מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.
מבוא
כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה אושר על ידי הילדים ברחבי המדינה טיפול בבעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).
הערה: הפרוטוקול מתואר בסדר כרונולוגי המתפרס במשך יומיים. השתמש ריאגנטים טרי כפי שמתואר בפרוטוקול להלן.
1. הכנת ריאגנטים ביום שלפני השיטת הזמן
-
. מימה את מחסנית החיישנים
- דגירה 5 מ ל של הכייל (לוח חומרים) ב2 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך הלילה.
- פתח את ערכת שיטת השטף (טבלת חומרים) והפרד את מחסנית החיישן (ירוק; למעלה) מלוח כלי השירות (שקוף; למטה). הבא, למקם את מחסנית חיישן הפוך וצמוד לצלחת השירות.
- באמצעות מים סטריליים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטת החילוץ שלנו אפשרה לנו לקצור עד ~ 80,000 LSK HSPCs לכל עכבר. הכדאיות והמספרים של תאים LSK שופרו עם השיטה שלנו, כי אנחנו: (1) מח עצם משולב מגפיים העליון והתחתון, עצמות הירך, עצם החזה, צלעות כלוב, ועמוד השדרה, (2) נמנע באמצעות מאגר לפירוק התאים האדומים כי היה להגדיל את מוות התאים והשיא, ( השתמשו בצפיפות ההפרדה הבינונית של תאים מונו-נוקלאובטים, ו (4) נמנע באמצעות מאגר טרום מקורר שהיה גורם לאובדן תאים מעניינים במקבצים.
למרות ניתוח השטף מעמיק המשמש באופן מסורתי עבור תאים חסיד, השימוש שלנו ציפוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פעילות מטבולית נמוכה בסיס של Lsk hspcs26, iii) שבריאת lsk hspcs27, ו-IV) ללא הדבקות של lsk hspcs לכלי התרבות15. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.01% (w/v) תמיסת פולי-L-ליזין | Sigma | P8920 | המשמשת לחיבור LSK |
| 40 ומיקרו; מסננת תאים m | פישר סיינטיפיק | 22-363-547 | משמש לסינון תאים לאחר ריסוק |
| אנטי ביוטין מיקרו-חרוזים | Miltenyi | 130-090-485 | משמש להפרדת פשתן |
| ביוטין חולדה נגד עכבר CD45R/B220 שיבוט RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | משמש להפרדת פשתן |
| ביוטין חולדה נגד עכבר CD5 שיבוט 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | משמש עבור Lin- הפרדה |
| ביוטין חולדה נגד עכבר CD8a שיבוט 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | משמש להפרדת קו |
| ביוטין חולדה נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C שיבוט RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | משמש להפרדת פשתן |
| ביוטין חולדה אנטי-עכבר TER-119/תאי אריתרואיד שיבוט TER-119 | BD Biosciences | 553672 | משמש להפרדת קו |
| CD117 (c-Kit) נוגדן חד-שבטי (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | משמש למיון LSK |
| Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | משמש בבידוד תאים |
| Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | משמש בבידוד תאים |
| Falcon צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | משמש עבור מיון LSK |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | משמש במאגר FACS |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | משמש להפרדת שיפוע ficoll |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | משמש למדיית הבדיקה |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | משמש להפרדת קו |
| Ly-6A/E (Sca-1) חד-שבטי נוגדן (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | משמש למיון LSK |
| גורם תאי גזע עכברי (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | משמש למדיית הבדיקה |
| תרומבופויטין עכברי (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | משמש למדיית הבדיקה |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | משמש למאגר FACS |
| פניצילין-סטרפטומיצין ( 10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | משמש למדיית הבדיקה |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | המשמש למיון LSK |
| סוסון ים XFp תרבית תאים Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | משמש לזריעת LSK |
| נתרן פירובט (100 מ"מ) | ThermoFisher | 11360070 | משמש למדיית הבדיקה |
| Streptavidin eFluor 450 מצומד | eBioscience | 48-4317-82 | משמש למיון LSK |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | משמש לאיזון מחסניות |
| XF מדיה | Agilent Technologies | 103575-100 | משמש לבדיקת המדיה |
| XFp Glycolysis ערכת בדיקת מאמץ | Agilent Technologies | 103017100 | תרופות לבדיקת מאמץ גליקוליזה |
| XFp מיטוכונדריה ערכת בדיקת מאמץ | Agilent Technologies | 103010100 | תרופות לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי |
| מחסנית חיישן XFp | Agilent Technologies | 103022-100 | משמשת לגליקוליזה ובדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי |
מקורות
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
