הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Summary

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

Abstract

בתוך אורגניזמים רב-תאיים, רקמות בוגרות ואיברים להציג דרגות גבוהות של סדר בהסדרים מרחביים של התאים המרכיבים שלהם. דוגמה יוצאת דופן ניתנת על ידי epithelia חושי, שבו תאים של זהות זהה או ברור מובאים באמצעות הדבקה תא תא מראה דפוסי מישורי מאורגן מאוד. תאים מתיישרים אחד לשני באותו כיוון ומציגים קוטביות שוות ערך על מרחקים גדולים. ארגון זה של אפיתאליה בוגרת מוקם במהלך הורפוגנזה. כדי להבין כיצד ההסדר מישורי של epithelia בוגרת מושגת, זה חיוני כדי לעקוב אחר כיוון התא ואת הדינמיקה הצמיחה עם נאמנות זמן זמני גבוהה במהלך הפיתוח ב vivo. כלים אנליטיים חזקים גם הם חיוניים כדי לזהות ולאפיין מעברים מקומיים לגלובליים. הגולם הוא מערכת אידיאלית להערכת צורה מכוונת של תאים שינויים בבסיס האפיתל. גולמי פיתוח אפיתל מהווה את המשטח החיצוני של הגוף משותק, המאפשר הדמיה ארוכת טווח של בעלי חיים שלמים. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לצלם ולנתח התנהגויות תא ברמות הכללית והמקומית באפידרמיס הבטן גולמי כפי שהוא גדל. המתודולוגיה תיאר ניתן להתאים בקלות הדמיה של התנהגויות תא בשלבים התפתחותיים אחרים, רקמות, מבנים subcellular, או מודל אורגניזמים.

Introduction

כדי להשיג את תפקידם, רקמות אפיתל להסתמך באופן מלא על הארגון המרחבי של הרכיבים הסלולריים שלהם. ברוב epithelia, תאים הם לא רק ארוזים אחד נגד השני כדי ליצור שכבת האבנים מדויק, אבל הם האוריינט עצמם ביחס צירי הגוף.

החשיבות הפונקציונלית של ארגון הרקמה המדויקת ברורה באפיליה הסנסורית, כגון האוזן הפנימית של בעלי החוליות והרשתית. במקרה הראשון, השיער והתאים התומכים מתיישרים בכיוון צירית מסוים כדי לחוש ביעילות כניסות מכניות כגון קול ותנועה^1,2. באופן דומה, גוף תא קולט אור הארגון המרחבי חיוני להשגת מאפיינים אופטיים אופטימליים על ידי הרשתית³. השליטה המרחבית של מיקום התא והתמצאות היא ובכך של רלוונטיות מיוחדת לתפקוד פיזיולוגי תקין.

דרוזופילה הוא חרק מholometabolous העובר טרנספורמציה מלאה של מבנה גוף הזחל שלה באמצעות מטמורפוזה, ומעורר את הרקמות הבוגרים שלה. הגולם הוא מודל מצוין עבור הדמיה חיה לא פולשנית של מגוון רחב של אירועים דינמיים, כולל הגירה תא התפתחותית⁴, מחלקת תאים ודינמיקה הצמיחה⁵, שריר התכווצות⁶, מוות התא⁷, פצע תיקון⁸, ותא כיוון⁹. בבית האדם המבוגר,האפיתל החיצוני מראה רמה גבוהה של הסדר. זה ניתן לצפות בקלות על הסדרים של trichomes (כלומר, בליטות תא שמקורם בתאים אפיתל יחיד) ו זיפים חושים בכל רחבי פני הגוף של הזבוב¹⁰. אכן, trichomes מיושרים בשורות מקבילות המנחה את זרימת אוויר¹¹. הורפוגנזה של אפיתאליה למבוגרים וההסדר הסדור של התאים הבודדים מתחיל במהלך embryogenesis ולהגיע לשיאו במהלך שלבים גולמי. בעוד שבחטיבות תאים של העוברים, האינטרקלציות והצורה משנות את כל הסדר הקטן של הרקמה^12,13, זה בחזרה בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח, במיוחד בשלבי גולמי, כאשר הזבוב מתקרב לבגרות⁹.

מערכת Drosophila מושלמת להערכת צורת תא והתמצאות. האפידרמיס הבטן גולמי מציג יתרונות מיוחדים. בעוד הסמנים של הראש המבוגר, בית החזה, אברי המין, ואת התוספות לצמוח ולקבל תבנית מתוך שלבי זחל, היסטריפיצוצים, אשר משולבים לתוך האפידרמיס זחל, להתחיל לצמוח ולהבדיל רק על הפפריציה¹⁴. תכונה זו מאפשרת מעקב אחר כל האירועים הטמפורלית המעורבים בהקמת סדר הרקמה בשלמותו⁹.

היסטלפיצוצים מצוינים במהלך התפתחות עובריים בתנוחות מושרות בכל פלח בטן שוערת. האפידרמיס הבטן האחורי של המבוגר נובע מdorsolaterally ממוקם קנים היסטורית להציג בתוך התאים הקדמי והאחוריים^15,16. כמו מתרחבים היסטראקס, החלפת התאים האפיתל בזחל (lecs), מרעום הקנים הצלעות בלקו האמצע היוצר גיליון קונרהוט^17,18,19,20.

עבודה זו מתארת 1) מתודולוגיה להדמיה, הרכבה והדמיה חיה ארוכת טווח של הגלמים של דרוזוהילה , ו -2 שיטות אנליטיות לחקר הדינמיקה של אוריינטציה תאית וצמיחה ברזולוציה גבוהה ביותר. פרוטוקול מפורט מסופק כאן, ומכסה את כל הצעדים הנדרשים מהכנת הגלמים הראשוניים (כלומר, היערכות והדמיה) להפקת וכימות של תכונות כיווניות וכיוון. אנו גם לתאר כיצד להסיק תכונות רקמה מקומית מניתוח של שיבוטים תא. כל השלבים המתוארים הם פולשניים מינימלית ומאפשרים ניתוחים לטווח ארוך. השיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות וליישם בשלבים התפתחותיים אחרים, רקמות, או אורגניזמים מודל.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מחולק לחמישה שלבים: (1) הכנת הגלמים, (2) להכין את הגלמים להדמיה, (3) הדמיה חיה של אפיליה הגוברת הבטן, (4) הדור של פסיפסים גנטיים, (5) עיבוד נתונים וניתוח (כולל סעיפים המתארים כיצד לנתח דינמיקה של כיוון התא מקווי המתאר

1 . היערכות הגלמים לפני הדמיה

1. התרבות זבובים של גנוטיפ המתאים על בינוני רגיל בבקבוקי פלסטיק ב 25 ° c עבור 5 ימים (± 12 h) לאחר הנחת ביצים (ח. א.).
   הערה: הגלגול מתחיל בתוך הכליאה של הזחלים השלישי לתוך המקרה גולמי ב 120 h לפני 0 h לאחר היווצרות puparium (apf). מעבר זה ניתן לזיהוי בקלות, כי הזחלים מפסיקים להאכיל ולנוע והאזור המבצע נוצר (איור 1א) ב 0-12 h apf. הפופריום בתחילה רך ולבן, אך מתקשה ושיזוף בהדרגה.
2. העברת הגלמים הלבנים (0 h APF) לבקבוקון פלסטיק טרי באמצעות מברשת צבע מויסטן. בעלי חיים יכולים להישמר בטמפרטורות שונות, בהתאם לניסוי המתוכנן עד לגיל הרצוי.
   הערה: היווצרות הגולם (כלומר, pupation) מתרחש ב-12 h APF, כאשר הראש והתוספות של הזבוב המבוגר הם לגמרי everted (איור 1א). בשלב זה, המקרה גולמי מופרד לחלוטין מן הגולם, ומאפשר הסרהמלאה(איור 1א).

2. הכנת גלמים להדמיה חיה

הערה: לאחר ההיערכות, הגלמים ממופרשים ומורכבים כמתואר להלן (ראו גם איור 1).

1. להסיר גלמים מבוים מהקיר של הבקבוקון בעזרת מלקחיים.
2. הדבק את הצד הגחוני של כל גולם על שקופית זכוכית מכוסה בנייר דביק דו צדדי. הברז בעדינות על נושפות הראש (כלומר, אזור האופרקוללי) והמשטח הפנימי של הגולם עם קצות המלקחיים כדי להבטיח את הדבקה של המקרה גולמי לקלטת (איור 1א, ב).
   הערה: על פני השטח החלק הפנימי להקל על הניתוח של הנרתיק ועל החזרת הגולם.
3. התחילו בניתוח מתחת לstereomicroscope על ידי הסרת האופרציה מתוך הפופריום עם הלקחיים (איור 1ג).
4. הכניסו קצה אחד של הלקחיים בזווית רדודה בין המארז הפופל לבין משטח הגולם דרך הפתח המבצע. קורעים את הנרתיק מראש לזנב בתנופה אחת או יותר, תוך הימנעות מצביעת הגולם (איור 1ד). מקפלים בחזרה את המקרה גולמי סדוק לצדדים לרוחב כפי שאתה ממשיך להמשיך את הקצה האחורי (איור 1E).
   הערה: המקרה גולמי הוא נוקשה למדי וסדקים בקלות. במקרה של לחות גבוהה או ברקע genotypic מסוים, המקרה גולמי הופך רך יותר והקרע קשה יותר. במקרים אלה, סדיקה של המקרה גולמי ניתן לסייע על ידי החירור הקצוות שלה חופשי עם שני קצות המלקחיים.
5. הסר את הגולם מהמקרה הפתוח גולמי על ידי החדרת בזהירות מלקחיים מתחת לבעל החיים בעדינות מושך (איור 1F). הגולם יהיה דבוק לקצה הלקחיים (איור 1ג'י-י).
6. העבר את הגולם בעזרת הלקחיים לצלחת הזכוכית התחתונה והכנס אותו על טיפה קטנה של שמן הלוגן חדיר גז (איור 1I). החזק את הגולם בעדינות על ידי הצד הגחוני כדי למנוע נזק אפשרי לרקמות.
   הערה: הירידה של שמן ההלוקרבון חייבת להיות קטנה, עם קוטר של פחות ממחצית אורכו של הגולם. סכום כזה מספיק כדי לדבוק בגולם לזכוכית על ידי קפילריות ולתקן את האופטיקה למטרות טבילה בשמן.
7. מגלגלים פיסת נייר טישו רטוב בקצות המנה כדי לשמור על לחות. מכסים את הצלחת כדי למנוע התייבשות של הגלמים במהלך ההדמיה.
   הערה: ניתן לנצל גם את הגלמים הנקביים והזכרים להדמיה. אנו ממליצים להעסיק את מגזרי הבטן השלישית (AIII) כמו metamere בטן התייחסות מכיוון שהוא זהה כמעט בשני המינים במונחים של גודל, צורה, ו הפנינג.

3. הדמיה חיה של הגוברת אפיתליה הבטן

הערה: לייזר הפוך סריקת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד במטרה טבילה בשמן 40x/1.3 NA שימש הגלמים התמונה בשלבים התפתחותיים שונים.

1. מכוון את הגולם על טיפת הנפט על הצלחת הזכוכית בתחתית לפי התחום ואת התהליך להיות מוערך (g. dorsolaterally לטווח ארוך הדמיה חיה של התרחבות מוקדם של קני הראש, או דורסלי לדמות שיפוץ מאוחר רקמות שלהם התרחבות). ראה איור 1J, K ואיור 4.
2. העבר את המנה התחתונה לזכוכית המכילה את הגלמים הנטענים לשלב המיקרוסקופ והתמקד על פני השטח של אזור הבטן באמצעות האור המשודר.
   הערה: גם אם פרוטוקול זה ממוטב לדימות על מיקרוסקופים הפוכים, ניתן גם לבצע דימות על מיקרוסקופ זקוף. במקרה זה, המדגם ממוקם על במת המיקרוסקופ עם המשטח התחתון זכוכית פונה כלפי מעלה. שמן ההלו-פחמן מחזיק כל גולם על מניסקוס.
3. הגדר את פרמטרי הרכישה: 1) מספר הפרוסות של Z הוא בדרך כלל בין 20 ל-40 כדי לאפשר שחזור דו-מימדי מתאים (2D) של האפידרמיס הבטני; 2) גודל המדרגה בין פרוסה (לדוגמה, 1 מיקרון); 3) מרווח זמן להקלטה (מרווח של 5 דקות מתאים לניתוח בנאמנות גבוהה של דינמיקת כיוון התא); ו-4) רזולוציית מסגרת (לדוגמה, 1024 x 1024).
4. הפעל את לייזרים המתאים (כלומר, 488 nm ו 561 nm כדי להמחיש את GFP ו-RFP fluorophores בהתאמה) ולהתאים את כוח הלייזר ולהשיג/לקזז הגדרות כדי להמחיש את התאים המסומנים. השתמש בכוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי (בטווח 5%-20%) כדי למזער את הלבנת התמונות והתמונות.
5. הגדר באופן ידני את המיקום ואת המגבלות המתאימות של מחסנית Z עבור גלמים מרובים באמצעות השלב המונע המצורף והמיקרוסקופ מרובה מיקום תוכנה הרכישה.

4. הדור של פסיפסים גנטיים לעקוב אחר התנהגויות של שיבוטים תא

הערה: אנו מעסיקים mitotic רקומבינציה כדי לגרום פסיפסים גנטיים באפיתל הבטן דרך שילוב ספציפי לאתר (FLP/frt^{21מערכת 21,22}) (איור 2).

1. הנקבות הבתולה לחצות נושאת הלם חום-inducible מעבר בזלזול (hs-FLP), יעד זיהוי FLP (FRT) באתר גנומית ספציפי (למשל, האתר FRT במיקום 40A בזרוע L של כרומוזום 2), ו סמן הסלולר לזיהוי (למשל, Ubi-RFP. nls או Ubi-GFP. nls) המרוחק לאתר FRT, לזכרים מוטנטים נושאת אתר FRT במיקום גנומי שווה ערך (איור 2a-g).
   הערה: השפעות אוטונומיות ושאינן אוטונומיות בתוך או מחוץ שיבוטים עבור כל הפסד גנטי של הפונקציה ניתן ללמוד העסקת השימוש הספציפי האלולים מסוים באתר FRT.
2. צור FLP/FRT שיבוטים סומטיים ב היסטריפיצוצים על ידי טיפול בהלם חום בשלב השלישי הזחל הגוף של צאצאי הצלב. הדבר מבוצע על ידי מיזוג משנה את מבחנות פלסטיק המכיל את החיות באמבט מים ב 37 ° c עבור 45 דקות עד 1 h בשלב הזחלים הנודדים (LIII).
   הערה: התקופה הרגישה עבור שילוב mitotic חוזר היא השלב של G2 במחזור התאים. במהלך כל התפתחות הזחל.
3. ניקוד שיבוטים תאומים עבור היעדרות (כלומר, תאי מוטציה) או משופר (כלומר, סוג פראי תאים ספוט התאום) רמות של סמן חלבון פלורסנט מ 16 h APF ואילך (איור 2ד).
   הערה: בממוצע, 45 דקות עד 1 h בשעה 37 ° c מספקת רק 2-3 שיבוטים תאומים לאזור הריבית (למשל, קטע הבטן). הגלמים מציגים צפיפות גבוהה מדי של שיבוט (למשל, יותר מארבעה שיבוטים תאומים לכל פלח) יש להיפטר מניתוחים כמותיים נוספים.
4. עם זיהוי שיבוט, התמונה גלמים החיים בשלב הרצוי ולמשך הזמן הרצוי כפי שמתואר בסעיף הקודם.

5. עיבוד וניתוח נתונים

הערה: הנתונים מעובדים באמצעות ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

1. הבחנה בין דינמיקת כיוון התא לקווי מתאר של צומת תאים.
   1. השתמשו בפרוסות ' מחסנית Z ' שנרכשו על-ידי מיקרוסקופ משני בתלת-ממד בעזרת הפונקציה ' הקרנת עוצמה מרבית ' (mip) של imagej.
      הערה: מספר הפרוסות לכל מחסנית יש לשמור על מינימום כדי למנוע מתוך רעש מיקוד שנוצר על ידי מקרופאגים המסיירים תחת האפידרמיס.
   2. הגדר מערכת קואורדינטות מישורי המזהה ציוני דרך אמינים של רקמה (למשל, A/תא הגבול) לניתוח של כל ערכת נתונים (איור 3א).
      הערה: השימוש באותן הפניות מישורי מידע עבור כל ערכת נתונים יאפשר להשוות מספר מדידות.
   3. השתמש בתוסף orientationj (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) של imagej^23,24 על קצות תאים מקומיים כדי לקבל ערכי אוריינטציה איכותיים וכמותיים. התוסף מעניק שכבות מקודדות בצבע על תמונות קלט המבוססות על הכיוונים המקומיים ומספק ערכים מספריים כאשר הם משמשים במצב כמותי (איור 3b-b ' ' ו-' באיור c-c ' ').
      הערה: תוסף orientationj מבוסס על מבנה המבנה, 2 x 2 מטריקס של ערכי ערכים נגזרים הדרגתי וכיווניות²³(ראה^{הפניות 23,24} עבור תיאור מפורט).
   4. השתמש באפשרות הפצת Orientationj כדי להתאים את הכיוונים לקצות התאים של קוד הצבע ביחס למערכת קואורדינטות מישורי (כלומר, מפות כיוון קצה התא) (איור 3b). אפשרות ההפצה נמצאת תחת תפריט התוסף ב-imagej. ההגדרות הקיימות הן: החלון סיגמא-סיגמה = 1 פיקסל; Spline מעוקב = הדרגתי; מינימום קוהרנטיות = 20%; אנרגיה מינימלית = 1%. כיוון ההדפסה של התאים מוצגים כתמונה מקודדת בצבע העושה שימוש באפשרות סקר הצבע של התוסף (Hue = אוריינטציה; רוויה = בקוהרנטיות; ובהירות = תמונת קלט).
      הערה: אזורים המכילים פלואורסצנטית רקע אינם מספקים מידע כיווני ויש לכלול אותם באופן ידני מהניתוח. הגדרות הסף הגבוה מפחיתות את הפיקסלים הנחשבים בתמונות המעובדות.
   5. השתמש באפשרות מדידה Orientationj כדי לכמת את הכיוונים הסלולריים ואת היישור תא תא התא (כלומר, התאמה) (איור 3ג). האפשרות ' מדידה ' נמצאת תחת תפריט התוסף ב-imagej. צור אזורים קטנים סמוכים שאינם חופפים של ריבית (rois) של משקל אחיד (64 x 64 פיקסלים, כ 20 יקרומטר x 20 יקרומטר) בתוך האזור הכבוש את היסטתקיעות (איור 3ג).
   6. חשב את הכיוון המקומי הדומיננטי (כלומר, את הכיוון הממוצע בין התאים השכנים-ממוצעי הקצוות התא כיוון הממוצע) וקוהרנטיות מן ROIs. התוכנה מחשבת את הכיוון השולט וקוהרנטיות מקומיות בתוך כל ROI (איור 3ג).
      הערה: הערכים הגדולים והקטנים ביותר של המבנה טנסור המשוער על ידי Orientationj מועסקים כדי לחשב קוהרנטיות כיחס בין ההבדל שלהם ואת הסכום שלהם. האפשרות ' קוהרנטיות ' חסומה בין ערכים של 0-1. ערך של 1 מציין אחידות יישור מלאה, בעוד שערך 0 מציין אזורים איזוטרופיים ללא יישור.
   7. מבחינה סטטיסטית מנתחים את האוריינטציה המחושבת ואת ערכי הקוהרנטיות מתמונות מרובות באמצעות חבילות תוכנה חופשית כגון העבר²⁵. נתוני ציר הזמן, כגון ערכי כיוון (במעלות), מתוארים כראוי על-ידי סטטיסטיקות כיווניות.
   8. באמצעות התוכנה, חשב את הכיוון הממוצע והשונות המעגלית עבור כל ערכה של הפצות כיוון. המשמעות הסטטיסטית של ההפרש בין התפלגות הכיוונים בין ה-גנוסוגים או התנאים השונים נקבעת באמצעות מבחן מרידיה-ווטסון-וילר (W-test) עבור הפצות שוות.
   9. לחשב את המשמעות הסטטיסטית של ההפרש בקוהרנטיות החלת מבחן הקולמוגואז הלא פרמטרית (K-S test). הצגת נתונים באופן גרפי בהתאם לצורך (חלקות קוטביות, תרשימי עמודות, מחלקות תיבות, וכו ').
2. הדינמיקה הצמיחה של שיבוטים התא
   הערה: השלבים הבאים מאפשרים אחזור פרמטרים גיאומטריים וצורות עבור תאים מתמונות MIP של 2D המכילות את השכפול (ים) של ריבית. להשוואות בין שיבוטים מרובים, יש לרכוש תמונות עם אותן הגדרות.
   1. אזורי שיבוט של פלח על-ידי ציור קווי המתאר שלהם בעזרת הכלי בחירה חופשית באמצעות imagej.
   2. חישוב פרמטרי גיאומטריות וצורות באמצעות הכלי ' קביעת מדידות ' של imagej בתפריט ' ניתוח '. הפעל את אפשרויות מתארי האזור, ההיקף, ההתאמהוהצורה.
      הערה: הדבר יאפשר אחזור של פרמטרים גיאומטריים מגוונים, כולל האזור (סכום הפיקסלים בתוך השכפול). היקף (סכום הפיקסל של גבול השכפול), יחס הגובה-רוחב (AR, היחס בין הצירים העיקריים והקטנים של האליפסה הגדולה ביותר המתאימה ביותר שחרוט לתוך גבול השכפול) וזווית הכיוון (כלומר, זווית הציר העיקרי של השכפול יחסית לגבול הanteroposterior).
   3. חישוב יחסי לא ממדיים ממידות אלה מאחזר פרמטרי צורה. אלה כוללים מעוגלות (4 x [אזור]/π x [ציר גדול]²), חספוס (אזור האחידות/אזור קמור), ומעגליות (4π x [אזור]/[היקף]²).
      הערה: כל אחד מפרמטרי הצורה מייצג את דרגת הסטייה של המשובטים מצורות אידיאליות כגון עיגול או גוף קמור מתוחם, וכולם מוגבלים בין ערכים של 0 ו-1. ערכים השווים ל -1 מצביעים על סימטריה מרבית (כלומר, מורכבות מינימלית).
   4. מבחינה סטטיסטית מנתחים פרמטרי גיאומטריות וצורות בין גנוטיפים או תנאים שונים באמצעות Microsoft Excel ו/או בעבר. המשמעות הסטטיסטית של ההפרש נקבעת באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט שאינו משויך לממוצע שווה או לא פרמטרית קולמוגורוב-סמירנוף K-S-מבחן עבור הפצות שוות בין תנאים. נתונים יכולים להיות מוצגים באופן גרפי כנדרש (למשל, תרשימי עמודות, מגרשים תיבת, וכו '). ראה איור 5.

Results

הפרוטוקול המתואר לעיל מכסה את הכנת הגלמים של דרוזוהילה להדמיה ארוכת טווח והליכים לניתוח כיוון התאים והדינמיקה של האפידרמיס בבטן. על-ידי החלת מתודולוגיה זו ניתן ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה של הגלמים המתפתחים לתקופות של עד 48 h ללא הלבנת שמות משמעותית או הרעלת תמונות. תמונות המתארות את האפידרמיס הבטני (למשל, היסטלקס ו-LECs) בנקודות זמן שונות ומגלמים מכוונים בזוויות שונות מוצגים באיור 4. הניתוח הבא של סרטים אלה מאפשר זיהוי וכימות של הדינמיקה של שינויים ...

Discussion

הסדר הארוך טווח הוא מאפיין חיוני של היחידות הפיסיולוגיים התפקודית ביותר. במהלך הורפוגנזה, מושגת ההזמנה באמצעות שילוב של הוראות מורכבות המיושמת עם דיוק בזמן התיכון והמרחב. מגביל מרובה ומדורגת משולבים הסדרים רקמות סטריאומוקלדות.

קוטביות וכיווניות הינן קריטיות לסידור מרחבי במהלך הפיתוח. קוטביות מרמזת על שבירת. סימטריה במהלך הפיתוח השגת סימטריה היא הכרחית לקביעת הanteroposterior העובריים (A/P) ו-dorsoventral (D/V) צירים וארגון מבוגר²⁶. מעבר לתפקיד מוקדם זה, האסימטריות המקומ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תוכנת	ניתוח-ImageJ		ניתוח נתונים
Drosophila	emAtpa::GFP	-	זנים המשמשים לאיסוף נתונים
Drosophila	hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	זנים המשמשים לאיסוף נתונים
Dumont 5 מלקחיים	FST	11251-20	קוטר 1.5 מ"מ לחיתוך
לוחות תחתונים מזכוכית	מחצלת Tek	P35G-0.170-14-C	גלמי הרכבה לאיסוף נתונים
שמן הלוקרבון 27	סיגמא-אולדריץ'	9002-83-9	גלמי הרכבה
מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך	Zeiss	LSM700	איסוף נתונים
סטריאומיקרוסקופ	Leica	DFC365FX	הדמיה של הגלמים במהלך דיסקציה