מאמר שיטה

מעקב אחר תמציות ביומיסקופיה באמצעות מיקרוסקופ Confocal וקדי

DOI:

10.3791/60270

⸱

30 בינואר 2020

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר את הטיפוח של ממלכת הבין-מלכות המורכבת מקנדידה מיקרובינים ו סטרפטוקוקוס ומציג שיטה מבוססת-מיקרוסקופ מבוסס על הניטור של pH מואנים בתוך הביואמים האלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בין הממלכה ביואמים המורכבת הן בתאי פטרייתי בקטריאלי מעורבים במגוון של מחלות הפה, כגון זיהומים אנדודונטיים, חניכיים, זיהומים רירית, בעיקר, עששת הילדות המוקדמת. בכל התנאים הללו, ה-pH במטריקס משפיע על אינטראקציות מארחות בחיידק ולכן התקדמות המחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מבוססת על מיקרוסקופיה לניטור הדינמיקה של ה-pH בתוך ביויואמים של הממלכה הכוללת את הקנדידה ו סטרפטוקוקוס. הספקטרום של פליטת הפליטה הכפולה והתכונות המכתימה של בדיקת הטימטרי C-נהם-4 מנוצלים כדי לקבוע טיפות ב-pH באזורים של מסחטות של הביואמים. השימוש ב-pH טימטריה עם הגשוש דורש בחירה מדוקדקת של פרמטרי דימות, כיול יסודי של הצבע, וזהיר, מבוסס הסף על עיבוד הנתונים של התמונה. כאשר נעשה שימוש נכון, הטכניקה מאפשרת הערכה מהירה של pH החילוץ באזורים שונים של ביוilm, ובכך את הניטור של שני מעברי pH אופקי ואנכי לאורך זמן. בעוד שהשימוש במיקרוסקופיה מגבילה את ה-Z-פרופיל ל ביויואמים דקים של 75 יקרומטר או פחות, השימוש ב-pH מטימטריה מתאים באופן אידיאלי למחקר לא פולשני של גורם התקפה אלימה חשובה בתוך ביוילאמים חוצי הממלכה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביומדי הממלכה, המורכב הן ממינים פטרייתיים וחיידקיים, מעורבים במצבים פתולוגיים בחלל הפה. קנדידה spp לעתים קרובות מבודדים זיהומים אנדודונטיים1 ומפני נגעים חניכיים2,3. בזיהומים רירית, מינים streptococcal מהקבוצה mitis הוכחו לשפר את היווצרות ביופלורין, הפלישה רקמות, והפצת הן בתוך מודלים מחוץ לארץ מורנין4,5,6,7. מעניין ביותר, מנשא אוראלי של קנדידה spp הוכח להיות משויך לשכיחות של עששת אצל ילדים8. כפי שמוצג במודלים של מכרסמים, קשר סימביוטי בין מוגני סטרפטוקוקוס ו קנביאנים אלביקנס מגביר את הייצור של פוליסכפידים של מסחטות ומוביל להיווצרות של ביואמים עבים יותר ויותר9,10.

בכל התנאים שהוזכרו לעיל, העששת המוקדמת בפרט, ה-pH של הביוilm הוא בעל חשיבות להתקדמות המחלה, והתפקיד הנודע של מטריצת הביוilm לפיתוח מיקרויוגניים11 שיחות למתודולוגיות המאפשרות לימוד שינויי pH בתוך ביואמים של הממלכה הצולבת. מיקרוסקופיה פשוטה ומדויקת גישות מבוססות לנטר pH בתוך חיידקי12 ו פטרייתי13 ביואילאמים פותחו. עם לצבוע את הצבע C-נהם-4 ואת הסף מבוסס התמונה לאחר העיבוד, ה-pH החילוץ יכול להיקבע בזמן אמת בכל שלושת הממדים של ביוilm14. לעומת טכניקות אחרות שפורסמו בניטור pH-מבוססי מיקרוסקופ ב-ביואמים, pH מטימטריה עם C-סנף-4 הוא פשוט וזול, כי זה לא דורש סינתזה של חלקיקים או תרכובות הכוללות צבע התייחסות15 או שימוש בשני הפוטון עירור16. השימוש בצבע אחד בלבד מונע בעיות עם מידור בדיקה, פלורסנט בכיוון, ו הלבנה סלקטיבית16,17,18 תוך שהוא עדיין מאפשר בידול אמין בין הפנים והחילוץ pH. בסופו של דבר, הדגירה עם הצבע מבוצעת לאחר הצמיחה של ביוilm, אשר מאפשר ללמוד הן מעבדה והן בתוך מקומיים מגודלים ביואמים.

מטרת העבודה הנוכחית היא להאריך את השימוש ב-pH מטימטריה ולספק שיטה ללימוד שינויי חומציות בביואמים מהממלכה. כהוכחה למושג, השיטה משמשת לניטור pH ב-ביואמים של מינים כפולים, המורכב מ -S. מיונים ו-C. אלביקנס חשופים גלוקוז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול לאיסוף הרוק נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של מחוז ארהוס (M-20100032).

1. טיפוח ביוגידים של הממלכה הצולבת

  1. הגדל את ה- DSM 20523 ו -C. אלביקנס ncpf 3179 על לוחות דם אגר ב 37 ° c בתנאים אירוביים.
  2. העברת מושבות יחיד של כל אורגניזם כדי לבדוק את הצינורות מלאים 5 מ ל של המוח עירוי של הלב (BHI). לגדול 18 h בתנאים אירוביים ב 37 ° c.
  3. צנטריפוגה את התרבויות לילה ב 1,200 x g עבור 5 דקות. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים מלוחים פיסיולוגיים ולהתאים את OD550 nm כדי 0.5 עבור C. אלביקנס (~ 107 תאים/ml) ו- S. מוסטנים (~ 108 תאים/ml). לדלל את ה-S. מ1:10 ההשעיה עם תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי (~ 107 תאים/mL).
  4. פיפטה 50 μL של פתרון הרוק סטרילי, מוכן על פי השיטה של דה ג'ונג et al.19, לתוך הבארות של תחתון אופטי 96-צלחת מיקרוסקופ. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c. לשטוף את הבארות 3x עם 100 μL של תמיסת מלח פיסיולוגית סטרילית. . רוקן את הבארות
  5. הוסף 100 μl של C. אלביקנס השעיית כל טוב. מודקון ב 37 ° c עבור 90 דקות. לשטוף את 3x עם תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי.
    הערה: אל תרוקן את הבארות לחלוטין במהלך הכביסה. להשאיר מאגר של 20 μL כדי למנוע כוחות הטיה מוגזמת.
  6. הוסף 100 μL של סרום בלתי מופעל חום של שור העוברי (לא מופעל ב 56 ° צ' עבור 30 דקות) לכל טוב. מודטה ב 37 ° c עבור 2 כ. לשטוף את 3x עם תמיסת מלח פיזיולוגי סטרילי. לרוקן את הבארות, להשאיר מאגר של 20 μL.
  7. הוסף 100 μL של ההשעיה של S. מוסטנים (מוכן בשלב 1.3) לכל באר. הוסף 150 μL של BHI המכיל 5% סוכרוז. מודטה ב 37 ° c למשך 24 שעות או יותר. כאשר מטפחים ביואילאמים ישנים יותר, שנו את המדיום מדי יום ל-BHI טרי. בסוף שלב הצמיחה של הממלכה הצולבת, שטוף 5x עם תמיסת מלח פיסיולוגית סטרילית.

2. שטימטרי pH הדמיה

הערה: יש לבצע הדמיה ממוחשבת באופן מיידי לאחר השלמת הגידול ביומטרי.

  1. עבור הדמיה pH טימטרי, השתמש במיקרוסקופ הפוך לייזר סריקת מיקרוסקופ עם השמן 63 x או טבילה המים עדשה, קו 543 ננומטר לייזר, ו מערכת הדמיה ספקטרלית (כלומר, META גלאי) כדי לאפשר הדמיה של אותות פלורסנט חופפים. השתמש באינקובטור כדי לחמם את שלב המיקרוסקופ עד 35 ° c.
  2. הגדר את הגלאי כדי להבטיח זיהוי של זריחה ירוקה מ 576 ל608 ננומטר וזיהוי סימולטני של קרינה פלואורסצנטית אדומה מ 629-661 nm. לבחור כוח לייזר מתאים ולהשיג כדי למנוע חשיפה מעל ומחסור.
    הערה: חשיפת התמונות היא הטובה ביותר לראות תמונות לוח עם צביעה שווא.
  3. הגדר את גודל הנקב ל-1 יחידה אוורירית או פרוסה אופטית של ~ 0.8 μm. הגדר את גודל התמונה ל-512 x 512 פיקסלים ומהירות הסריקה ל-2. בחר קו ממוצע של 2, באמצעות האפשרות ממוצע.
    הערה: בתחילת סדרה של ניסויים, בדוק כי הגדרות המיקרוסקופ שנבחרו מספק ניגוד ברור בין תאים חיידקיים, קירות תא פטרייתי, מטריצת ביוilm, ו ציטופלסמה פטרייתי.
  4. הכינו 100 μl של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית המכילה 0.4% (w/v) של גלוקוז, טיטרציה ל-pH 7. הכינו פתרון מניות של C-סנף -4 (1 מ"מ בדימתיל סולפוקסיד). להוסיף את הצבע לריכוז הסופי של 30 μM.
    התראה: לבשו כפפות ניטריל כשאתם מטפלים בצבע הטימטרי.
  5. לרוקן את אחת הבארות עם ביובין הממלכה, להשאיר מאגר של 20 μL. להוסיף את תמיסת מלח סטרילי המכיל גלוקוז ואת הצבע הטימטרי. מניחים את הצלחת 96-ובכן על מיקרוסקופ ולהתחיל הדמיה של הבין-ביוilm.
  6. השגת תמונות בודדות או מחסניות Z במיקומים שונים של הביוilm. סמן את מיקום ה-X-Y בתוכנת המיקרוסקופ כדי לעקוב אחר שינויי pH בשדות מסוימים של תצוגה לאורך זמן. במרווחי זמן קבועים, קח תמונות עם הלייזר כבוי כדי לתקן את היסט הגלאי.
  7. חזור על שלבים 2.4 – 2.6 לניתוח של כל ביו, גדל בבאר אחרת.

3. כיול של הצבע הטימטרי

הערה: כיול הצבע וההתאמה של עקומת כיול ניתן לבצע ביום שונה מאשר הדמיה ממוחשבת.

  1. הכינו סדרה של מאגר חומצה באורך של 50 מ"מ 2 (MES) ל-pH 4.0-7.8 בשלבים של 0.2 יחידות pH ב 35 ° c. פיפטה 150 μL של כל פתרון מאגר לתוך הבארות של הלוח האופטי התחתון 96-באר למיקרוסקופיה.
  2. להוסיף את הצבע על הבארות מלא מאגר של 96-ובכן צלחת לריכוז הסופי של 30 μM. . בסדר.
  3. חמם את מיקרוסקופ הבמה עד 35 ° c. לבחור את הגדרות המיקרוסקופ אותו כמו עבור הדמיה מטימטרית pH. מניחים את הצלחת 96-טוב על הבמה המיקרוסקופ. . תתמקד בתחתית הבארות לרכוש שתי תמונות (ערוץ ירוק ואדום) עבור כל פתרונות המאגר, 5 יקרומטר מעל החלק התחתון של הבאר. במרווחי זמן קבועים, קח תמונות עם הלייזר כבוי כדי לתקן את היסט הגלאי.
  4. בצע את ניסוי הכיול בטרילקאט.
  5. ייצוא כל התמונות כקבצי TIF. יבא אותם לתוכנת ניתוח תמונה ייעודית (כלומר, ImageJ20). הפחת את התמונות שצולמו עם הלייזר כבוי מהתמונות המתאימות של פתרונות המאגר על-ידי לחיצה על תהליך | מחשבון תמונה | חיסור).
    הערה: במקרה הצורך, חתוך את התמונות כדי לסלק פריטים בגבולות התמונה על-ידי ביצוע בחירה מלבנית באמצעות התמונה | חיתוך.
  6. חלק את התמונות ערוץ ירוק דרך תמונות ערוץ אדום ולחשב את עוצמות הזריחה הממוצעת בתמונות שנוצרו על ידי לחיצה על לנתח | היסטוגרמה.
  7. מתוך ניסויים בטרילקאט, יש להתוות את היחס הממוצע הירוק/אדום נגד ה-pH. השתמש בתוכנה ייעודית כדי להתאים פונקציה לנתוני הכיול (כלומר, MyCurveFit).

4. ניתוח תמונה דיגיטלית

הערה: ניתן לבצע ניתוח תמונה דיגיטלי בכל זמן שהוא לאחר כיול של הדמיה ממוחשבת לצבען ולהדמיית pH.

  1. אחסן את התמונות של הערוץ הירוק והאדום בתיקיות נפרדות ושנה את שמם של סדרות קבצים עם מספרים רציפים (לדוגמה, GREEN_0001). יבא את התמונות לתוך תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (כלומר, ImageJ). לחץ על נתח | היסטוגרמה כדי לקבוע את עוצמת הזריחה הממוצעת בתמונות שצולמו באמצעות הלייזר ולהחסיר את הערך מתמונות הביוilm על-ידי לחיצה על תהליך | מתמטיקה | חיסור.
  2. יבא את שתי סדרות התמונות לתוכנה ייעודית לניתוח תמונה (כלומר, בדייני21). ביצוע פילוח מבוסס הסף של תמונות הערוץ האדום (קטע | פילוח אוטומטי | מסף מותאם אישית). הגדר את סף ' נמוך ' מעל העוצמה הפלואורסצנטית של הציטופלסמה פטרייתי ואת סף ' גבוה ' מתחת לאינטנסיביות של קירות התא פטרייתי ואת החיידקים.
    הערה: בעת בחירת גדלי סף מתאימים, רק אזורים מוכוללים מזוהים כאובייקטים.
  3. העבר את שכבת האובייקט של סידרת התמונות המקוטרת לסדרת התמונות של הערוץ הירוק. לשם כך, לחץ על פלח | העברת שכבת אובייקט.
    הערה: אם הניגוד בין אזורים המוחלשים והציטופלסמה פטרייתי חלש מדי בערוצי הצבע הבודדים, הוסף את סדרת התמונות של הערוץ הירוק לסדרת הערוצים האדומים לפני פילוח על-ידי לחיצה על Edit | מחשבון תמונה | נוסף. בצעו את הפילוח כמתואר תחת 4.2 והעבירו את שכבת האובייקט של סדרת התמונות המקודמות לסדרת התמונות הירוקה והערוץ האדום.
  4. השתמש בעורך האובייקטים כדי למחוק פיקסלים שאינם אובייקטים בסדרת התמונות של הערוץ האדום והירוק (מנרמל | עורך האובייקטים | בכל התמונות | מחק פיקסלים שאינם אובייקטים). התמונה מנוקה מתאים. בקטריאליים ופטרייתיים יצא את סדרת התמונות המעובדות כקובצי TIF.
  5. יבא את שתי סדרות התמונות ל-ImageJ. ImageJ מקצה עוצמה של 0 לכל הפיקסלים שאינם אובייקטים. הסר את הפיקסלים האלה על-ידי חלוקת סדרת התמונות האדומות (R1) בפני עצמה (תהליך | מחשבון תמונה | תמונה 1: R1; פעולה: חילוק; תמונה 2: R1) והכפלת סדרת התמונה הנוצרת (R2) עם סדרת התמונה האדומה המקורית (תהליך | מחשבון תמונה | תמונה 1: R1; פעולה: כפל; תמונה 2: R2). סדרת תמונה שלישית (R3) נוצר, זהה R1, למעט העובדה כי נאן מוקצה כל הפיקסלים עם עוצמה של 0 R1. המשך באותו אופן עם סדרת התמונות הירוקות.
  6. השתמש במסנן ' ממוצע ' (תהליך | מסננים | אומר | רדיוס | 1 פיקסל) בסדרת תמונות הערוץ האדום והירוק כדי לפצות על רעש הגלאי. חלק את סדרת תמונות הערוץ הירוק באמצעות סדרת תמונות ערוץ אדום (תהליך | מחשבון תמונה | תמונה 1: G3; פעולה: חילוק; תמונה 2: R3). סדרת התמונות שתיווצר (G3/R3) מציגה את היחס הירוק/אדום עבור כל הפיקסלים באובייקט.
  7. חישוב היחס הממוצע לכל תמונה (לנתח | היסטוגרמה). החלת צביעה שקרית לייצוג ויזואלי טוב יותר של היחס בתמונות (תמונה | טבלאות בדיקת מידאות). המר את היחס הירוק/אדום לערכי pH המעסיקים את הפונקציה הותאמה תחת 3.6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר 24 h ו 48 h, ביוציאמים עמידים בפני הממלכה התפתחו בצלחות הבאר. C. אלביקנס הראה דרגות שונות של צמיחה filamentous, ו S. מוסטנים יצרו אשכולות צפופים של עד 35 יקרומטר בגובה. תאים בודדים ושרשראות של S. מוסטנים מקובצים סביב מפרידי פטריות, וחללים בין-סלולאריים גדולים מצביעים על נוכחות של מטריצה מומסת (איור S1).

כיול של הצבע הטימטרי מניב עקומה א-סימטרית13,14. PH החילוץ ביויואמים ירד במהירות 5 דקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים שונים לטיפוח של הממלכה הצולבת ביוגיאמים הקשורים C. אלביקנס ו סטרפטוקוקוס spp. תוארו בעבר9,22,23,24,25. עם זאת, הכיוונון הנוכחי מתמקד בתנאי גדילה פשוטים, לוח זמנים התואם לימי עבודה רגילים, הלחנה של מינים מאוזנים ופיתוח של מטריצה ביוציסטית מצומצמת. יתר על כן, 96-צלחות היטב היו מצופות בפתרון הרוק כדי לחקות את התנאים אוראלי של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

והוא מודה בתמיכה טכנית מעולה. המחברים מודים לרובנס-נטו לדיונים פוריים על ניתוח תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות אגר דםStatens Serum Institut677
עירוי לב מוחOxoidCM1135
עירוי לב מוח + 5% סוכרוזBDH חומרי מעבדה10274
קנדידה אלביקנסהאוסף הלאומי של פטריות פתוגניותNCPF 3179
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
daime: ניתוח תמונה דיגיטלית באקולוגיה מיקרוביאליתUniversitä t WienN/Aתוכנה חופשית; גרסה 2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxideLife TechnologiesD12345
סרום בקר עובריGibco Life Technologies10270
GS-6R צנטריפוגה מקוררתBeckmanN/A
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותלא ישים; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
>JavaOracleN/Aתוכנה חינמית הנחוצה להפעלת ImageJ; גרסה 8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-Morpholino) חומצה אתנסולפונית (MES) מאגרBioworld700728
PHM210 pH-meterרדיומטר תוכנית אנליטית-אפוכרומט
63x מטרת טבילה בשמןZeissN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(ו-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
תמיסת מלח פיזיולוגית סטריליתVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A
תוכנה חינמית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527(2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967(2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457(2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242(2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299(2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pHpHC SNARF 4Candida albicansStreptococcus mutans

מאמרים קשורים