מאמר שיטה

בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 בינואר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את כלי המיקרו מאזורים מרובים של מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות lissencephalic וגירנאריים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד של כלי מיקרו ממערכת העצבים המרכזית (CN) מבוצע בדרך כלל על ידי שילוב של רקמה קורטיקלית מבעלי חיים מרובים, לרוב מכרסמים. גישה זו מגבילה את חקירת מחסום הדם-מוח (BBB) לקליפה ואינה מאפשרת השוואה אישית. פרויקט זה מתמקד בפיתוח של שיטת בידוד המאפשר השוואה של יחידת נוירונימי (NVU) מאזורים מרובים של ה-CN: קליפת המוח, המח האופטי, האונה האופטית, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת המוח, בראש וחוט השדרה. יתר על כן, פרוטוקול זה, שפותחה במקור עבור דגימות murine, הותאם בהצלחה לשימוש ברקמות המוח מפני מינים קטנים וגדולים של בעלי חוליות שמהם אנו גם מסוגלים לבודד כלי מיקרו מתוך מערכת האונה הלבנה חומר לבן. שיטה זו, כאשר היא משויכת לאימונואולבלינג, מאפשרת כימות של ביטוי חלבונים והשוואה סטטיסטית בין אנשים, סוג רקמה או טיפול. הוכחנו את הישימות הזאת על ידי הערכת שינויים בביטוי החלבון במהלך הencephalomyelitis הנסיוני הניסיוני, מודל murine של מחלה נוירודלקתית, טרשת נפוצה. בנוסף, כלי מיקרו מבודדים על ידי שיטה זו ניתן להשתמש עבור יישומים במורד כמו qPCR, RNA-seq, ואת האבן המערבית, בין היתר. למרות שאין זה הניסיון הראשון לבודד את כלי המיקרו-מיקרו-משתמשים ללא שימוש בדיסוציאציה האוטרטית או אנזימטית, היא ייחודית באופן מיוחד להשוואת אנשים יחידים ולאזורי ה-CN המרובים. לפיכך, היא מאפשרת חקירה של מגוון של הבדלים שעשויים אחרת להישאר מעורפל: מנות CN (קליפת, המוח התחתון, האונה האופטית, גזע המוח, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת השדרה), סוג של רקמת CN (חומר אפור או לבן), אנשים, קבוצות טיפול ומינים ניסיוניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח שלנו הוא האיבר. החשוב ביותר בגופנו מסיבה זו, שמירה על הומאוסטזיס המוח למרות גורמים חיצוניים שעלולים לעורר סטייה מנורמליות היא עדיפות. על פי כמה חוקרים, כ 400-500 מיליון שנה לפני1, בעלי חוליות פיתחו את מה שאנחנו יודעים כעת כמכשול הדם במוח (bbb)2,3. זה "גדר" המגן מפעילה את ההשפעה הגדולה ביותר על פני מערכת העצבים המרכזית (CN) הומאוסטזיס ופונקציות על ידי ויסות היטב את ההובלה של יונים, מולקולות, תאים בין דם לבין המערכת המרכזית של ה-CN. כאשר BBB מופרת, המוח הופך להיות פגיע חשיפה רעילה, זיהום, ודלקת. לפיכך, bbb בתפקוד משויך רבים, אם לא כולם, הפרעות נוירולוגיות התפתחותית נוירולוגית4,5,6.

הפונקציה המתוחכמת של bbb מיוחסת למערכת העצבים הייחודית של היחידה לנוירוכלי (nvu)2,3. תאים אנדותל מיוחדים מאוד, קרום הלב, ו astrocytic הרגליים הקצה הם הרכיבים הסלולריים של nvu2,3. מטריקס החילוץ שנוצר על ידי תאים אלה הוא גם חיוני הפיזיולוגיה של nvu ו bbb2,3. למרות שרכיבים סלולאריים ומולקולריים חיוניים של nvu נשמרים בין החוליות, טרוגניות מדווחת בקרב הזמנות ומינים7,8. עם זאת, מגבלות טכניות לעכב את היכולת שלנו לשקול באופן מלא את ההבדלים הללו בנוירוביולוגיה, ביו-רפואית, או מחקר הטרנסלבותית.

בגלל זה, הרחבנו את האזור בידוד מיקרוכלי ספציפי שיטה ספציפית כדי להפוך אותו לרלוונטי למינים רבים מכל חמשת קבוצות בעלי החוליות: דגים, דו-חיים, זוחלים, ציפורים ויונקים. הפרוטוקול מתואר לשימוש בחוליות lissencephalic קטנות וגדולות, כולל מינים עם רלוונטיות טרנסלתית9. בנוסף, אנו כוללים אזורים אחרים של ה-CN שאינם נחקרים לפני בהקשר זה, אלא רלוונטיים לנוירופיזיולוגיה ועם השלכות קליניות עצומות: ההיפותלמוס, יותרת המוח והחומר הלבן. לבסוף, בדקנו את היכולת של שיטת בידוד זו ככלי אמין כדי לזהות שינויים בביטוי החלבון לאורך nvu ו/או bbb9,10,11. כהוכחה למושג, הצגנו כיצד לקבוע שינויים בביטוי VCAM-1 ו-JAM-B במהלך השנה, תוך שימוש בשיטת הבידוד ולאחריה immunofluorescence.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים של המחקר הנוכחי הם בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת קליפורניה (UC), דיוויס מוסדיים טיפול בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). טיפול בעלי חיים ב-UC דייוויס מוסדר על ידי מספר משאבים עצמאיים, כבר מוכר באופן מלא על ידי האגודה להערכת והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים הבינלאומי (AAALAC) מאז 1966. רקמות המין העצמי הושגו ממחלקת UCD של מדעי החי, המעבדה למדעי הבשר. רקמות ה-CN של רזוס קופי מאני התקבלו מהמחלקה לחקר הפרימטים הלאומית של קליפורניה (NIH P51OD011107). ללא הרדמה, המתת חסד או נמק בוצע על ידי צוות מעבדה על חזירים ומקופי. לכן אין המלצות מיוחדות לגבי הנושאים הללו.

הערה: שיטה זו אומתה עבור מינים מרובים, אך הפרוטוקול שסופק מתאים יותר ישירות לרקמות העכבר והפורצין. הפרטים הנוגעים לאונה האופטית אינם תקפים בעת שימוש בדגימות של יונקים. כל החומרים הביוסוכנים חייבים להיות מטופלים במתקן ביולוגי ברמת בטיחות (BSL) מתאים. יש לטפל בחומרים רעילים. מתחת למכסה המנוע כל הפסולת הרפואית הביומסוכנת והפסולת הרעילה חייבים להיות מושלך כראוי.

1. הכנה

  1. הכינו פתרונות (שולחן 1) לפחות יום אחד קדימה.
    הערה: קשה מאוד לפזר 70 משקל מולקולרי kDa (MW) dextran. יעיל יותר לאפשר לפתרון לערבב בין לילה מכוסה בסרט פרפין או בנייר. הפרוטוקול דורש את השימוש שני פתרונות MV-2 שונים בהתאם לדגימה תחת חקירה. ב 18% תוספי מפריד ביעילות את המיאלין מן הגלולה microvessel יקרוכלי בעת ביצוע הפרוטוקול על דגימות קטנות lissencephalic. עם זאת, היא מפתחת הכתם של המיאלין בתוך הממשק של רקמות ה-CN של דגימות גדולות, כמו גם את ההיפותלמוס ואת יותרת ההיפופיזה מדגימות קטנות. הכתם הזה מונע על ידי שימוש ב -20% דקטרן.
  2. להכין היטב שקופיות על ידי טעינת 50 μL לכל טוב של פולי ליזין ולתת יבש 2 h בטמפרטורת החדר (RT), רצוי בארון בטיחות ביולוגית-class 2 (תואר שני). . אל תייבש יותר מדי שטפו פעמיים בתמיסת מלח (PBS) ושמרו במקרר עד שהוא מוכן לשימוש.

2. מערכת הניתוח לחיתוך רקמות של Lissencephalic קטן בעלי חוליות הדגימה

הערה: המאמר מדגים את יישום הפרוטוקול על C57BL6/J, בן 10 שבועות, ~ 25 g, עכבר זכר.

  1. הכינו 2 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה עם 5 מ"ל ו 1 mL, בהתאמה, של הפתרון MV-1 לכל דגימה. . שמרו על הצינורות בקרח
  2. הרדמה
    1. עכברים מורדם על ידי הזרקה תוך הצפק של קטמין, xylazine, ו-איזופרומאזין קוקטייל הרדמה ב 100/10/3 mg למשקל משקל הגוף ותרסיס עם 70% אתנול. לאשר הרדמה על ידי הערכת העדר palpebral ו הדוושה רפלקסים על ידי נגיעה בעין וצובט רגל, בהתאמה.
    2. באמצעות קופסת הרדמה. מהאינדוקציה
    3. דגים וצפרדעים מורדם ב 1% Tricaine ב דג מחזיק מיכל מים או הפתרון של המצלצל אמפיבי (טבלת חומרים), בהתאמה.
    4. לטאות מורדם על ידי קירור ב 4 ° צ' לפני המתת חסד.
  3. ראשו של בעל החיים במספריים מנתחים, מקלף את העור בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את הגולגולת, ולחתוך עם מספריים לגראנז ' דרך מגנום הפוראמאן (איור 1א).
  4. לנתח את המוח עם מרית ולהעביר לצינור 15 מ"ל עם פתרון MV-1. . שמור על הקרח
  5. לאחזר את בלוטת יותרת המוח של סלה turcica של הגולגולת עם מלקחיים והעברה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 mL עם פתרון MV-1. . שמור על הקרח
  6. להסיר את העור ואת השריר כדי לחשוף את העמודה החוליות. חותכים את הגפיים, כלוב הצלעות והאברים הפנימיים (איור 1ב).
  7. לנתח את חוט השדרה באחת משתי השיטות המתוארות להלן. לאחר מכן, העבר לצינור החרוט של 5 מ"ל עם פתרון MV-1. . שמור על הקרח
    1. לבצע כריתת למינציה על ידי גזירה rostral לכיוון caudal עם מספריים לגראנז ', החל דרך החוליה הצווארי של החוליות, עד להגיע חוט המותניים.
    2. לבצע השטיפה ב caudal לכיוון rostral ברחבי החוליה המותני השדרה עם המחט 18 G ו 10 mL מזרק טעון עם MV-1 פתרון (איור 1ג, ד).
      הערה: שיטה זו פועלת רק עם דגימות קטנות מאוד, בעיקר מכרסמים (< 100 גרם).
  8. באמצעות היקף מבתר, לחתוך את ריר sac מן חוט השדרה עם מספריים באביב ולהסיר את הקרום הנותר עם בחירת כפול (איור 2).
  9. מעבירים את המוח לצלחת פטרי, ומשתמשים בהיקף מבתר, מסירים את הקרום בעזרת בחירת כפולה (איור 2א – ג).
  10. בלו את מנורות הריח והתלמוס עם מלקחיים, מספריים איריס ומספריים באביב. הסרת מקלעת הדמית. מכל חללי המוח הקפד להסיר את כל מקלעת ה-דמית.
    הערה: מקלעת כוראיד ונורות הריח הם מקור מסיבי של זיהום. בניגוד BBB, נימים אלה הם מאוד מדורגים ואת התוצאות של הניסויים הבאים יהיה להתפשר אם הם לא יוסרו.
  11. באמצעות מלקחיים, הפרד את אזורי ה-CN הנפרדים: קליפת, מוח מוחי, גזע המוח, האונה האופטית (לא על דגימות היונקים) וההיפותלמוס.

3. ניתוח רקמות המעי הגבוה מדגימה של בעלי חוליות

הערה: פרוטוקול זה משתמש ברקמות שהתקבלו מ-חזירי מתוך מטבחיים. לכן, לא מתואר הרדמה, המתת חסד, או נקרופסי, או מוצג כאן.

  1. הובלה ברקמות הגוף ב 0.946 L (32 עוז) היסטולוגיה מיכל טעון עם MV-1 פתרון בתוך חזה קרח/דלי.
  2. באמצעות היקף הניתוח, להסיר את קרום העור עם בחירת כפול, מלקחיים, מספריים איריס, ומספריים באביב מכל רקמת השיטה. הקפד להסיר את כל החלקים של מקלעת דמית מן החדרים המוח.

4. מערכת העור המהומוזציה

הערה: הדבר יעיל יותר כששני חוקרים עוסקים בתהליך ההעצמה: האחד מבתר את הקרום מתחת לסטריאוסקופ והשני הומוגניזציה של הרקמות הטחון. בדרך זו, הרקמות מוחזרות במהירות לדלי הקרח ושמרו על קור.

  1. מניחים כל אזור מערכת התחתית על צלחת פטרי עם ~ 1 mL של פתרון MV-1. באמצעות להב חד הקצה, הבשר את הרקמה להשיג 1 – 2 מ"מ חתיכות.
    1. עבור דגימה קטנה בעלי חוליות, השתמש בצלחת פטרי של 100 מ"מ x 20 מ"מ.
    2. עבור דגימה גדולה בעלי חוליות, השתמש בצלחת פטרי של 150 מ"מ x 15 מ"מ.
  2. הומוגון של דוגמית בעלי חוליות קטנה (שולחן 2 ושולחן 3)
    1. העבר את קליפת המוח, המוח העצמי, גזע המוח, העין האופטית, חוט השדרה כדי ~ 1 mL של פתרון MV-1 בודד 10 mL פוטר-Elvehjem מטחנת רקמת זכוכית עם מצופיסל באמצעות העברת צנרת. הוסף 5 מ ל של פתרון MV-1 והמגון כל רקמה (~ 10 משיכות). העברה לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מ ל . שמרו על הצינורות בקרח
      הערה: עבור בעלי חוליות קטנות, 5 או 4, עם או בלי האונה האופטית, בהתאמה, 10 mL-Elvehjem מטחנות ו 15 מ"ל שפופרות חרוט נדרשים.
    2. העבר את ההיפותלמוס ואת יותרת ההיפופיזה עם מלקחיים ל ~ 100 μL של הפתרון MV-1 בתוך שפופרת בודדת 1.7 mL והומוהגון בזהירות עם מיקרופטסל זכוכית. לשטוף כל מיקרופטסל עם ~ 1 mL של פתרון MV-1. . שמור על הקרח
      הערה: עבור בעלי חוליות קטנות, 2 מיקרופטני זכוכית ו-1.7 מנורות mL נחוצים.
  3. הומוגון של דגימה גדולה של בעלי חוליות (טבלה 4 ושולחן 5)
    1. באמצעות פיפטה העברה, להעביר את הרקמה הטחון לתוך מטחנת רקמת זכוכית 55 mL-Elvehjem עם מצוסל ולהצמיד לתקורה. הוסף מחצית מכמות הנפח המומלצת של פתרון MV-1, בהתאם לחלק ה-CN הספציפי המהווה הומוגניים (טבלה 5).
    2. הפעל את התקורה במהירות נמוכה מאוד (~ 150 rpm) ובזהירות להזיז את צינור הזכוכית למעלה ולמטה עבור כ 30 s.
    3. בטל את השטירר, הוסף פתרון MV-1 וחזור על שלב ה4.3.2 עד לקבלת שאיפה אחידה.
    4. העברה לשפופרת חרוט ב50 mL. . שמור על הקרח
    5. שטוף את המטחנה במים מפוהים. בין כל רקמת העור
      הערה: עבור בעלי חוליות גדול 5 או 4, עם או בלי חומר לבן, בהתאמה, 50 mL הצינורות חרוט נדרשים. כמו כן, 2 (2) 15 מ ל שפופרות חרוט נדרשות עבור ההיפותלמוס ואת יותרת הבלוטת.

5. טיהור מיקרוכלי

  1. רקמת צנטריפוגה הומומטר כתוצאה משלב 4.2.1, 4.2.2, או 4.3.4 ב 2,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. ממשק לבן גדול של המיאלין יהיה ליצור על גבי כדורי מיקרולים אדמדם. . להיפטר מהסופרנטנמלים
    1. דוגמית בעלי חוליות קטנות (טבלה 2 ושולחן 3)
      1. השהה מחדש את קליפת המוח, המוח השני, גזע המוח, האונה האופטית וכדורי חוט השדרה ב-5 מ ל של תמיסת הקרח-2-הקרה-מיטה עם פיפטה של 5 מ"ל (~ 10 הריקות). הוסף 5 מ ל של הקרח קר MV-2 פתרון לכל השעיה ולערבב בזהירות על ידי היפוך הצינורות.
      2. השהה מחדש את ההיפותלמוס ואת כדורי יותרת ההיפופיזה עם 1 מ ל של פתרון MV-2.
    2. דגימה גדולה של בעלי חוליות (שולחן 4 ושולחן 5)
      1. הוסף 20 מ ל של הקרח קר MV-2 פתרון לקליפת המוח, מוח מוחי, גזע המוח, וכדורי השדרה microvessel מיקרושוט. השהה מחדש את כדורי על ידי ערבוב על האקדח שייקר שפופרת, ערבוב ב 40 rpm עבור ~ 5 דקות. איזון הכרכים של צינורות חרוט של קליפת המוח, המוח השני, גזע המוח, ואת השעיה חוט השדרה על ידי הוספת יותר MV-2 פתרון.
      2. השהה מחדש את ההיפותלמוס ואת כדוריות יותרת ההיפופיזה ב-5 מ ל של פתרון MV-2 עם פיפטה של 5 מ"ל (~ 10 הריקות). הוסיפו 5 מ ל של תמיסה בקירור-2-ice להשעיות וערבבו בזהירות על ידי היפוך הצינור.
  2. צנטריפוגה ב 4,400 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
  3. נתק בזהירות את שכבת המיאלין העבה והצפופה על הממשק הנוזלי מקירות הצינור על ידי הסתובבות איטית של הצינורות והתרת הסופרנטאנט לעבור לאורך הקירות.
  4. התעלם מממשק המיאלין והנוזל וכבה את הקיר הפנימי של כל צינורית עם מרית עטופה במטלית נייר נמוכה. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות, הסר את שכבת המיאלין מכל ההיפותלמוס ומצינור יותרת ההיפופיזה על-ידי העברת הסדר בזהירות עם פיפטה העברה.
  5. תמחק את הנוזלים העודפים. עם מגבון מעוות בנייר נמוך השהה מחדש כל גלולה בעלת 1 מ ל של פתרון MV-3 באמצעות עצות בכריכה נמוכה. . שמרו על הצינורות בקרח

6. הללויה וסינון מיקרוכלי

  1. שופכים את תמיסת MV-3 הקרה בתוך כוסות בודדות עבור כל אזור הcn. שמרו על 4 ° c.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות, השתמש ב-10 mL של פתרון MV-3 לכל 50 mL. סך של 6 – 7 כוסות הוא הכרחי בהתאם אם האונה האופטית כלולה.
    2. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות, השתמש 30 mL של פתרון MV-3 לכל 100 מ"ל גביע. סך של 6 – 7 ספלים כוסות הוא הכרחי, תלוי אם החומר הלבן כלול.
  2. מניחים מסננת תא על גבי צינורית חרוט 50 mL. השתמש באחד לכל אזור של מערכת השניה. השתמש מסננת 100 יקרומטר עבור הקליפה, גזע המוח, האונה האופטית, חוט השדרה, ובלוטת היותרת. השתמש מסננת תא 70 יקרומטר עבור המוח ההמח וההיפותלמוס.
  3. רטוב כל מסננת עם 1 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון.
  4. הוסף יותר מענה MV-3 לשעיות המוכנות בשלב 5.5 עם פיפטה סרוולוגית תוך ערבוב כדי להימנע מאגרגטים. בזהירות לטעון מיקרואוניות על גבי מסננת. לשטוף עם תמיסת MV-3 קר-קרח.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות (טבלה 2 ושולחן 3), הוסף 10 – 15 מ ל של התמיסה mv-3 עם פיפטה סרוולוגית ולשטוף עם 5 מ ל של פתרון mv-3.
    2. עבור דגימות של בעלי חוליות גדולות, להוסיף 20 מ ל של הפתרון mv-3 עם הצנרת סרולוגית ולשטוף עם 10 מ ל של פתרון mv-3.
  5. להרכיב את יחידת הסינון על ידי הצבת מסנן ניילון 20 יקרומטר נטו על מחזיק מסנן שונה (איור 2ד), אחד לכל אזור במערכת.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות (טבלה 2 ושולחן 3), השתמש במחזיקי מסנן שעברו 25 מ"מ עבור קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח, האונה האופטית וחוט השדרה. השתמש 13 מ"מ מחזיקי מסננים שונה עבור ההיפותלמוס ואת יותרת הבלוטת.
    2. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות (טבלה 4 ושולחן 5), השתמש 47 mm שונה מחזיקי מחזיק הקליפה, מוח מוחי, גזע המוח, ואת חוט השדרה. השתמש ב -25 מ"מ עבור. ההיפותלמוס ויותרת הבלוטת
  6. מסנן במקום על גבי צינור 50 mL ו מסנן רטוב עם 5 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון לוודא מאגר הופך את מחזיק המסנן לצינור חרוט.
  7. להעביר את המיקרוכלים מיקרו (משלב 6.4) על גבי מסנן 20 יקרומטר ניילון נטו לשטוף את המיקרוכלים עם 5 – 10 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון.
  8. לשחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים לטבול אותו בגביע המכיל את הקרח קר MV-3 פתרון מוכן בשלב 6.1.
  9. נתק את המיקרוכלים מהמסנן על ידי ניעור בעדינות במשך 30 ס מ. לדגימות של בעלי חוליות קטנות, יוצקים את תוכן הגביע בשפופרת חרוט של 15 מ ל. לדגימות של בעלי חוליות גדולות, יוצקים את תוכן הגביע בשפופרת חרוט 50 mL.
  10. צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של הקרח קר MV-3 פתרון באמצעות מאגד נמוך מחייב הצנרת.
    1. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות, להעביר את ההשעיה (משלב 6.10) לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.7 mL ו צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
      הערה: ספין זה מבוצע על צנטריפוגה העליון שחקן במהירות מקסימלית (~ 20,000 x g) כדי להבטיח תשואה חזקה.
    2. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות, להעביר את ההשעיה משלב 6.10 לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 5.0 mL, להוסיף 4 מ ל של הפתרון MV-3, ו צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.

7. מכתים חיסוני

הערה: המטאוקסילין והאאוזין (H & E) כתמים בוצעו על בדיקת זוחלים, דו-שלבית ודגים כהוכחה למושג הכדאיות של הפרוטוקול. לכן, אין המלצה לאימונוולאבילינג עבור הפרטים הללו.

  1. הסירו את הסופרנטאנט. מצינורות המיקרוצנטריפוגה
  2. השהה מחדש את הגלולה ב-PBS 1 x מעוקר באמצעות קצה מחייב נמוך של פיפטה (טבלת חומרים). שמרו על המיקרוכלים מיצירת אגרגטים באמצעות ליטוף מספר פעמים. עבור דגימות בעלי חוליות קטנות (שולחן 3), השתמש ~ 100 μl – 2000 μl לפי גודל הגלולה. עבור דגימות בעלי חוליות גדולות (שולחן 5), השתמש ~ 1,000 μl – 4000 μl לפי גודל הגלולה.
  3. באמצעות טיפ בכריכה נמוכה, העבירו את כלי המיקרו-מכלים לשיקופיות, היזהרו להוסיף אותם למרכז הבאר, והימנעות מהקירות הצידיים.
  4. הגדר את השקופיות היטב, נחשף, בתוך תואר שני, ולתת יבש 20 עד 30 דקות ב RT.
    הערה: נפח גבוה יחסית של 1x PBS משמש כדי למנוע היווצרות צבירה. בשל כך, יש להניח לשקופיות להתייבש לפני הקיבעון כדי לוודא שכלי המיקרוכלים מוחזקים בציפוי פולי-ליזין.
  5. הסרת שיורית 1x PBS ידי ליטוף עם החוצה עם פיפטה העברה, להוסיף 200 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ו דגירה עבור 30 דקות ב RT.
  6. פיפטה את הפתרון הקבע ולשטוף 3x עם 200 μl של 1x PBS עבור 5 דקות ב RT.
    הערה: כתמים של H & E על דגים, דו-כלים וזוחלים, ובוצעו בשלב זה.
  7. הוסף 200 μL של חסימת מאגר לשקופית היטב ו-הדגירה עבור 60 דקות ב 37 ° c.
  8. הסר את מאגר חסימת עם מפית העברה והוסף 200 μL של קוקטייל הנוגדן העיקרי בנוגדן מדלל (טבלת חומרים). מודטה ב -4 ° c ללילה.
  9. פיפטה את קוקטייל הנוגדן העיקרי ולשטוף 3x עם 200 μL של PBS 1x עבור 5 דקות ב RT.
  10. טען את קוקטייל הנוגדן המשני (טבלת חומרים) מדולל ב-1X PBS ו דגירה עבור 2 h ב RT, מוגן מפני אור.
  11. פיפטה את קוקטייל הנוגדן המשני לשטוף 3x עם 200 μL של 1x PBS עבור 5 דקות ב RT, מוגן מפני אור. לאחר השטיפה האחרונה לנתק את המסגרת של שקופית היטב למחוק את כל העודפים 1x PBS עם מחיקה נמוכה נייר המוך.
  12. להוסיף שמיכות, נוזל מדיום לדעוך בינוני, ו 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים. תנו להתייבש לילה בשעה RT מוגנים מאור.
  13. לאחר הייבוש, המשך להגן מפני אור על תיבת שקופיות ב-4 ° צ' עד שהוא מוכן למיקרוסקופיה ולרכישת נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרואוניות הראו את כל הרכיבים הסלולאריים. הפנימיים של יחידת נוירונימי2,3 שימוש באחת מהטסיות של תא הדבקה של מולקולה 1 ("פקאם", הידועה גם בשם CD31) או isolectin IB4 (גליקופרוטאין המחבר את הגליקקליום של תאי האנדותל) לתאי האנדותל, טסיות הגדילה הנגזרת הצמיחה-β (PDGFRβ) או תא העצב-glial אנטיגן 2 (NG2) עבור קרום הלב ו aqu in-4 (AQP4) עבור הקצה של הרגליים astrocytic (איור 3a, B) ממחיש כי רכי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bbb כולל את המאפיינים הייחודיים של המוח מיקרוקובלטורה בתאי השלד בשילוב עם ארכיטקטורה מתוחכמת של הדוק, חסיד-, "יתד-שקע"-צמתים, ולוחיות הדבקה קריטי עבור הומאוסטזיס2,3,19. המאפיינים של תאים אנדותל הם המושרה ומתוחזק על ידי קרום הלב ואת התהליכים המקיפים את הרגל הקצה astroglia2,3,19. מיקרוטבקוטבלטורה BBB מציגה קוטביות (כלומר, תבנית ביטוי סימט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר קרוז-Orengo נתמך על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, בית הספר לרפואה וטרינרית להתחיל כספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10X PBSThermoFisherBP39920משמש לחסימה ודילול נוגדנים.
20% PFAמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15713-Sמשמש כקיבוע (4% PFA)
70,000 MW DextanMillipore Sigma9004-54-0משמש לתמיסת MV-2
Adson ForcepsFine Science Tools (FST)11006-12משמש להסרת שרירים ועור
Adson Ocps, איכות הסטודנטFST91106-12זהה לאמור לעיל אך זול יותר
סרום בקר אלבומין (BSA)Millipore SigmaA7906-100Gמשמש לתמיסת MV-3, חסימה ומדלל נוגדנים
Corning 100 μ מסננת תאים mMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m מסננת תאיםMillipore SigmaCLS431751-50EA
קורנינג עבודת שולחן טיפים מחייבים נמוכיםMillipore SigmaCLS4151זהה למטה אך זול יותר.
Cultrex פולי-D-ליזיןR& D3439-100-01משמש לציפוי שקופיות
חמור נגד עיזים IgG-ALEXA 555ThermoA21432משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד עכבר IgG-ALEXA 488ThermoA21202משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד ארנב IgG-ALEXA 488ThermoA21206משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד ארנב IgG-ALEXA 647ThermoA31573משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד חולדות IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
פיק רקמות דו-שינייםFST18067-11משמש להסרת קרומי המוח ומקלעת הכורואיד
Dumont #3c מלקחייםFST11231-20משמש לטיפול ברקמות CNS עדינות ו/או קטנות יותר (כמו יותרת המוח)
Dumont #7 מלקחייםFST11274-20משמש לדיסקציה וטיפול במערכת העצבים המרכזית
Dumont #7 מלקחיים, סטודנטFST91197-00זהה לאמור לעיל אך זול יותר
EP Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008איכות טובה יותר מהטיפים לעיל (יקר יותר).
מלקחיים עדינים במיוחד,FST11151-10משוננים המשמשים להסרת עצם
מספריים עדינים, חדFST14060-09משמש להסרת חזיר ושק דוראלי
שק זכוכית עלי זכוכית 1.5 מ"ל הומוגנייזר מטחנת רקמות צינור מיקרוצנטריפוגה, חבילה של 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10משמש להיפותלוס קטן ויותרת המוח.
עיזים אנטי-CXCL12, ביוטינילציהPeproTech500-P87BGBTמשמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ: 1:20.
עיזים נגד JAM-BR& DAF1074משמש כנוגדנים ראשוניים להערכת דלקת עצבית. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עיזים נגד עכבר IgG-ALEXA 488ThermoA11001משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד עכבר IgG-ALEXA 555ThermoA21424משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד PDGFR ובטא;מו"פ DAF1042משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עיזים נגד ארנב IgG-ALEXA 555ThermoA21249משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד ארנב IgG-DyLight 488Thermo35552משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד חולדות IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
מלקחיים Graefe, קצה מעוקל, 1X2 שינייםFST11054-10השתמש להחזקת רשת מסנן ניילון וניעור
HBSS, מאגר 1X עם סידן ומגנזיוםקורנינג21-022-CMמשמש לתמיסת MV-1
HEPES, מאגר נוזלי 1Mקורנינג25-060-CIמשמש לתמיסת MV-1
איזולקטין GS-IB4-ביוטין-XXThermoFisher Scientific (תרמו)I21414גליקופרוטאין מבודד מקטניות Griffonia simplicifolia הקושר שאריות D-galactosyl של תאי אנדותל glycocalysx. משמש למיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של עופות וחזירים. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
LaGrange מספריים, משונניםFST14173-12משמשים לדיסקציה של גולגולת וכריתת למינקטומיה (למעט חזיר ומקוק)
Millicell EZ slide 8-well unitMillipore SigmaPEZGS0816
Mouse anti-CLDN5Thermo35-2500משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי CNS מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עכבר אנטי-GGT1Abcamab55138משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עכבר אנטי אנושי CD31R& DBBA7משמש כנוגדנים ראשוניים על מיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של פרימטים. ריכוז מומלץ: 16.5 μ גרם/מ"ל.
עכבר anti-NFMThermoRMO-270משמש כנוגדנים ראשוניים על מיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עכבר אנטי-&אלפא;SMAThermoMA5-11547משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
ניילון מסנן נטו, גלילMillipore SigmaNY6000010לייזר חתוך לדיסקים נטו מסנן בקוטר 13 מ"מ. משמש להיפותלוס ותירי קטן ויותרת המוח.
רשתות סינון ניילון, 25 מ"מMillipore SigmaNY2002500משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנות, למעט ההיפותלמוס והיפופיזה. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.
רשתות סינון ניילון, 47 מ"מMillipore SigmaNY2004700משמש לרקמות מקוק וחזיר CNS, למעט היפותלמוס והיפופיזה.
מגיב אנטי-דהייה זהב ProLong עם DAPIThermoFisherP36935משמש לכיסוי שקופיות.
ארנב אנטי-AQP4Millipore SigmaA5971משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
ארנב נגד LSRMillipore SigmaSAB2107967משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
ארנב אנטי-NG2Millipore SigmaAB5320משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
ארנב נגד OSPAbcamab53041משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 1 μ גרם/מ"ל.
ארנב אנטי-VE-CadherinAbcamab33168משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
ארנב אנטי-ZO-1Thermo61-7300משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
חולדה נגד CD31Becton DickinsonBD 550274משמש כנוגדנים ראשוניים למיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של עכברים. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
חולדה נגד GFAPThermo13-0300משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי CNS מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
חולדה נגד VCAM-1Becton DickinsonBD 553329משמש כנוגדנים ראשוניים להערכת דלקת עצבית. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
תמיסת צלצול סטרילי, תאגיד צפרדעאלדוןIS5066משמש להרדמה אמפיבית
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355משמש כנוגדנים משניים לסימון נוגדנים ראשוניים ביוטיניליים. דילול מומלץ של 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357משמש כנוגדנים משניים לסימון נוגדנים ראשוניים ביוטיניליים. דילול מומלץ של 1:500.
מספריים כירורגיים, חדיםFST14002-12משמשים להסרת שרירים ועור
מספריים כירורגיים, חדים-קהיםFST14001-16משמשים לעריפת ראש (למעט חזיר ומקוק)
מחזיק מסנן Swinnex, 13 מ"מMillipore SigmaSX0001300שונה על ידי חיתוך לייזר. משמש להיפותלוס ותירי קטן ויותרת המוח.
מחזיק מסנן Swinnex, 25 מ"מMillipore SigmaSX0002500שונה בחיתוך לייזר. משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנים, למעט היפותלמוס ויותרת המוח. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.
מחזיק מסנן Swinnex, 47 מ"מMillipore SigmaSX0004700שונה בחיתוך לייזר. משמש לרקמות מקוק וחזירים במערכת העצבים המרכזית, למעט היפותלמוס ויותרת המוח.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277משמש לחסימה ודילול נוגדנים.
Wheaton 120 Vac Overhead StirrerVWR (ספק DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)משמש לרקמות מקוק וחזיר CNS עם מטחנת רקמות של 55 מ"ל, למעט היפותלמוס והיפופיזה.
מטחנת רקמות Wheaton Potter-Elvehjem עם עלי PTFE, 10 מ"לVWR (ספק DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנים, למעט היפותלמוס והיפופיזה. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.
מטחנת רקמות Wheaton Potter-Elvehjem עם עלי PTFE, 55 מ"לVWR (ספק DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)משמש לרקמות מקוק וחזירים במערכת העצבים המרכזית, למעט היפותלמוס והיפופיזה.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MV 1

מאמרים קשורים