הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60273

⸱

16 בספטמבר 2019

 ,  , 
1School of Applied Sciences, University of Huddersfield, 2Laboratory of Radiotherapy and Experimental Radiation Oncology, Humbertus Wald Tumorzentrum, University Cancer Center Hamburg, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

במאמר זה

סיכום

ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

תקציר

גילוי ופיתוח של תרופות בחקר הסרטן הוא יותר ויותר מבוסס על מסכי הסמים בפורמט 3D. מעכבי הרומן מיקוד הפוטנציאל הנדידה פולשנית של תאים סרטניים, וכתוצאה מכך התפשטות גרורתית של המחלה, מתגלים ונחשבים טיפולים משלימים סרטן פולשני מאוד כגון gliomas. לכן, יצירת נתונים המאפשרים ניתוחים מפורטים של תאים בסביבה תלת-ממדית לאחר הוספת תרופה נדרשת. המתודולוגיה מתוארת כאן, שילוב של הפלישה ספרואיד מספר עם לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח נתונים על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ (CLSM), מאפשר אפיון מפורט של ההשפעות של מעכבי נגד נדידה הפוטנציאלי MI-192 על תאים glioma. Spheroids נוצרו קווי התא עבור בחני פלישה אומר ב מחסיד נמוך 96-טוב צלחות ולאחר מכן מוכן ניתוח clsm. זרימת העבודה המתוארת הייתה מועדפת על-ידי שימוש נפוץ אחרים ביצירת שיטות הייצור הנפוצות בשל הקלות והתוכסות. זה, בשילוב עם רזולוציית תמונה משופרת מושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לעומת גישות רגילות שדה רחב, איפשר זיהוי וניתוח של שינויים מורפולוגיים ברורים בתאי נדידה בסביבה תלת-ממדית לאחר טיפול עם התרופה migrastatic MI-192.

מבוא

שלוש טכנולוגיות ספרואיד ממדיות לגילוי תרופות טרום-קליניות ופיתוח תרופות לסרטן פוטנציאליות הן יותר ויותר להיות המועדף על מסכי סמים קונבנציונליים; כך, יש יותר פיתוח של migrastatic-הגירה ומניעת פלישה-סמים. הרציונל מאחורי ההתפתחויות האלה בטיפול בסרטן הם ברורים: 3d ספרואיד בחני מייצגים גישה מציאותית יותר לסינון תרופות נגד סרטן פוטנציאלי כפי שהם מחקים אדריכלות הגידול 3d בנאמנות יותר מאשר התרבויות התא דופלקס, באופן מדויק יותר, ולאפשר אפיון של פעילות התרופות בהגדרה הקשורה לגידול. בנוסף, עליית ההתנגדות לתרופות כימוחלות בסוגים רבים של סרטן ושיעורי מוות גבוה בקרב חולי סרטן בשל הפוטנציאל גרורות על ידי היכולת של תאים סרטניים להגר לאתרי גידול מרחוק תומך הכללה של סוכני כימותרפיות מיקוד הפוטנציאל הנדידה של תאים סרטניים כמו הטיפול שדון בעתיד סרטן קליני ניסויים1. זה במיוחד המקרה של סרטן פולשני מאוד, כגון glioblastomas בדרגה גבוהה (GBM). ניהול GBM כולל ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה. עם זאת, גם עם טיפול משולב, רוב המטופלים מתדרדרות בתוך שנה 1 של אבחנה ראשונית עם הישרדות חציון של 11-15 חודשים2,3. התקדמות אדירה בתחום הטכנולוגיה 3D נעשו בשנים האחרונות: מערכות מיקרו, מבנים מפוברק ו 3D פיגומים, ומוסר הפרט השני הם השתפרו ללא הרף כדי לאפשר בדיקות שגרתיות בקנה מידה גדול4, 5,6,7. עם זאת, התוצאות שהתקבלו משיטות אלה חייבות להיות מנותח באופן משמעותי משום שפענוח הנתונים מפריע לעתים קרובות על-ידי ניסיונות לנתח נתונים שנוצרו על-ידי 3D עם מערכות ניתוח תמונה דו-ממדית.

למרות היותו עדיף במונחים של מהירות רכישת תמונה והפחתת רעילות התמונה, רוב מערכות השדה הרחב נשארות מוגבלות על ידי רזולוציה8. לפיכך, מלבד מידע לקריאה הקשורות ליעילות הסמים, השפעות מפורטות של פעולת התרופה על מבנים סלולריים תלת-ממדיים של תאים הגירה יאבדו באופן בלתי נמנע אם התמונה באמצעות מערכת שטח רחב. לעומת זאת, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (clsm) לוכדת באיכות גבוהה, תמונות מנות בצורה אופטית שניתן לשחזור ומעובד ב-3d לאחר הרכישה באמצעות תוכנת מחשב. כך, CLSM ישימה בקלות על הדמיה מורכבים 3D מבנים סלולריים, ובכך מאפשר חקירה של ההשפעות של מעכבי anti-migrastatic על מבנים תלת-ממד וניתוחים מעמיק של מנגנוני הגירה התא. זה ללא ספק ידריך בעתיד migrastatic התפתחות התרופה. כאן, מתוארת זרימת עבודה משולבת של דור כדורי, טיפול בתרופות, כתמים ואפיון על-ידי מיקרוסקופ קונטואיד ברזולוציה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הדור של הספרואידים תא

היום הראשון

  1. הכן את מדיום התרבות הסטנדרטית כנדרש על-ידי קו התא תחת חקירה.
  2. בצע את כל תרבות הרקמה הקשורים שלבים במכסה של תרבות הרקמה באמצעות טכניקות טיפול סטרילי.
  3. טריזיסיזציה וספירת תאים סרטניים. השתמש ב-20 מ ל של השעיית תאים לכל צלחת. לשמור את השעיות התא בתווית בבירור צינורות אוניברסלי סטרילי.
  4. הוסף מספר מוגדר מראש של תאים לכל באר. הן המספר ההתחלתי של תאים וגודל ספרואיד האולטימטיבי נדרש תלוי בקצב ההתפשטות של קו התא שנחקר.
    הערה: עבור הוקמה קווי התאים glioma כגון U251 ו KNS429,10, 5 x 103 תאים/mL יפיק מאכל עין ספרואיד (200 או 800 μm) לאחר 4 ימים של דגירה.
  5. השהה את התאים בצינורות אוניברסליים על ידי היפוך עדין כדי להימנע מקלפינג תאים. פיפטה 200 μL של התא מושעה לכל טוב של צלחת 96-באר. אם כל הבארות אינם נדרשים, רצוי להוסיף 200 μL של 1x PBS לכל הבאר ריקה כדי למנוע אידוי.
  6. מודיית את התאים בחממה כרגיל ב 37 ° c.
    הערה: קווי התאים כגון שורות התאים של סרטן glioma יהיה טופס spheroids בתוך 24 h. אפשר ארכיטקטורה תאית 3D כדי ליצור על ידי דגירה של ספרואיד עבור 72 h.

היום השני

  1. בדיקת תאים על-ידי מיקרוסקופ שדה בהיר לאחר 24 שעות. בהתאם לקו התא, ייתכן שתאים יצרו מזהה ספרואיד בתחתית הבאר.
    הערה: הקים glioma סרטן התאים קווי בצורה בקלות spheroids בתוך 24 h. החולה-הנגזר glioma סרטן קווי התאים עשויים להימשך עד 1-2 שבועות.

2. שיטת הפלישה קולגן

היום השלישי

  1. המקום קולגן, 5x בינוני התרבות, 1 M NaOH, ו 1 20 mL על קרח.
  2. בזהירות ובאיטיות להוסיף 10.4 mL של קולגן קר לתוך צינור תרבות מקורר. להימנע בועות. כמות זו של קולגן מספיק עבור 1 96-בסדר צלחת. ניתן לעשות שינוי קנה מידה אפשרי, אך מומלץ לעשות שפופרת 1 20 mL לכל צלחת מוכנה בכל פעם.
  3. הוסיפו בעדינות 1.52 מ ל של בינונית תרבותית 5x הקרה וסטרילית. להימנע בועות.
  4. רק לפני השימוש, להוסיף בעדינות 72 μL של קר סטרילי 1 M NaOH. . שמור על הפתרון על הקרח
  5. מערבבים בעדינות על ידי ליטוף. להימנע בועות. ערבוב יעיל מוביל לשינוי צבע (מאדום לכתום-אדום (pH 7.4) במדיום. השאירו את התערובת על הקרח עד השימוש.
  6. צעד מכריע: הסר 190 μL של סופרנטאנט מצלחת 96-באר המוכן ביום 1. להיזהר מאוד לא להפריע את הספרואידים שנוצרו בחלק התחתון של הבאר. השתמשו בפיפטה בזווית לכיוון הצד, ולא במרכז, בבאר.
  7. הוסף בעדינות 100 μL של תערובת הקולגן לכל טוב. , כדי למנוע הפרעה ספרואידית. התערובת מעורבת בצד הבאר להימנע בועות. שמרו כל שילוב קולגן שנותר 20 מ ל בטמפרטורת החדר כדי להעריך את הפלמור.
  8. הצלחת דגירה בחממה לפחות 10 דקות כדי לאפשר קולגן כדי פולימייט. כמנחה, אם שאריות הקולגן יש להגדיר, להיות וצק ו ספוג כמו, הspheroids מוכנים להיות מטופלים עם מעכב.
  9. הוסיפו את התרופות או המעכבי בריכוז 2x למדיום התרבותי. הוסף את המדיום בעדינות לכל טוב (100 μL לכל טוב). שוב, פיפטה את המדיום במורד הצד של הבאר כדי למנוע הפרעה ספרואיד.
  10. להתבונן ולצלם כל ספרואיד על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר לפעמים T = 0 h, 24 h, 48 h, ו 72 h כדי להעריך את פעילות הסמים. . אז תחזיר את הצלחת לחממה
    הערה: בהתאם התנהגות פולשנית של קו התא, הגירה הרחק מן הליבה ספרואיד המקורי ניתן לצפות 24 h ואילך.

3. הכנת מיכלי קולגן מוטבעים ותאי נדידה למיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הניחו את הצלחת במכסה של תרבות הרקמה והסירו בעדינות את הסופרנטנט (200 μL). שוב, לדאוג לא להפריע הספרואיד ולהימנע מלגעת קולגן, כמו זה עלול להפריע תקע הקולגן.
  2. החלף את הסופרנטאנט עם 100 μL של 1x PBS. חזור על זה שלב 3 x.
  3. הסר את השטיפה הסופית והחלף עם 4% פורמלדהיד ב-1x PBS (100 μL לכל טוב).
    זהירות: פורמלדהיד הוא גורם מסרטן פוטנציאלי. טפל בזהירות בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות.
  4. מניחים את הצלחת 96-באר על ספסל מעבדה, לכסות עם נייר כסף, ולצאת 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  5. בזהירות להסיר את פורמלדהיד ולהחליף עם 1x PBS. חזור על זה 1 x PBS כביסה 3x.
  6. להכין 0.1% טריטון X-100 ב 1x PBS. להסיר את הכביסה 1x PBS ולהחליף עם 100 μL של הפתרון X-100 טריטון. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, להכין את הפתרון חסימת עם 1 x PBS ו 0.05% אבקת חלב גנב ומערבבים ביסודיות.
  7. להסיר את טריטון X-100 ולשטוף 3x עם 1x PBS. הוסף 100 μL של פתרון חסימת כל טוב ו מודעד 15 דקות.
  8. לדלל את הנוגדן העיקרי הנדרש במאגר חסימת בריכוז הקבועה מראש. כאן, השימוש נגד עכבר IgG acetylated טובולין נוגדן (1:100).
  9. צנטריפוגה את התערובת העיקרית לחסימת נוגדנים עבור 5 דקות ב 15,682 x g. הסר בזהירות את פתרון החסימה והוסף את הסופרנטנט (25-50 μL) לכל היותר. מודטה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 1 h.
  10. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף 3x עם 1x PBS (100 μL לכל טוב).
  11. דלל את הנוגדן המשני במאגר חסימת הריכוז המומלץ או הקבוע מראש בנוסף לכל כתמי פלורסנט נוספים. כאן, השתמש 1:500 נגד העכבר fluorophore-488 נוגדן מצובן, phalloidin-594 (1:500) עבור כתמי אקטין, ואת כתם DNA (dapi).
  12. שוב, צנטריפוגה את הפתרון נוגדן משני עבור 5 דקות ב 13,000 סל ד.
  13. הסר את פתרון חסימת מכל באר והוסף 25-50 μL של הנוגדן המשני/phalloidin/DAPI mix. דגירה בחושך עבור 1.5 h בטמפרטורת החדר.
  14. להסיר את הפתרון נוגדן משני לצבוע ולשטוף 3x עם 1x PBS (100 μL לכל טוב).
  15. הרימו בזהירות את אטמי הקולגן הבודדים באמצעות שאיבה עם פיפטה פלסטי (200 μL) למרכז של שקופית זכוכית פשוטה באיכות גבוהה.
  16. הוסיפו טיפה אחת של השוטר המתאים לתקע הקולגן, והקפדה על התקע מכוסה לחלוטין. להימנע בועות.
  17. החלת הכיסויים של העובי האופטימלי למטרת המיקרוסקופ שישמשו לדימות ולאפשר את הגדרת הלילה. אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר בחשכה.

4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

  1. לכידת תמונות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית מתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טכנולוגיית ספרואיד תלת ממדית מקדמת את ההבנה של אינטראקציות הגידול בסמים, משום שהיא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. הדור של הספרואידים יכול להיות מושגת במספר דרכים; הדבקות נמוכה 96-לוחיות הרישוי שימשו בפרוטוקול זה. לאחר בדיקת מספר מוצרים מיצרנים שונים, הצלחות המשמשות כאן נבחרו משום שהם בעקביות ביצעו את הטוב ביותר במונחים של ייצור ואחידות מוצלחים של ספרואיד. הצעד המחליף, שבו בינוני הגדילה מוחלף עם מטריצת קולגן, הוא נקודה קריטית של הפרוטוקול; טיפול גדול יש לנקוט כדי להסיר את רוב המדיום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדרך הרומן ליצור spheroids תאים סרטניים לזיהוי של פעילות סמים migrastatic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה מתואר. השימוש בלוחות מסוכרנים נמוכים על פני טכניקות אחרות, כגון תליית טיפות15, הקלה על אמצעי ליצירת הספרואידים ומדים אחידים לשימוש הגירה קולגן הפלישה assays. הנקודות הקריטיות בפרוטוקול זה הם הסרת בינוני הצמיחה מלוחית 96-באר לפני הטבעה ספרואיד התא במטריצה קולגן ואת הטיפול הזהיר של אטמי הקולגן המכיל את spheroids לאחר מכן. טכנולוגיות חדשות כגון מיקרופלואידיקה הדיגיטלי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

תודות

היינו רוצים להודות לפרופסור כריס ג'ונס על שתרמה את קו הטלפון הKNS42. מיקרוסקופ zeiss LSM880 קונפוקלית וקד עם airyscan בשימוש בעבודה זו הוא חלק של חדשנות האדרספילד פרויקט דגירה (hiip) ממומן באמצעות העיר לידס באזור שותפות ארגוני (lep) עסקת צמיחה. קרדיט על תמונת המיקרוסקופ איור 3: מיקרוסקופ קרל Zeiss GmbH, microscopy@zeiss.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגן I, זנב עכברוש, 100 מ"ג354236 קורנינגלבדיקת פלישת גליומה; זה מוצע על ידי מפיצים/יצרנים רבים ויהיה צורך לקבוע אותו הן עבור סוג הבדיקה המיועדת והן עבור קווי התאים בהם נעשה שימוש. עבור קווי תאי סרטן גליומה, זנב עכברוש קולגן מסוג 1 (למשל קורנינג) הוא הבחירה המועדפת. יש לאחסן קולגן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, בחושך, עד שנדרש. לא מומלץ לערבב קולגן מקבוצות שונות מכיוון שהדבר עלול להשפיע על עקביות הקולגן הפולימרי.    
כיסוייםשוניםשונים להדמיית מיקרוסקופיה
אבקת DMEMSigmaD5648הדרושה בריכוז פי 5 לתמיסת קולגן לבדיקת פלישת גליומה;   ניתן לרכוש אותו בצורת אבקה, להרכיב אותו במים מזוקקים כפולים, ובהתאם להרכב הסופי של מצע הגידול, להשלים עם כל התוספים הנדרשים. יש לסנן את הפתרון המלא פי 5 דרך מערכת סינון מזרק (0.22 μ מ) לפני השימוש.
סרום עגל עובריSigmaF7524-500MLדרוש לתרבית תאים של קווי תאי גליומה
שקופיות זכוכיתשונותלהדמיית מיקרוסקופיה
גלוקוז גבוה DMEMGibco41965062 דרושים לתרבית תאים של קווי תאי גליומה
מעכבTocrisשוניםשונים - על פי תכנון ניסיוני; ניתן לרכוש מעכבים מיצרנים כמו Selleckchem ו-Tocris. יצרנים אלה מציעים תיאור מפורט של מאפייני המעכבים, קישורים להפניות קשורות והצעות לריכוזי עבודה. כמו כל המעכבים, הם עלולים להיות רעילים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות. מעכבים מוכנים כתמיסות מלאי לפי המלצת היצרן. כדוגמה, השתמשנו במעכב המיגרסטטי MI-192 כדי להדגים את השימוש במעכבים כאלה. בדקנו מגוון של מעכבים מיגרסטטיים בדרך זו עם תוצאות דומות.
הרכבהשוניםלהדמיה מיקרוסקופית
NaOH (1 M)שונים ניתן לרכוש NaOH שונים במולריות הנדרשת או להכין אותם מצורה מוצקה. יש לעקר את התמיסה המוכנה באמצעות מערכת סינון מזרק. M NaOH אחד הוא קורוזיבי ויש לנקוט בזהירות במהלך הכנת התמיסה.
פרפורמלדהיד שוניםשונים לקיבוע ספרואידים ותאים; להרכיב ב -4%, זהירות סכנה בריאותית, להבטיח כי מקפידים על תקנות הבריאות והבטיחות לתמיסת קולגן לבדיקת פלישה
פסטות (פיפטה מדורגת, 3 מ"ל)שוניםלבדיקת פלישה, הסרת תמיסה
PBS, סטרילי לתרבית רקמותסיגמאD1408-500ML   דרוש לתרבית תאים של קווי תאי גליומה ושטיפות לצביעה
עט/סטרפטוקוס (אנטיביוטיקה)SigmaP4333דרוש לתרבית תאים של קווי תאי גליומה
נוגדן ראשוני, נוגדן משני, DAPI, Phalloidinשוניםישנם יצרנים רבים עבור ריאגנטים אלה, לנוגדנים מסומנים משניים אנו ממליצים על Alexa Fluor (בדיקות מולקולריות). כאן השתמשנו בנוגדנים ראשוניים נוגדן טובולין נגד אצטילציה של עכבר (1/100, Abcam). עבור נוגדנים משניים השתמשנו בנוגדנים מצומדים 1/500 נגד עכברים Alexa Fluor 488, בדיקות מולקולריות. עבור כתם גרעיני השתמשנו ב-DAPI (יצרנים רבים) ובכתם האקטין Phalloidin (יצרנים רבים) שניהם בשימוש בדילול מומלץ של 1/500.
נתרן ביקרבונטSigmaS5761דרוש לתמיסת קולגן לבדיקת פלישת גליומה בריכוז 5x
נתרן פירובטSigmaP5280דרוש לתמיסת קולגן לבדיקת פלישת גליומה בריכוז פי 5
טריפסיןסיגמאT4049לטריפסיניזציה
לוחות חיבור נמוכים במיוחדSigma/NuncCLS7007-24EAלבדיקת פלישת גליומה; נדרשת צלחת דביקה נמוכה, עם צלחות של 96 בארות עדיפות כדי לאפשר הקרנה בקנה מידה גדול של תרכובות הנחקרות. ישנן מספר לוחות הידבקות נמוכים זמינים מסחרית; רצוי לבדוק מגוון צלחות לייצור כדורי אופטימלי. מניסיוננו Costar Ultra Low Cluster עם מכסה, תחתית עגולה, עובד בצורה הטובה ביותר ליצירת ספרואידים מתאי סרטן גליומה במונחים של 100% היווצרות ושחזור ספרואידים. לוחות אלה שימשו בהצלחה גם ליצירת ספרואידים של גליומה מחומר שמקורו בחולה, תאי סרטן שלפוחית השתן והשחלות במעבדה שלנו. בנוסף, ניתן להשתמש בנוירוספירות גזע או אב בלוחות אלה כדי להקל על יצירת ספרואידים נוירוספיריים סטנדרטיים
Stripettes (פיפטות סרולוגיות, סטריליות, 5 מ"ל ו-10 מ"ל)שונות למשל CostarCLS4488-50; CLS4487-50לתרבית רקמות והכנת קולגן
רב ערוצי שונים (50 - 250 μ L) ופיפטות חד-ערוציות (10 μ L, 50 ו-mu; L, 200 ו-mu; L 1 מ"ל)שוניםלטיפול בתאים וכדורים
מיקרוסקופיה בשדה רחבשונים שוניםלתצפית על יצירת ספרואידים והדמיה ספרואידית; כאן נלכדו תמונות פלואורסצנטיות בשדה רחב באמצעות מערכת הדמיית תאים EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM מצויד ב-Plan Apochromat 63x 1.4 NA מטרת שמןצייסציטוט מהיצרןתמונות קונפוקליות צולמו באמצעות Zeiss LSM 880 CLSM המצויד במטרת שמן Plan Apochromat 63x 1.4 NA. לייזרים מרובי קווים של דיודה 405 ננומטר, 458/488/514 ננומטר ו-HeNe 594 ננומטר שימשו לעורר את Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 ו-DAPI בהתאמה. עבור כל תמונה נלכד קטע אופטי מייצג אחד, כאשר כל ההגדרות, הן לפני והן אחרי צילום התמונה, נשמרו למטרות השוואה. כל התמונות עובדו לאחר מכן באמצעות תוכנת הדמיית Zen ו-Adobe Photoshop.

מקורות

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333(2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253(2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.