מאמר שיטה

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

DOI:

10.3791/60266

⸱

3 באוקטובר 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotin הוא שינוי אטרקטיבי לאחר השינוי של חלבונים המספקת תג רב עוצמה עבור בידוד וזיהוי של חלבון. הביונילציה האנזימטית ע י החיידק הביוטין-ליאג-חלבון הוא מאוד ספציפי ומאפשר לביוטילציה של חלבונים מטרה בסביבתם הטבעית; עם זאת, השימוש הנוכחי של ביוקטילציה בירה מצריך נוכחות של פפטיד סינתטי (AP) בחלבון היעד. לכן, היישום שלו מוגבל לחלבונים שעברו הנדסה כדי להכיל את ה-AP. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להשתמש בתצוגה החיידקית של פפטיד שנגזר מחלבון מטרה שאינו שינה לבחור עבור משתני בירה שביוטיטים את הפפטיד. המערכת מבוססת על פלסמיד יחיד המאפשר ביטוי משותף של משתני בירה יחד עם פיגום לתצוגה פפטיד על פני החיידקים. הפרוטוקול מתאר הליך מפורט לשילוב פפטיד היעד לפיגום התצוגה, יצירת ספריית בירה, מבחר משתני בירה פעילים ואפיון ראשוני של משתני בירה מבודדים. השיטה מספקת מערכת בחירה יעילה ביותר לבידוד של משתני בירה חדשניים, שניתן להשתמש בהם להתפתחות מכוונת נוספת של ביוטין-חלבון, אשר בbiotinylate אוחר יותר חלבון מקורי בפתרונות מורכבים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביוטילציה של חלבון יוצר תגית רבת עוצמה לבידוד ולגילוי האהדה שלו. ביוטילציה חלבון אנזימטית הוא שינוי מיוחד ביותר שלאחר השינוי באמצעות חלבון ביולוגי. ה- E. coli ביוטין-חלבון ליגאז בירה הוא מאוד ספציפי ומאוד biotinylates רק מספר מוגבל של חלבונים המתרחשים באופן טבעי על שאריות ליזין ספציפי1. היתרונות של הביוטילציה של הבירה מכוונים כיום על ידי החדרת חלבון היעד באמצעות ביוטין (AP) קטן מלאכותי של 15-חומצות אמינו ביולוגי-פפטיד, שהוא ביולוגי הביוטיליס2 ומאפשר את הספציפי וה יעיל בvivo ובביוטילציה על ידי ביטוי משותף או תוספת של בירה3,4,5. למרות vivo ו בירה מחוץ למבחנה ביוטין-חלבון לחות היא אסטרטגיה מושכת תיוג, היישום שלה מוגבל דגימות המכילות חלבונים AP-התמזגו. מטרת שיטה זו היא התפתחות של מוטציות חדשות של ביוטין-חלבון ליגסים, כי באופן סלקטיבי ביולוגי מקורי חלבונים שאינם שונו, ובכך להרחיב את מספר היישומים בהם ניתן להשתמש באסטרטגיית הביוטילציה האנזימטית.

פונקציית חלבון ניתן להתפתח באמצעות סיבובים איטרטיביים של מוטציה גן, בחירה, הגברה של משתני גנים עם הפונקציה הרצויה. אסטרטגיה בחירה חזקה ויעילה היא חיונית עבור האבולוציה המנותבת ו ביוטין-חלבון ליגאז הפעילות מסומנת בקלות בשל הכריכה חזקה בין ביוטין ו streptavidin ו הומויומנים שלה6. טכנולוגיית התצוגה phage לאפשר את הבחירה של phage המציגות פפטידים biotinylated7,8. מאז הגברה של phages מבודדים דורש זיהום של מארח בקטריאלי, עם זאת, בחירת phages עם streptavidin יוצר צוואר בקבוק כי איגוד האהדה הגבוהה של ביוטין לstreptavidin הוא כמעט בלתי הפיך תחת לא מודצות תנאים. כדי להבטיח את הכריכה ההפיכה של phages ביולוגית, השתמשו במונמאריק אבידינס עם זיקהנמוכה יותר,שהביאה לעשרה בעלי קיפול צנוע של 10%. פיתחנו לאחרונה שיטת תצוגה בקטריאלי לבידוד של משתני בירה החדשניים המבטלת את הצורך להתחמק ממטריצת הזיקה ובכך מסירה צוואר בקבוק ממערכות הבחירה הקודמות9. אכן, מערכת התצוגה החיידקית שלנו מאפשרת ל> 1, 000, 000-קיפול של שיבוטים פעילים בשלב בחירה יחיד9, ובכך לספק מערכת בחירה יעילה עבור האבולוציה מכוונת של משתני בירה הרומן.

מערכת התצוגה החיידקית שלנו מורכבת משני מרכיבים, בירה עם תג C-טרמינל 6xHis וחלבון הגרדום המאפשר להציג את המשטח של פפטיד מטרה. השתמשנו בחלבון הפיגום מעגלי משופרת מעגליות חלבון ממברנה החיצוני X (eCPX) מאז התצוגה האפקטיבית של פפטידים ניתן לצפות הן N-ו-C-termini10,11. המיזוג של רצף פפטיד היעד ל C-הטרמינוס של eCPX מבטיח ביוקטילציה של חיידקים המבטאים משתני בירה פעילים. החיידק מאפשר בחירה streptavidin אפקטיבית כמו פפטיד ביולוגי מוצג כעת על פני השטח (איור 1א).

מטרת שיטה זו היא לבחור לגרסאות החדשניים של בירה כי רצפי פפטיד biotinylates קיימים בחלבונים יליד. המערכת מוצפנת על ידי הגנים הנמצאים על pBAD-בירה-eCPX-AP, אשר מכיל את השליטה arabinose-inducible יזם שליטה בירה (araBAD), ומקדם T7 השליטה eCPX9 (איור 1b). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליך המפורט 1) התאגדות של פפטיד שנגזר חלבון היעד לתוך C-מסוף של eCPX, 2) יצירה של ספריית משנה של בירה על ידי נטייה לשגיאות PCR, 3) מבחר של חיידקים streptavidin-binding על ידי מיון תא מגנטי מופעל (מקינטוש), 4) קוונפיקציה של חיידקים העשרה, ו 5) האפיון הראשוני של שיבוטים מבודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. החדרת רצף פפטיד קידוד בתוך pBAD בירה-eCPX-AP

הערה: כדי לבחור עבור משתני בירה כי biotinylate איחור חלבון מטרה מקורית, להתחיל על ידי זיהוי רצף פפטיד 15-אמינו ברצף החלבונים העיקרי המכיל לפחות אחד ליזין (K) שאריות.

  1. . לך לסוויטה מניפולציה12
  2. מדביקים את הרצף המזוהה 15 חומצת אמינו לתוך תיבת הקלט בפורמט FASTA ולחץ על Submit.
  3. לבחור ולהעתיק את התרגום 45 לאחור נוקלאוטיד של רצף פפטיד.
  4. הורד את קובץ GenBank עבור pBAD-בירה-eCPX-AP מ http://n2t.net/addgene:121907.
  5. טען את הקובץ בעורך פלסמיד (למשל, ApE) ובחלון התכונה בחר ברצף AP שצוין "AviTag (TM)".
  6. לחץ לחיצה ימנית על רצף AP המסומן בחלון רצף ה-DNA ובחר בהדבק Rev-Com בתפריט הקשרי.
    הערה: רצף הקידוד של eCPX נמצא בכיוון ההפוך, ורצף הקידוד הפפטיד צריך, לכן, להיות מודבק כהשלמה הפוכה.
  7. לחצו לחיצה ימנית על הרצף המסומן ובחרו ' תכונה חדשה'.
  8. הוסף שם תיאורי של הרצף המוסף והקש על אישור.
  9. בחרו ' שמור בשם ' בתפריט הקובץ כדי לשמור את הקובץ שהשתנה.
  10. עיצוב ההילוך הקדמי כדי לכלול את 30 נוקלאוטידים האחרון של ההשלמה הפוכה של רצף הקידוד פפטיד ולהוסיף את הרצף של כריכת הקשירה של הפלסטיק (3 '-GCGGCCGGC-5 ') לקצה שלה 5.
  11. עיצוב הפוך לאחור כדי לכלול את 30 הנוקלאוטידים הראשונים של ההשלמה הפוכה של רצף הקידוד פפטיד ולהוסיף את רצף הקשירה של הכריכה הפלאסיים (3 '-CTTAAGTAATAACGTTTAC, 5 ') לקצה שלה 5 '.
  12. הגדר 20 μL PCR בצינור PCR דק-חומה על-ידי הוספת הריאגנטים הרשום בטבלה 1.
  13. העבר את הצינור לציקלייר תרמי ובצע את ה-PCR באמצעות תוכנית עם הרפתקאות ראשוניות ב-98 ° c עבור 30, 30 מחזורים של [15 s ב-98 ° צ', 15 s ב-60 ° c ו-3 דקות בשעה 72 ° c, הארכה סופית עבור 2 דקות ב-72 ° c ומחזיקה ב -4 ° c.
  14. הפעל 5 μL של תגובת ה-PCR ב-1% agarose ג'ל כדי לאשר את הגברה של מוצר מתוצרת PCR 6 kb.
    הערה: אם לא נצפתה מוצר PCR, מטב את תנאי ה-PCR לפי הוראות היצרן. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  15. הוסף 1 μL של DpnI לתגובת ה-PCR ו-הדגירה עבור 1 h ב 37 ° צ'
  16. הפוך את E. coli מוסמך עם 2 Μl של DpnI תגובה מתעכל PCR ואת הצלחת על ציר ליבסוגניים (LB)/amp לוחות. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
  17. מחסן ליברות 5 מ"ל המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם מושבה אחת. דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול ב 200 סל ד.
    הערה: מומלץ לבדוק לפחות 6 מושבות.
  18. הפוך את מלאי ההקפאה של 850 μL של כל תרבות לילה על ידי הוספת גליצרול לריכוז סופי של 15% לתרבות. חנות ב-80 ° c.
  19. לחלץ את ה-DNA הפלסטיות מן הנותרים 4 התרבות mL על ידי להכין מיני DNA ערכת החילוץ.
  20. לאשר את ההכנסה הנכונה של רצף הקידוד פפטיד על-ידי רצפי DNA באמצעות T7 מסוף פריימר (GCTAGTTATTCGG).

2. יצירת ספריית בירה

הערה: ספריית הבירה הראשונית (איור 1ג, שלב 1) נוצרת על-ידי PCR הנוטה לשגיאות. שיטות נוספות להפקת ספריית בירה עשויות לפעול גם כן.

  1. לסנתז את המוטציות מגה-במרס עם בירה-6xHis שלו קדימה (ATGAAGGATAACACCGTPA) ולהפוך (הפוך את ההילוך האחורי) התחל באמצעות 1 ng-בירה-eCPX עם רצף פפטיד היעד (מוכן ואישר בשלב 1.20) כתבנית ו 35 PCR מחזורים בטמפרטורת הריפוי של 60 ° c על פי הוראת היצרן.
  2. הפעל 5 μL של תגובת הגברה על 1% agarose ג'ל כדי לאמת את הגברה של מוצר 984 bp PCR.
  3. לטהר את המוצר PCR מן הנותרים 45 μL של תגובת הגברה באמצעות ערכת הטיהור המסחרי PCR ולהשתמש ספקטרוסקופיה כדי לכמת את התשואה DNA.
    הערה: טיהור מתגובת הגברה אחת 45 μL בדרך כלל מייצרת תשואה מספיקה (> 250 ng).
  4. הכינו את תגובת המדגם בצינור PCR דק-חומה על ידי הוספת הריאגנטים הרשום בטבלה 2.
  5. העבר את תערובת התגובה לציקלייר תרמי והפעל את ה-PCR עם מגה-פיקסל מוטנטים שהוכנו בשלב 2.3 באמצעות הפרמטרים הבאים: 1 דקות ב-95 ° צ' ו -25 מחזורים של 50 s ב-95 ° c, 50 s ב-60 ° c ו-12 דקות ב-68 ° c. אחסן את התגובה ב -4 ° c.
  6. הוסף 1 μL של האנזים DpnI הגבלה ישירות על תגובת הגברה ולערבב בעדינות.
  7. לסובב את תערובת התגובה ואת הדגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
  8. המרה T7 Express lysY/Iq המוסמכת תאים E. coli עם 2 μl של תגובת DpnI.
  9. אינו100 mL ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם התאים שעברו שינוי ו-דגירה לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.
  10. הפוך את מניות המקפיא עם 10 מ ל של תרבות לילה ב LB עם 15% גליצרול וחנות ב-80 ° c.

3. מבחר של בקטריה ביטוי פפטיד ביולוגי

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מכסה. את שלב 2-5 של הספרה 1ג מומלץ מאוד כי גישת הבחירה היא ההתקנה באמצעות pBAD-בירה-eCPX-AP ו pBAD-בירה-eCPX-AP (K10A) כפקדים חיוביים ושליליים.

  1. איחסן 100 mL של LB המכיל 1% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין עם 1 מ ל של ספריית בירה ו הדגירה לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד.
  2. איחסן 5 mL של LB המכיל 1% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין עם 100 μL של התרבות הלילה.
  3. דגירה עבור 2 h ו 30 דקות עד התרבות מגיע OD600 של כ 0.5.
  4. לגרום ecpx וביטוי בירה עם 0.2% w/v L-arabinose, 100 μm איזופרופיל β-D-1-thioגלאוסייד (iptg) ו 100 μm ביוטין ולנער את התרבות בשעה 200 rpm עבור 1 h ב 37 ° c.
  5. צנטריפוגה את התרבות עבור 10 דקות ב 5,000 x g ולהסיר את הסופרנטאנט.
  6. להשעות מחדש את התאים 1 מ ל של הקרח קר PBS ו צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 5 דקות.
  7. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-400 μL של ה-PBS קר הקרח ומאחסנים תאים על הקרח.
  8. הסר 10 μL של תאים מושעה ולאחסן על הקרח בצינור 1.5 mL המסומנים "קלט".
  9. לשטוף 20 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin ב 1 מ ל של הקרח קר PBS ומניחים את הצינור בתוך מפריד חלקיקים מגנטי הספסל לפני הסרת בזהירות את supernatant.
  10. השהה מחדש את החרוזים streptavidin מגנטי ב 20 μL של הקרח קר PBS ולהעביר ל-390 μL של תאים מושעה משלב 3.8.
  11. לערבב על ידי ליטוף בעדינות ולאחר מכן הדגירה עבור 30 דקות ב 4 ° c.
    הערה: לא מערבולת כי זה עשוי להיות לאחר התאים. מצבור חרוזים לעתים קרובות נצפה עם שפע גבוה של חיידקים המציגים פפטיד biotinylated.
  12. הצב טור עם כדורים פרומגנטיים במפריד חלקיקים מגנטי ושטוף עם 5 מ ל של PBS קר הקרח.
  13. העבר תאים וחרוזי streptavidin מגנטיים לעמודה המצורפת במפריד.
  14. לאחר שמאגר העמודות ריק, הוסף 500 μL של PBS קר קרח וחזור על כך עד שהעמודה נשטפה בנפח כולל של 5 מ ל של PBS קר הקרח.
  15. הסר את העמודה מהמפריד והציבו אותה בשפופרת 1.5 mL.
  16. פיפטה 1 מ ל של ה-PBS הקר הקרח על הטור ומעלה את התאים המתויגים על ידי החלת הבוכנה שסופקה עם הטור.
  17. העבר את שפופרת 1.5 mL למפריד ספסל העליון ולשטוף את התא בתווית מגנטוסטי עם 1 מ ל של הקרח קר PBS.
  18. השהה מחדש בעדינות את התאים המתויגים בתווית 1 מ ל של ה-PBS הקר לפני הסרה ואחסון של 10 μL של ההשעיה בצינור 1.5 mL המסומן "פלט".
  19. האיחסן 100 mL של LB המכיל 1% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין עם התאים מגנזיום התווית ו הדגירה לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.
  20. למחרת, השתמש 10 מ ל של התרבות לילה לעשות מניות המקפיא עם תאים LB עם 15% גליצרול ולאחסן ב-80 ° c ו 1 מ ל של התרבות לילה לסיבוב הבא של הבחירה, כלומר, צעד 3.2.
    הערה: באופן כללי, 3-5 סיבובים של בחירה מומלצים להעשרה של חיידקים מחייבים streptavidin.

4. כימות העשרה

הערה: בדיקת קוונפיקציה של החיידק החי בדגימות "קלט" ו "פלט" מתבצעות לאחר כל בחירה על ידי הציפוי של מדלל סדרתי של דגימות וספירה של המושבה ביחידות היוצרים (CFUs).

  1. הוסף 990 μL ice-קר PBS לקלט (משלב 3.8) ופלט (משלב 3.18) דגימות ותווית את הצינורות "קלט 10-2" ו "פלט 10-2", בהתאמה.
  2. הפוך לדילול טורי של 10 מקפלים של "קלט 10-2" ו-"פלט 10-2" דגימות ב-PBS קר קרח עד הדקה הסופית של 10-10 הגיע לדגימת הקלט ו-10-4 במדגם הפלט.
  3. צלחת 100 μL של דגימות מתוך "קלט10-6", "קלט10-8", "קלט 10-10", "פלט 10-2", "פלט 10-3" ו "פלט 10-4" על LB/Amp לוחות ו-דגירה הלילה ב 37 ° c.
  4. לספור את מספר מושבות על לוחיות עם מושבות מופרדים בבירור. הכפל את ספירת המושבה עם גורם הדילול כדי להשיג את ספירת הריכוז חיידקי/100 μL.
  5. חשב את ספירת החיידקים הכוללת בדגימות הקלט והפלט על-ידי הכפלת הריכוז של התא עם הקלט (400 μL) ועוצמת הפלט (1 mL), בהתאמה והערכת העשרה על-ידי חלוקת הפלט בספירת תאי קלט.
    הערה: יש לראות העשרה משמעותית לאחר 3-5 סיבובים של בחירה

5. אפיון משתנה בירה נבחר

הערה: ניתן לבצע את האפיון לאחר בחירת משתני בירה מספריית הבירה הראשונה; עם זאת, למשתני בירה יש בדרך כלל פעילות נמוכה כלפי הפפטיד. לכן ניתן לבצע סבב נוסף של מוטציה ובחירה לפני האפיון. בדרך כלל, 10 שיבוטים מסיבוב הבחירה הסופי מבודדים לאפיון נוסף.

  1. מחסן 5 מ"ל ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם שיבוטים שנבחרו מסיבוב הבחירה הסופי. בנוסף, החיסונים 5 mL ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם T7 Express lysY/Iq E. coli השתנה עם pbad-בירה-ECPX-AP, אשר ישמשו כפקד חיובי עבור הכתם המערבי המתואר להלן.
  2. דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול ב 200 סל ד.
  3. הפוך את מלאי ההקפאה של 850 μL של כל תרבות לילה על ידי הוספת גליצרול לריכוז סופי של 15% לתרבות. חנות ב-80 ° c.
  4. מחסן 5 מ ל ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם 100 μL של תרבות לילה ו דגירה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 2 h.
  5. לחלץ את ה-DNA הפלסטיות מן הנותרים 4 התרבות mL על ידי ערכת מיני הכנה מסחרית DNA. לבצע את רצף ה-DNA הכיוונים קדימה והפוך של משתני בירה עם pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) ו Ptrכיס rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) התחל.
  6. הוסף 0.2% w/v L-arabinose ו 100 μm iptg ו 100 μm ביוטין לתרבויות משלב 5.4 ולנער את התרבות ב-200 rpm עבור 1 h ב 37 ° צ' כדי לגרום לביטוי של ecpx ומשתני בירה.
  7. העברת 65 μL של התרבות כדי 1.5 צינורות mL המכיל 25 μL של מאגר טעינת לדוגמה ו 10 μL של הסוכן להפחתת.
  8. מודקון ב 95 ° c עבור 5 דקות.
  9. לטעון את המדגם (כולל את השליטה החיובית) על 12% SDS-polyacrylamide ג'ל יחד עם סמן גודל ולבצע אלקטרופורזה ג'ל ב 200 V עבור כ 45 דקות עד 20, 25 ו 37 kDa להקות רגיל מופרדים בבירור.
  10. שחררו את הג מתוך הקלטת והרכיבו את הכריך לגושי ג'ל על קרום PVDF.
  11. כרוב בשעה 35 וולט. ב -2 על הקרח
  12. הסר את קרום PVDF ואת הדגירה מאגר חסימה [PBS, 0.05% הרצף-20, 3% אבקת חלב רזה] עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם רעד.
  13. להכין את הפתרון biotin זיהוי על ידי דילול streptavidin-HRP 1:1000 ב PBST.
    הערה: המאגר החוסם מכיל ביוטין ולכן אין להשתמש בו כמאגר דילול עבור streptavidin-hrp.
  14. התעלם ממאגר החסימות, רחץ את הממברנה במהירות ב-PBST [PBS, 0.05% רצף-20] והוסף את פתרון הזיהוי הביוטין. מיכל החום בטמפרטורה של 1. בחדר עם רעידות
  15. מחק את הפתרון biotin לזיהוי ולשטוף את הקרום ביסודיות PBST עבור 5 דקות פעמיים ו 10 דקות פעם אחת עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
  16. להיפטר PBST, להוסיף מיקס ל 2 מ"ל ו-מודטה עבור 1 דקות עם טלטול.
  17. מייבשים את הקרום במהירות על נייר טישו ומפתחים את התמונה על סרט רנטגן או במערכת הדמיה של ג'ל דיגיטלי.
    הערה: בנתיב טעון עם השליטה החיובית, שתי להקות streptavidin-התגובה ברורים צריך להיות גלוי בבירור: a 30 kDa biotinylated באופן מובהק חלבון ו-~ 22 kDa eCXP-AP להקה. אם 10 המושבות שנבחרו יכול biotinylate סוף את הפפטיד המוצג, להקה ב ~ 22 kDa צריך להיות גלוי. העוצמה של להקות אלה נמוכה בדרך כלל מאשר השליטה החיובית, ולכן עשויה לדרוש זמני חשיפה ארוכים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכתם המערבי של pBAD-בירה-eCPX-AP להביע חיידקים מייצרת ~ 22 kDa streptavidin-הלהקה הגיבה בעקביות עם המשקל המולקולרי של eCPX (איור 2א). בניגוד לבירה-6xHis, eCPX ביולוגית-AP היה נוכח בתרבויות שאינן המושרה והמושרה (איור 2א) בשל מידה קטנה של פעילות T7 יזם גם בתרבויות שאינן מושרה וביוטילציה הבאים של AP על ידי אנדוגני בירה. ב בירה-eCPX-AP (K10A) המבטא תרבויות, לא זוהה להקה eCPX ביולוגית (איור 2א

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באשר לכל שיטות הבחירה, החשיבות הרבה ביותר היא לשטוף את צעדי הכביסה. מאז חיידקים לא צריך להיות חומק מן החרוזים לפני הגברה של שיבוטים שנבחרו, כריכת זיקה גבוהה בין ביוטין ו streptavidin יכול לשמש במקום באמצעות avidins אהדה נמוכה, כפי שנעשה בעבר עם מערכת התצוגה phage, עבור מבחר משתני בירה7,8. הדבר מבטיח כי נבחרו שיבוטים נדירים וכי חיידקים שאינם biotinylated נמחקים. יתרון נוסף של שימוש בתצוגה בקטריאלי, לעומת התצוגה phage, הוא כי התצוגה החיידקית היא כמותית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למוחמד ליוהי אחמד על הסיוע של טכנאי מומחה. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מקרן לוננבק, קרן נובו נורדיסק, אגודת הכליות הדנית, קרן הכליה והDanielsen, הקרן לקידום מדעי הרפואה וקנוד ואדית אריקסן . קרן הזיכרון

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% ג'ל פוליאקרילאמיד טרומיBio-Rad4561033
AmpicilinSigma-AldrichA1593
ApE - עורך פלסמיד v2.0NANAהורד מ-http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BiotinSigma-AldrichB4501
DMSOSigma-AldrichD2650
DPBS (10x), ללא סידן, ללא מגנזיוםאנזים הגבלה ThermoFischer Scientific14200083
DpnIניו אינגלנד BioLabsR0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFischer Scientific65001
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-AldrichPLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kitAgilent Technologies200552
גלוקוזSigma-AldrichG8270
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
Immobilon-P PVDF ממברנהMilliporeIPVH15150
IPTGSigma-AldrichI6758
LS עמודותMiltenyi Biotec130-042-401
NaClSigma-AldrichS7653
NEB 5-alpha מוכשר E. coliNew England BioLabsC2987
NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)ThermoFischer ScientificNP0007
NuPAGE חומר להפחתת דגימה (10x)ThermoFischer ScientificNP0009
pBAD-BirA-eCPX-APAddgene121907השתמש בתבנית ובבקרה חיובית
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)Addgene121908בקרה שלילית
Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוההניו אינגלנד BioLabsM0491להחדרת רצף פפטידים ב-pBAD-BirA-eCPX-AP, כל פולימראז בנאמנות גבוהה יעשה
מפריד QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
חלב רזה אבקתסיגמא-אולדריץ'70166
Streptavidin-HRPAgilent TechnologiesP0397
T7 Express lysY/Iq Qualified E. coliNew England BioLabsC3013
TryptoneMilliporeT9410
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Western Lightning Plus-ECLתמצית שמרים PerkinElmerNEL103001EA
סיגמא-אולדריץ'Y1625

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
  2. Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  3. de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
  4. Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
  5. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  6. Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
  7. Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
  8. Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
  9. Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118(2019).
  10. Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
  11. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
  12. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BirAPCRWestern Blot

מאמרים קשורים