הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60281

⸱

14 בדצמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia, 2Institute of Tropical Forestry and Forestry Products (INTROP), Universiti Putra Malaysia, 3Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Malaya, 4Agro-Biotechnology Institute (ABI), National Institute of Biotechnology Malaysia (NIBM)

במאמר זה

סיכום

פעילות מקרופאג phagocytic נגד תאים סרטניים, במיוחד 4T1 עכבר קרצינומה של החלב בתאי, היה בתמונה במחקר זה. מודל התרבות של התאים החיים הוקם ונצפה בשילוב של מיקרוסקופ פלורסנט והפרעות דיפרנציאליות. הערכה זו היתה תמונה באמצעות תוכנת דימות כדי לפתח וידאו לפקיעה מרובה נקודות.

תקציר

מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) זוהו כמרכיב חשוב לצמיחה הגידול, פלישה, גרורות, והתנגדות לטיפולים בסרטן. עם זאת, מקרופאגים הקשורים לגידול יכול להזיק לגידול בהתאם מיקרו הסביבה הגידול יכול להיות הפיך לשנות את מאפייני פנוטימית שלהם על ידי שינוי הפעילות הציטוטוקסיים של תאים חיסוניים או שיפור התגובה נגד הגידול. הפעולות המולקולריות של מקרופאגים והאינטראקציות שלהם עם תאי גידול (למשל, phagocytosis) לא נחקרו בהרחבה. לכן, את האינטראקציה בין התאים החיסוניים (M1/M2-תת-תחום טאם) ואת התאים הסרטניים מיקרוסביבה הגידול הוא כעת מוקד של מחקר חיסוני סרטן. במחקר הנוכחי, תא חי מודל התרבות של מקרופאגים המושרה M1 ו הפטמות העכבר 4T1 תאים קרצינומה פותחה כדי להעריך את הפעילות phagocytic של מקרופאגים באמצעות תכונת וידאו בזמן הקפיצה באמצעות שלב-ניגודיות, פלורסנט, ו הפרעות הפרעה ההפרש (DIC) מיקרוסקופ. השיטה הנוכחית יכולה להתבונן ולתעד הדמיה של תא חי רב-נקודות של phagocyציטוזה. פאיגוציטוזה של התאים 4T1 על-ידי מקרופאגים M1 ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט לפני צביעת התאים 4T1 עם carboxyפלואורומיתעין (CFSE). הפרסום הנוכחי מתאר כיצד להתאים מקרופאגים ותאי הגידול בצלחת הדמיה אחת, הקיטוב מקרופאגים M1, ולהקליט אירועים נקודתי של מקרופאגים בשחוד 4t1 תאים במהלך 13 h של התרבות הקובית.

מבוא

מקרופאגים הם השורה הראשונה של הגנה חיסונית לשחק תפקיד מנצח את התגובות החיסונית נגד פתוגנים וחומרים זרים, כולל תאים סרטניים. הם פגוציט מיוחדים ההורס ומקבל להיפטר חלקיקים לא רצויים בגוף. מקרופאגים לתרום פונקציות הגנתי כגון הסיווג של תאים אפוטוטיים ומיקרואורגניזמים וגיוס של תאים חיסוניים אחרים1. מקרופאגים יכולים להבדיל לשני סוגים שונים, M1 ו M2 מקרופאגים, בתגובה לאותות סביבתיים2. M1-מקרופאגים (כלומר, מקרופאגים המופעל באופן קלאסי) מופעלים על ידי ציטוקינים אינטרפרון-γ (ifn-γ) וליפופוליסכולידים (lps) והם מעורבים בתגובה דלקתית, מחלת הפתוגן, החיסון היעיל phagocyציטוזה, ו-tumoricidal חסינות3,4. מקרופאגים M2 הם קשורים הדוק מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ויש להם אנטי דלקתיות ומאפיינים קידום הגידול4.

פאיגוציטוזה, נגזר מיוונית עתיקה (phaחיין), כלומר "לטרוף," (kytos), כלומר "תא" ו-osis, כלומר "תהליך"5. Phagocyציטוזה הוא תהליך קולטן בתיווך שבו phagocytes (כולל מקרופאגים, מונוציטים, ו נויטרופילים) להרוג ו בלוע הפולשים פתוגנים, לנקות חלקיקים זרים, ושרידים ברורים תאים האפוטוטיים. הגידול משויך מקרופאגים (tams) נמצאים הסטרומה בגידולים שונים, כולל סרטן השד, יש פונקציות pro-הגידול6,7, וכתוצאה מכך התנגדות phagocyציטוזה. המנגנון המפורט של תאי הגידול phagocyציטוזה על ידי מקרופאגים אינו מובן עדיין.

מחקר זה מציג שיטת שני שלבים: 1) 4T1 עכבר קרצינומה של הפטמות מקוטב M1 ומקרופאגים מקוטנים של מקרופאגים, ו 2) הפעילות phagocytic של המקרופאגים מוערך באמצעות מיקרוסקופ וידאו של תא חי. צבען פלורסנט CFSE שימש כדי להכתים את התאים 4T1 החלב קרצינומה של הפטמות. הכתם תוויות 4T1 תאים כדי להבדיל ביניהם מקרופאגים של M1 מתורבת בתוך צלחת הדמיה אחת. RAW 264.7 מקרופאגים הם מקוטב עם LPS ו IFN-γ לתוך הפנוטיפים M1. כדי להבטיח פולריזציה מלאה, הכתים עם נוגדן anti-iNOS מצותמים ל-FITC בוצעה. לאחר מכן, סדרה מרובת נקודות של תמונות מעידה בזמן נרכשה כדי להתבונן באירועים מרובים, כולל phagocyציטוזה, בתוך התרבות הקובית.

הבנה טובה יותר של האינטראקציות בין תאים סרטניים מקרופאגים עלול לגרום לטיפול חיסוני פוטנציאלי בסרטן. הדמיה של תא חי מציעה תצוגה מפורטת של דינמיקה סלולרית בהגדרה בזמן אמת, שימש לחקר הגירה של תאים, הקרנה פנוטימית, אפופטוזיס, ו-ציטורעילות8,9 ב מדעי המוח, ביולוגיה התפתחותית, וגילוי סמים. למרות הגידול המוצע במחקר זה הוא סרטן השד, השיטה יכולה גם להיות מוחל על מספר תאים היעד ואת התאים הנפרדים אפקטור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: סעיפים 1-6 לתאר את מודל התרבות של התאים 4T1 הפטמות החלב של העכבר ו RAW 264.7 עכבר מקרופאגים. סעיף 7 מתאר את הערכת הזמן לשגות של מקרופאגים של M1 phagocyted 4T1 תאים.

1. העכבר 4T1 החלב קרצינומה של תאים ומקרופאגים RAW 264.7 עכבר

  1. הפשרת מבחנה של 4T1 ו-RAW 264.7 מעבר 6 תאים בעצבנות עדינה באמבט מים ב-37 ° c או בטמפרטורת הצמיחה הרגילה לקווי התאים.
    הערה: הפשרה צריכה להתבצע במהירות, בערך בתוך 2 דקות. כדי למנוע זיהום, להסיר את המבחנה מאמבט מים ולטהרים אותו על ידי ריסוס עם 70% אתנול. כדי להימנע מסחף גנטי, במיוחד עבור מקרופאגים, להשתמש מספר מעבר נמוך (כלומר, פחות מ 20).
  2. לדלל את התאים המופשרים 10 מ ל של מדיום מלאה Dמאמ ב 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה את התאים ב 600 x g עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.
    הערה: השלם DMEM דיום בינונית בתוספת עם 10% (v/v) העובר סרום (FBS), 200 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, ו 2 מ"מ L-גלוטמין משמש לאורך כל הפרוטוקול.
  3. בזהירות לחות התקשורת, להשעות מחדש את התאים 8 מ ל של בינוני מלא ולהעביר לתוך 25 ס מ2 התרבות רקמה טיפול בקבוקון. תרבות הן 4T1 ו-RAW 264.7 תאים ב-DMEM דיום מלא ב-37 ° צ' עם 5% CO2.
    הערה: השהה מחדש את כדורי התא בעדינות להוסיף את ההשעיה התא לתוך הבקבוקון התרבות ירידה על ידי ירידה כדי למנוע הריגת התאים.
  4. לאחר 1 שבוע של culturing כדי לאפשר הדבקות התא, לנטר את הבקבוקון מדי יום ולהוסיף 8 מ ל של מדיום DMEM מלאה בהתאם לצורך.

2. כתמים חיסוני של M1 מקוטב RAW 264.7 מקרופאגים

  1. כמו שליטה של RAW 264.7 תאים מגיע ל 70-80%, למחוק את מדיית התרבות ולשטוף בעדינות 2x עם לפחות 2 מ ל של PBS.
    הערה: לפני זריעת RAW 264.7 תאים, ודא שאף תא לא התרחש (כלומר, דנדט כמו פניטיפים ו/או גודל תא מוגבר). אם שינויי מורפולוגיה של התא גלויים, מחק את התרבות והפשרת קו תא חדש ממבחנה מעבר קודם.
  2. הכינו את מקרופאגים לאיסוף על ידי הפסקת לינה בעדינות את התאים החסיד באמצעות מגרד התא ולהעביר אותם לתוך שפופרת 5 מ ל חרוט.
  3. לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר ולהכין השעיית תא של 1 x 105 תאים/צלחת באמצעות מדיום dmem מלא.
  4. זרע 2 מ ל של מקרופאגים ההשעיה לתוך שתי מנות הדמיה. מודאת התאים 2 עד 3 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2 כדי לאפשר הדבקות תא.
  5. הכנת מדיה הפולני M1 על-ידי הוספת 100 ng/mL LPS ו 20 ng/mL IFN-γלתוך מדיום להשליםבינונית 10,11.
  6. להשליך את התרבות supernatant מן המקרופאגים ולשטוף בזהירות monolayers בצלחת 2x עם לפחות 1 מ ל של PBS.
  7. הוסף 2 מ ל של מדיית ה-m1 קיטוב לתוך אחת מנות הדמיה, לאפשר RAW 264.7 תאים כדי לגרום את M1 מקרופאג פניטיפים, ו דגירה 2 – 3 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
    הערה: זרע RAW 264.7 מקרופאגים בצלחת הדמיה עם DMEM שיושלם עם 10% FBS כפקד על כתמים נוגדן anti-iNOS. תייג את מנות הדימות RAW (בקרה) ומקרופאגים M1 (lps ו-γ מקוטב), בהתאמה.
  8. לפני מכתים החיסוני, לתקן את התאים RAW 264.7 ו-M1 מקרופאגים באמצעות 2 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד ו דגירה עבור 15 דקות ב 37 ° צ' (טמפרטורת החדר, RT).
  9. הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
  10. כיבוי עם 2 מ מ של 50 mM אמוניום כלוריד ב-PBS ו-דגירה עבור 15 דקות at RT.
  11. החדירות באמצעות 2 מ ל של 0.3% טריטון X-100 ב PBS עבור 15 דקות ב RT.
  12. הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
  13. בלוק באמצעות 2 מ ל של 10% FBS ב PBS עבור 30 דקות ב RT.
    הערה: השלב החוסם בהכתמים הוא למזער את האיגוד הלא ספציפי של נוגדן בתוך התא.
  14. הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
  15. דגירה עם 2 מ ל של anti-iNOS-FITC ב-PBS ו 1% FBS לילה ב 4 ° c.
    הערה: סמן את התאים באמצעות דילול הנוגדנים המתאים בהתאם להמלצות היצרן. להגן על הכלים מפני אור על ידי כיסוי אותם עם רדיד אלומיניום מנקודה זו והלאה.
  16. הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
  17. מודטה 1 מ ל של 300 ננומטר 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) לתוך מנות הדמיה עבור 10 דקות ב 37 ° c, בחשכה על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום.
  18. שטוף תאים עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x ולהוסיף 1 מ ל של מדיום מלאה DMEM לתוך מנות ההדמיה.
    הערה: התאים מוכנים כעת לדימות הקרינה הפלואורסצנטית. ההתקנה מיקרוסקופ יצטרך שלב הפוך מסנני עירור עבור כתמים נבחרים (במקרה זה, FITC ו-DAPI).
  19. הפעל את המיקרוסקופ וטען את תוכנת הדימות. הר את הצלחת ההדמיה על המיקרוסקופ ולהתאים את המוקד כדי להתבונן RAW 264.7 ו-M1 מקרופאגים. מיטוב המראה של תמונות FITC ו-DAPI עם ניגודיות פאזה על-ידי התאמת זמני האור והחשיפה המשודרים.
    הערה: התחל בהדמיה כאשר כל הנקודות מתמקדות והערוצים ממוטבים.
  20. לכידת תמונות FITC ו-DAPI בניגוד לשלב (איור 1).

3. זריעת כדוריות החלב של העכבר 4T1

  1. ככל ששטף התאים 4T1 מגיע ל-70-80%, מחק את מדיית התרבות ושטוף בעדינות את 2x עם לפחות 2 מ ל של PBS. הוסף 1 מ ל של מקדם התחממות כלפי מעלה כדי לנתק את התאים ואת הדגירה עד 20 דקות ב 37 ° c.
    הערה: שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ. תאים מנותקים יעוגלו.
  2. ברגע שהתאים מתנתק, העבירו אותם לצינור של 15 מ"ל והוסיפו 2 מ ל של מדיום DMEM לאה מראש כדי להשבית את הטריפסין. לפזר בעדינות את המדיום על ידי ללטף את משטח שכבת התא כדי לשחזר את התאים. אז, צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.
  3. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של מדיום DMEM לאה.
  4. לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר וזרע 1 x 105 התאים 4t1 ב 2 מ ' של מדיום מלאה dmem בכל אחד מ-2 35 מ"מ זכוכית מנות הדמיה מטופלים עם תרבות רקמה. דגירה התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
    הערה: התרבות 4T1 תאים באחד הכלים הדמיה עם מדיה הפולני M1 והתווית 4t1-הסליל (שליטה). זה כדי להבטיח צמיחה נורמלית של תאים 4T1 כאשר נחשפים האינדורים.

4. מתייג החיים 4T1 החלב קרצינומה של תאים באמצעות מכתים CFSE

  1. תחילה, הסר את המדיה הקיימת מתוך מנות הדימות של התאים 4T1. שטוף את התא מונאולייר לפחות 2x עם 1 mL של PBS.
  2. הכינו 5 μM של פתרון מכתים CFSE על ידי דילול CFSE ב 1 mL של PBS. הוסף 1 מ ל של 5 μM CFSE מכתים פתרון לתוך כל צלחת הדמיה ו מודחת תאים עבור 20 דקות ב RT או 37 ° c, בחושך.
    הערה: סמן את התאים באמצעות הריכוז המתאים CFSE עבודה על פי המלצות היצרן וניסויים ראשוניים כדי להשיג את הריכוז האופטימלי CFSE מכתים. יעילות התיוג יהיה גבוה יותר אם CFSE הוא מדולל ב-PBS.
  3. להרוות את הצביעת על ידי הוספת נפח שווה של מדיום מלאה DMEM המכיל 10% FBS ו הצביעת פתרון לתאים ומודלטה עבור 5 דקות ב-RT בחושך.
  4. מחק את הפתרון המכיל את CFSE ושטוף את התאים 1x עם נפח שווה של מדיית תרבות.
    הערה: כיום 4T1 תאים מסומנים בתווית.
  5. החזר את התאים 4T1-CFSE לתנאי תרבות סטנדרטיים ב-RT עם 5% CO2.

5. זריעת RAW 264.7 העכבר מקרופאגים ו coculture עם 4T1

  1. כשטף של RAW 264.7 להגיע 70 אל 80%, למחוק את מדיית התרבות ולשטוף בעדינות 2x עם לפחות 2 מ ל של PBS.
  2. הכינו את מקרופאגים לאיסוף על ידי הפסקת לינה בעדינות את התאים החסיד באמצעות מגרד התא ולהעביר אותם לתוך שפופרת 5 מ ל חרוט.
  3. לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר ולהכין השעיית תא של 1 x 105 תאים/mL על ידי דילול הפתרון הנותר עם מדיום dmem מלאה בהתאם לצפיפות הזריעה.
    הערה: תאים שוטפת יותר מדי בתרבויות cocultures עלול להפחית באופן חמור את phagocyציטוזה. במחקר זה, את היחס הזריעה של מקרופאגים: תאים סרטניים הותאמו ליחס 1:1. היחס יכול להיות מותאם בהתאם לתוקפנות של תאי הגידול ואת מקורם של מקרופאגים.
  4. לפני coculturing, למחוק את התרבות supernatant מן התאים 4T1 הנזרע יום לפני (שלב 4.5) ובזהירות לשטוף את monolayers 2x עם לפחות 1 מ ל של PBS.
  5. Seed 1 x 105 RAW 264.7 תאים לכל 2 מ ל של מדיום מלאה dmem לתוך אחת מנות 4T1 הדמיה. מודאת התאים 2 עד 3 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2 כדי לאפשר הדבקות תא. תייג את צלחת ההדמיה 4T1-M1 coculture.
    הערה: 4T1 (בקרת) תאים לא היו מתורבתים עם מקרופאגים.

6. M1 פולריזציה של RAW 264.7 מקרופאגים

  1. הכנת התקשורת M1 הפולני על ידי הוספת 100 ng/mL LPS ו 20 ng/mL IFN-γ לתוך בינוני DMEM מלאה בתוספת 10% (v/v) FBS10,11.
  2. להיפטר supernatant תרבות מן המקרופאגים לפני (שלב 5.5) ובזהירות לשטוף את monolayers בצלחת 2x עם לפחות 1 מ ל של PBS.
  3. לאחר מכן, להוסיף 2 מ ל של התקשורת M1 קיטוב לתוך צלחת ההדמיה ולאפשר RAW 264.7 תאים כדי לגרום לתוך M1 מקרופאג פניטיפ על ידי הדגירה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
    הערה: התאים M1 מקרופאג יכול לקחת עד 2-3 h של דגירה כדי להשיג polarization מלאה. ניסויים ראשוניים צריך להיעשות כדי להבטיח את תקופת הדגירה המתאימה כדי לאפשר פולריזציה מלאה של מקרופאגים.

7. תא חי-מיקרוסקופ וידאו של phagocyציטוזה

הערה: גורמים רבים צריכים להיחשב בעת ביצוע הדמיה של תא חי כדי לקבל וידאו הניתנים להשגה, כולל אופטימיזציה של חשיפה לתמונה, מדידת זמן, תיקון מיקוד אוטומטי.

  1. לפני הניסוי, להגדיר את החממה תרבות התא על ידי הפעלת תרמוסטט ב 37 ° c ואספקת 5% CO2.
    הערה: מערך המיקרוסקופ מחייב שלב הפוך, חממה למעלה במה, בקרת לחות (95%), ומערכת דגירה של גז. הגדרה זו חיונית לשמירה על התאים להערכת מיקרוסקופ וידאו בטווח הארוך של התא החי.
  2. הפעל את המיקרוסקופ כולל השלב piezo וטען את תוכנת דימות המיקרוסקופ.
  3. מקמו את תאי התרבות השנזרע בצלחת הדמיה של 35 מ"מ מזכוכית במרכז הבמה ובעדינות על החדר העליון. השתמש במוט ההיגוי כדי להפעיל את השלב על-ידי בחירת המיקום לדימות.
  4. כדי להציג את הדוגמה, בחר את מסנן הניגודיות הפאזה בצריח. לאחר שהצגת בתחילה את המדגם, אתר את השדות המתאימים והבא את המדגם לפוקוס.
    הערה: תוכנת הדמיה מאפשרת להשתמש בבחירה אובייקטיבית באופן מלא, מערכת המיקוד המושלם, סדרת פקיעה זמן, רכישת תמונה רב-ערוצית, ורכישת תמונה נקודתי.
  5. כדי להגדיר את הקרינה הפלואורסצנטית עבור תיוג CFSE והתערבות דיפרנציאלית בניגוד להבדלים, פתח את תיבת הדו לרכישת תוכנת דימות ובחר בתיבת הסימון [למדא] (איור 2).
    הערה: עבור הדמיה של 13 שעות בזמן, יש להשתמש בערוץ ניגודיות-שלב.
  6. בחר [למדא] כרטיסיה | [תצורה אופטית] ובחר [10x DIC] עבור ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ו [gfp-R] עבור תיבת הסימון של מסנן זריחה ירוק. מתחת ל [למדא] | העמודה [פוקוס] , בחר בתיבת הסימון [10x DIC] כדי להגדיר כהפניית המוקד.
  7. פתח את תיבת הדו רכישת תוכנת דימות ולחץ על לחצן [XYZ Time...] ובחר בכרטיסיה [XY] .
  8. מעבר לנקודת הרכישה של התמונה באמצעות ג'ויסטיק על הבמה המונעת בעת בדיקת התמונה החיה או בחר מיקום אחר דרך העיניים. לאחר מכן לחץ על תיבת הסימון תחת העמודה [שם נקודה] כדי להגדיר כל נקודה בכל מיקום עבור לכידת תמונה (ראה איור 3).
    הערה: השלב האוטומטי מאפשר רכישת תמונה מרובת נקודות של קואורדינטות XY שונות כדי ללכוד שדות מרובים.
  9. כוונן את המוקד עבור כל דוגמה המוצגת על המסך. השתמש בפקדים בתיקון מיקוד אוטומטי.
  10. השתמש בתוכנה כדי להגדיר לכידת תמונה בזמן הקפיצה. בתיבת הדו רכישת תוכנת דימות, בדוק את הכרטיסיה [שעה] (ראה איור 4).
  11. קבע את [מרווח] (ההשהיה בין תחילת נקודת זמן אחת לנקודת זמן אחרת) ו- [משך] (משך הזמן הכולל של הניסוי). יחידות זמן משתנות וניתן לבחור באלפיות שניה (אלפיות שנייה), בשניות, בדקות (m) או בשעות (h) מהתפריט הנפתח.
    הערה: משך תקופת ההדמיה עבור הדמיה בזמן ההדמיה של הקרינה הפלואורסצנטית ו-DIC הזמן לרכישה רב-ערוצית עשוי להשתנות בהתאם לצבע הפלורסנט המשמש באותו מיקום. הלבנה עלולה להתרחש אם התאים המסומנים בתווית חשופים במשך זמן רב מדי.
  12. בדוק את תיבת הסימון [שמור לקובץ] כדי לשמור תמונות שנרכשו. תחת הכרטיסייה [תזמון זמן] , לחץ על הלחצן [הפעל כעת] כדי לרכוש תמונות מסדרת זמן מרובה נקודות (ראה איור 5).
    הערה: בתוכנת הדימות, תמונות נשמרות בתבנית קובץ nd2. כל השגות בנפרד יכולה להישמר באופן אינדיבידואלי בתבנית קובץ MP4 מאוחר יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזמן לשגות דו מימדי (2D) התמונות של מודל התרבית של העכבר 4T1 הפטמות קרצינומה של שורות התא להראות את התאים 4T1 להיות נבלע על ידי מקרופאגים M1 במהלך 13 h תקופה. חשוב להבטיח פולריזציה מלאה של מקרופאגים M1 על ידי ביצוע כתמים חיסוני. התוצאות (איור 1) להראות כי הריכוז של 100 Ng/ml ליפופוליסכולידים (lps) ו 20 Ng/ML ifn-γ מקוטב RAW 264.7 מקרופאגים למצב M1. מתייג את התאים המיועדים עם צבע פלורסנט ומשאיר את התאים שאינם מוכתמים בדיו מאפשר מודל חי של התרבות התאית (סרט 1). במהלך 13 h ו 15...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר דורש שני שלבים: 1) התרבות הcoculture של 4T1 תאים קרצינומה של החלב של העכבר ו-M1 מקוטב, ו 2) הערכה של פעילות מקרופאג phagocytic באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. התרבות התאית לחיות היא בשימוש נרחב phagocyציטוזה הגירה assays. מודל התרבות של התאים החיים כאן הוא פשוט, הליך מחוץ ליכולת הסתגלות (איור 2) העושה שימוש בצבע פלורסנט, cfse, המשמש לתווית התאים הייעודיים 4T1. הדבר משמש למעקב נאות של סוגי התאים במהלך הדמיה של תא חי. זמן-פקיעה הדמיה לחיות-cell שימש כדי להעריך את הפעילות phagocyt...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו הייתה ממומנת כלכלית על ידי Geran Putra Berimpak (GBP), אוניברסיטי פוטרה מלזיה: 9542800. אנחנו רוצים להודות למעבדות אגרו-ביוטכנולוגיה, מלזיה (ABI) מעבדות, ומתקן הדמיה מיקרוסקופית. תודות מיוחדות לוהד דניאל עזים לקבלת עזרה בעריכה והקלטה של הסרטון הניסיוני לעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדנים נגד INOS מצומד FITCMiltenyi BiotecREA982150 ומיקרו; גרם ב-1 מ"ל
קרבוקסיפלואורסצאין סוקסינימידיל אסטר (CFSE)InvitrogenC115725 מ"ג
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)InvitrogenD130610 מ"ג
DMEM/גלוקוז גבוהHyCloneSH30003.04670.0 גרם
סרום בקר עובריTico EuropeFBSEU500500 מ"ל
ליפופוליסכרידיםסיגמאL4516-1MG1 מ"ג
עכבר אינטרפרון-גמא רקומביננטיטכנולוגיות תאי גזע78021100 ומיקרו; g
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןCellgro30-003-CI100 מ"ל
פוספט חוצץמלח Sigma-AldrichP5368-10PAK10 חבילה
טריפסין EDTACellgro25-052-CI1X, 100 מ"ל
1000 ומיקרו; קצות פיפטה LWhiteBoxWB-301-01-0525000 טיפים/מארז
2 מ"ל פיפטה סרולוגיתJET BIOFILGSP012002לא פריוגני
200 ומיקרו; קצות פיפטה LWhiteBoxWB-301-02-30220,000 tps / מארז
25 סמ"ר בקבוק תרבית תאיםקורנינגCLS430639תרבית רקמות מטופלת
צנטריפוגה עליונה ספסלדינמיקהFA15Cדגם: Velocity 14R
מכסה אדים בטיחות ביולוגיתNuaireNU-565-400דגם: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, סוג B2 קולט אדים
CO2/אוויר מיקסרChamlide (מכשיר תא חי)FC-R-20FC-5 (CO2 / מערבל אוויר) עם מד הזרימה
מגרד תאיםNEST710001220 מ"מ
חממת תאי CO2PanasonicN / Aדגם: MCO-19M (UV)
מיקרוסקופ קונפוקליNikon Instruments Inc.N/ANikon Ti-Eclipse
צלחת תחתית זכוכיתIbidi81218-20035 מ"מ
NIS elements תוכנהNikon Instruments Inc.זמין להורדה
בקר פיפטהCappAidPA-100בקר פיפטה CappController, 0.1-100 מ"ל
תרמוסטטשינקוהופסקJCS-33A 48 x 48 x 96.5 מ"מ
מקוונת

מקורות

  1. Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  2. Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
  3. Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
  4. Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
  5. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  6. Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
  7. Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
  8. Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).
  9. Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).
  10. Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
  11. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
  12. Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
  13. Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
  14. Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
  15. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  16. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

M14T1DICCFSEM1
הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.