פעילות מקרופאג phagocytic נגד תאים סרטניים, במיוחד 4T1 עכבר קרצינומה של החלב בתאי, היה בתמונה במחקר זה. מודל התרבות של התאים החיים הוקם ונצפה בשילוב של מיקרוסקופ פלורסנט והפרעות דיפרנציאליות. הערכה זו היתה תמונה באמצעות תוכנת דימות כדי לפתח וידאו לפקיעה מרובה נקודות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) זוהו כמרכיב חשוב לצמיחה הגידול, פלישה, גרורות, והתנגדות לטיפולים בסרטן. עם זאת, מקרופאגים הקשורים לגידול יכול להזיק לגידול בהתאם מיקרו הסביבה הגידול יכול להיות הפיך לשנות את מאפייני פנוטימית שלהם על ידי שינוי הפעילות הציטוטוקסיים של תאים חיסוניים או שיפור התגובה נגד הגידול. הפעולות המולקולריות של מקרופאגים והאינטראקציות שלהם עם תאי גידול (למשל, phagocytosis) לא נחקרו בהרחבה. לכן, את האינטראקציה בין התאים החיסוניים (M1/M2-תת-תחום טאם) ואת התאים הסרטניים מיקרוסביבה הגידול הוא כעת מוקד של מחקר חיסוני סרטן. במחקר הנוכחי, תא חי מודל התרבות של מקרופאגים המושרה M1 ו הפטמות העכבר 4T1 תאים קרצינומה פותחה כדי להעריך את הפעילות phagocytic של מקרופאגים באמצעות תכונת וידאו בזמן הקפיצה באמצעות שלב-ניגודיות, פלורסנט, ו הפרעות הפרעה ההפרש (DIC) מיקרוסקופ. השיטה הנוכחית יכולה להתבונן ולתעד הדמיה של תא חי רב-נקודות של phagocyציטוזה. פאיגוציטוזה של התאים 4T1 על-ידי מקרופאגים M1 ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט לפני צביעת התאים 4T1 עם carboxyפלואורומיתעין (CFSE). הפרסום הנוכחי מתאר כיצד להתאים מקרופאגים ותאי הגידול בצלחת הדמיה אחת, הקיטוב מקרופאגים M1, ולהקליט אירועים נקודתי של מקרופאגים בשחוד 4t1 תאים במהלך 13 h של התרבות הקובית.
מבוא
מקרופאגים הם השורה הראשונה של הגנה חיסונית לשחק תפקיד מנצח את התגובות החיסונית נגד פתוגנים וחומרים זרים, כולל תאים סרטניים. הם פגוציט מיוחדים ההורס ומקבל להיפטר חלקיקים לא רצויים בגוף. מקרופאגים לתרום פונקציות הגנתי כגון הסיווג של תאים אפוטוטיים ומיקרואורגניזמים וגיוס של תאים חיסוניים אחרים1. מקרופאגים יכולים להבדיל לשני סוגים שונים, M1 ו M2 מקרופאגים, בתגובה לאותות סביבתיים2. M1-מקרופאגים (כלומר, מקרופאגים המופעל באופן קלאסי) מופעלים על ידי ציטוקינים אינטרפרון-γ (ifn-γ) וליפופוליסכולידים (lps) והם מעורבים בתגובה דלקתית, מחלת הפתוגן, החיסון היעיל phagocyציטוזה, ו-tumoricidal חסינות3,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: סעיפים 1-6 לתאר את מודל התרבות של התאים 4T1 הפטמות החלב של העכבר ו RAW 264.7 עכבר מקרופאגים. סעיף 7 מתאר את הערכת הזמן לשגות של מקרופאגים של M1 phagocyted 4T1 תאים.
1. העכבר 4T1 החלב קרצינומה של תאים ומקרופאגים RAW 264.7 עכבר
- הפשרת מבחנה של 4T1 ו-RAW 264.7 מעבר 6 תאים בעצבנות עדינה באמבט מים ב-37 ° c או בטמפרטורת הצמיחה הרגילה לקווי התאים.
הערה: הפשרה צריכה להתבצע במהירות, בערך בתוך 2 דקות. כדי למנוע זיהום, להסיר את המבחנה מאמבט מים ולטהרים אותו על ידי ריסוס עם 70% אתנול. כדי להימנע מסחף גנטי, במיוחד עבור מקרופאגים, להשתמש מספר מעבר נמוך (כלומר, פחות מ 20). - לדלל את התאים המופשרים 10 מ ל של מדיום מלאה Dמאמ ב 15 מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הזמן לשגות דו מימדי (2D) התמונות של מודל התרבית של העכבר 4T1 הפטמות קרצינומה של שורות התא להראות את התאים 4T1 להיות נבלע על ידי מקרופאגים M1 במהלך 13 h תקופה. חשוב להבטיח פולריזציה מלאה של מקרופאגים M1 על ידי ביצוע כתמים חיסוני. התוצאות (איור 1) להראות כי הריכוז של 100 Ng/ml ליפופוליסכולידים (lps) ו 20 Ng/ML ifn-γ מקוטב RAW 264.7 מקרופאגים למצב M1. מתייג את התאים המיועדים עם צבע פלורסנט ומשאיר את התאים שאינם מוכתמים בדיו מאפשר מודל חי של התרבות התאית (סרט 1). במהלך 13 h ו 15.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר דורש שני שלבים: 1) התרבות הcoculture של 4T1 תאים קרצינומה של החלב של העכבר ו-M1 מקוטב, ו 2) הערכה של פעילות מקרופאג phagocytic באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. התרבות התאית לחיות היא בשימוש נרחב phagocyציטוזה הגירה assays. מודל התרבות של התאים החיים כאן הוא פשוט, הליך מחוץ ליכולת הסתגלות (איור 2) העושה שימוש בצבע פלורסנט, cfse, המשמש לתווית התאים הייעודיים 4T1. הדבר משמש למעקב נאות של סוגי התאים במהלך הדמיה של תא חי. זמן-פקיעה הדמיה לחיות-cell שימש כדי להעריך את הפעילות phagocyt.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו הייתה ממומנת כלכלית על ידי Geran Putra Berimpak (GBP), אוניברסיטי פוטרה מלזיה: 9542800. אנחנו רוצים להודות למעבדות אגרו-ביוטכנולוגיה, מלזיה (ABI) מעבדות, ומתקן הדמיה מיקרוסקופית. תודות מיוחדות לוהד דניאל עזים לקבלת עזרה בעריכה והקלטה של הסרטון הניסיוני לעבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדנים נגד INOS מצומד FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 ומיקרו; גרם ב-1 מ"ל |
| קרבוקסיפלואורסצאין סוקסינימידיל אסטר (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 מ"ג |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | Invitrogen | D1306 | 10 מ"ג |
| DMEM/גלוקוז גבוה | HyClone | SH30003.04 | 670.0 גרם |
| סרום בקר עוברי | Tico Europe | FBSEU500 | 500 מ"ל |
| ליפופוליסכרידים | סיגמא | L4516-1MG | 1 מ"ג |
| עכבר אינטרפרון-גמא רקומביננטי | טכנולוגיות תאי גזע | 78021 | 100 ומיקרו; g |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין | Cellgro | 30-003-CI | 100 מ"ל |
| פוספט חוצץ | מלח Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 חבילה |
| טריפסין EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 מ"ל |
| 1000 ומיקרו; קצות פיפטה L | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 טיפים/מארז |
| 2 מ"ל פיפטה סרולוגית | JET BIOFIL | GSP012002 | לא פריוגני |
| 200 ומיקרו; קצות פיפטה L | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps / מארז |
| 25 סמ"ר בקבוק תרבית תאים | קורנינג | CLS430639 | תרבית רקמות מטופלת |
| צנטריפוגה עליונה ספסל | דינמיקה | FA15C | דגם: Velocity 14R |
| מכסה אדים בטיחות ביולוגית | Nuaire | NU-565-400 | דגם: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, סוג B2 קולט אדים |
| CO2/אוויר מיקסר | Chamlide (מכשיר תא חי) | FC-R-20 | FC-5 (CO2 / מערבל אוויר) עם מד הזרימה |
| מגרד תאים | NEST | 710001 | 220 מ"מ |
| חממת תאי CO2 | Panasonic | N / A | דגם: MCO-19M (UV) |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| צלחת תחתית זכוכית | Ibidi | 81218-200 | 35 מ"מ |
| NIS elements תוכנה | Nikon Instruments Inc. | זמין להורדה | |
| בקר פיפטה | CappAid | PA-100 | בקר פיפטה CappController, 0.1-100 מ"ל |
| תרמוסטט | שינקו | הופסק | JCS-33A 48 x 48 x 96.5 מ"מ |
מקורות
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
