית הבאר.
    5. לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית המתוארת בטבלה 2. לאחר סיום התוכנית, לאחזר את הנתונים ולנתח אותם באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave.
      הערה: הנתונים שנוצרו מתוך השטף מקבל מוסר ניתן להתוות באמצעות העלילה נקודה מתוכנת גל שולחן העבודה או מיוצא לתוכנית סטטיסטיקות מבוססות-אינטרנט.
  3. מבחן הדחק גליקוליזה
    1. מהווים גלוקוז ב 300 μL (100 mM), oligomycin ב 288 μL (50 μM), 2-D גלוקוז (2-DG) ב 300 μL (500 mM) של מדיה שלמה מתוך הנרתיק הזמין מסחרית.
    2. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה (~ 10x) כדי לפתרון התרכובות. מערבולת 2-DG בערך 1 דקות כדי להבטיח פירוק הנכון לתוך התקשורת.
    3. הסר את מחסנית החיישן מהאינקובטור. טעינת יציאות A עד C בעקבות דילול מדדים המתוארים בטבלה 5 כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"מ גלוקוז, 2 μm oligomycin, ו 50 mM 2-DG.
    4. חזור על שלבים ה3.2.3 וה3.2.4.
    5. לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית המתוארת בטבלה 3. לאחר סיום התוכנית, לאחזר את הנתונים ולנתח אותם באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטת החילוץ שלנו אפשרה לנו לקצור עד ~ 80,000 LSK HSPCs לכל עכבר. הכדאיות והמספרים של תאים LSK שופרו עם השיטה שלנו, כי אנחנו: (1) מח עצם משולב מגפיים העליון והתחתון, עצמות הירך, עצם החזה, צלעות כלוב, ועמוד השדרה, (2) נמנע באמצעות מאגר לפירוק התאים האדומים כי היה להגדיל את מוות התאים והשיא, ( השתמשו בצפיפות ההפרדה הבינונית של תאים מונו-נוקלאובטים, ו (4) נמנע באמצעות מאגר טרום מקורר שהיה גורם לאובדן תאים מעניינים במקבצים.

למרות ניתוח השטף מעמיק המשמש באופן מסורתי עבור תאים חסיד, השימוש שלנו ציפוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פעילות מטבולית נמוכה בסיס של Lsk hspcs26, iii) שבריאת lsk hspcs27, ו-IV) ללא הדבקות של lsk hspcs לכלי התרבות15. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.01% (w/v) תמיסת פולי-L-ליזיןSigmaP8920המשמשת לחיבור LSK
40 ומיקרו; מסננת תאים mפישר סיינטיפיק22-363-547משמש לסינון תאים לאחר ריסוק
אנטי ביוטין מיקרו-חרוזיםMiltenyi130-090-485משמש להפרדת פשתן
ביוטין חולדה נגד עכבר CD45R/B220 שיבוט RA3-6B2BD Biosciences553086משמש להפרדת פשתן
ביוטין חולדה נגד עכבר CD5 שיבוט 53-7.3BD Biosciences553019משמש עבור Lin- הפרדה
ביוטין חולדה נגד עכבר CD8a שיבוט 53-6.7BD Biosciences553029משמש להפרדת קו
ביוטין חולדה נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C שיבוט RB6-8C5BD Biosciences553125משמש להפרדת פשתן
ביוטין חולדה אנטי-עכבר TER-119/תאי אריתרואיד שיבוט TER-119BD Biosciences553672משמש להפרדת קו
CD117 (c-Kit) נוגדן חד-שבטי (2B8), APCeBioscience17-1171-83משמש למיון LSK
Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםFalcon-Fischer Scientific14-959-53Aמשמש בבידוד תאים
Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםFalcon-Fischer Scientific14-432-22משמש בבידוד תאים
Falcon צינורות פוליפרופילן תחתונים עגוליםFalcon-Fischer Scientific14-959-11Aמשמש עבור מיון LSK
Fetal Bovine SerumNeuromicsFBS001-HIמשמש במאגר FACS
Histopaque-1083Sigma10831משמש להפרדת שיפוע ficoll
L-glutamine 100xFisher Scientific25-030-081משמש למדיית הבדיקה
LS ColumnMiltenyi130-042-401משמש להפרדת קו
Ly-6A/E (Sca-1) חד-שבטי נוגדן (D7), PE-Cyanine7eBioscience25-5981-82משמש למיון LSK
גורם תאי גזע עכברי (SCF)PeproTech250-03-100UGמשמש למדיית הבדיקה
תרומבופויטין עכברי (TPO)PeproTech315-14-100UGמשמש למדיית הבדיקה
PBS 1%Fisher ScientificSH3002802משמש למאגר FACS
פניצילין-סטרפטומיצין ( 10,000 U/mL)Fisher Scientific15140122משמש למדיית הבדיקה
Propidium IodideFisher ScientificP1304MPהמשמש למיון LSK
סוסון ים XFp תרבית תאים MiniplateAgilent Technologies103025-100משמש לזריעת LSK
נתרן פירובט (100 מ"מ)ThermoFisher11360070משמש למדיית הבדיקה
Streptavidin eFluor 450 מצומדeBioscience48-4317-82משמש למיון LSK
XF CalibrantAgilent Technologies100840-000משמש לאיזון מחסניות
XF מדיהAgilent Technologies103575-100משמש לבדיקת המדיה
XFp Glycolysis ערכת בדיקת מאמץAgilent Technologies103017100תרופות לבדיקת מאמץ גליקוליזה
XFp מיטוכונדריה ערכת בדיקת מאמץAgilent Technologies103010100תרופות לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי
מחסנית חיישן XFpAgilent Technologies103022-100משמשת לגליקוליזה ובדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי
עצם

מקורות

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125(2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901(2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי אב המטופויטייםניתוח נשימה מטבוליתמדידת גליקוליזהניתוח שטף חוץ-תאיבידוד מחולל גרםמיון תאים מגנטיציטומטריית זרימהקצב צריכת חמצןקצב החמצצה חוץ-תאיבארות מצופות PLL
ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.