מאמר שיטה

בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 בינואר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את כלי המיקרו מאזורים מרובים של מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות lissencephalic וגירנאריים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד של כלי מיקרו ממערכת העצבים המרכזית (CN) מבוצע בדרך כלל על ידי שילוב של רקמה קורטיקלית מבעלי חיים מרובים, לרוב מכרסמים. גישה זו מגבילה את חקירת מחסום הדם-מוח (BBB) לקליפה ואינה מאפשרת השוואה אישית. פרויקט זה מתמקד בפיתוח של שיטת בידוד המאפשר השוואה של יחידת נוירונימי (NVU) מאזורים מרובים של ה-CN: קליפת המוח, המח האופטי, האונה האופטית, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת המוח, בראש וחוט השדרה. יתר על כן, פרוטוקול זה, שפותחה במקור עבור דגימות murine, הותאם בהצלחה לשימוש ברקמות המוח מפני מינים קטנים וגדולים של בעלי חוליות שמהם אנו גם מסוגלים לבודד כלי מיקרו מתוך מערכת האונה הלבנה חומר לבן. שיטה זו, כאשר היא משויכת לאימונואולבלינג, מאפשרת כימות של ביטוי חלבונים והשוואה סטטיסטית בין אנשים, סוג רקמה או טיפול. הוכחנו את הישימות הזאת על ידי הערכת שינויים בביטוי החלבון במהלך הencephalomyelitis הנסיוני הניסיוני, מודל murine של מחלה נוירודלקתית, טרשת נפוצה. בנוסף, כלי מיקרו מבודדים על ידי שיטה זו ניתן להשתמש עבור יישומים במורד כמו qPCR, RNA-seq, ואת האבן המערבית, בין היתר. למרות שאין זה הניסיון הראשון לבודד את כלי המיקרו-מיקרו-משתמשים ללא שימוש בדיסוציאציה האוטרטית או אנזימטית, היא ייחודית באופן מיוחד להשוואת אנשים יחידים ולאזורי ה-CN המרובים. לפיכך, היא מאפשרת חקירה של מגוון של הבדלים שעשויים אחרת להישאר מעורפל: מנות CN (קליפת, המוח התחתון, האונה האופטית, גזע המוח, ההיפותלמוס, בלוטת יותרת השדרה), סוג של רקמת CN (חומר אפור או לבן), אנשים, קבוצות טיפול ומינים ניסיוניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח שלנו הוא האיבר. החשוב ביותר בגופנו מסיבה זו, שמירה על הומאוסטזיס המוח למרות גורמים חיצוניים שעלולים לעורר סטייה מנורמליות היא עדיפות. על פי כמה חוקרים, כ 400-500 מיליון שנה לפני1, בעלי חוליות פיתחו את מה שאנחנו יודעים כעת כמכשול הדם במוח (bbb)2,3. זה "גדר" המגן מפעילה את ההשפעה הגדולה ביותר על פני מערכת העצבים המרכזית (CN) הומאוסטזיס ופונקציות על ידי ויסות היטב את ההובלה של יונים, מולקולות, תאים בין דם לבין המערכת המרכזית של ה-CN. כאשר BBB מופרת, המוח הופך להיות פגיע חשיפה רעילה, זיהום, ודלקת. לפיכך, bbb בתפקוד משויך רבים, אם לא כולם, הפרעות נוירולוגיות התפתחותית נוירולוגית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים של המחקר הנוכחי הם בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת קליפורניה (UC), דיוויס מוסדיים טיפול בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). טיפול בעלי חיים ב-UC דייוויס מוסדר על ידי מספר משאבים עצמאיים, כבר מוכר באופן מלא על ידי האגודה להערכת והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים הבינלאומי (AAALAC) מאז 1966. רקמות המין העצמי הושגו ממחלקת UCD של מדעי החי, המעבדה למדעי הבשר. רקמות ה-CN של רזוס קופי מאני התקבלו מהמחלקה לחקר הפרימטים הלאומית של קליפורניה (NIH P51OD011107). ללא הרדמה, המתת חסד או נמק בוצע על ידי צוות מעבדה על חזירים ומקופי. לכן אין המלצות מיוחדות לגבי הנושאים הללו.

הערה: שיטה זו אומתה עבור מינים מרובים, אך הפרוטוקול שסופק מתאים יותר ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרואוניות הראו את כל הרכיבים הסלולאריים. הפנימיים של יחידת נוירונימי2,3 שימוש באחת מהטסיות של תא הדבקה של מולקולה 1 ("פקאם", הידועה גם בשם CD31) או isolectin IB4 (גליקופרוטאין המחבר את הגליקקליום של תאי האנדותל) לתאי האנדותל, טסיות הגדילה הנגזרת הצמיחה-β (PDGFRβ) או תא העצב-glial אנטיגן 2 (NG2) עבור קרום הלב ו aqu in-4 (AQP4) עבור הקצה של הרגליים astrocytic (איור 3a, B) ממחיש כי רכי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bbb כולל את המאפיינים הייחודיים של המוח מיקרוקובלטורה בתאי השלד בשילוב עם ארכיטקטורה מתוחכמת של הדוק, חסיד-, "יתד-שקע"-צמתים, ולוחיות הדבקה קריטי עבור הומאוסטזיס2,3,19. המאפיינים של תאים אנדותל הם המושרה ומתוחזק על ידי קרום הלב ואת התהליכים המקיפים את הרגל הקצה astroglia2,3,19. מיקרוטבקוטבלטורה BBB מציגה קוטביות (כלומר, תבנית ביטוי סימט.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר קרוז-Orengo נתמך על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, בית הספר לרפואה וטרינרית להתחיל כספים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10X PBSThermoFisherBP39920משמש לחסימה ודילול נוגדנים.
20% PFAמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15713-Sמשמש כקיבוע (4% PFA)
70,000 MW DextanMillipore Sigma9004-54-0משמש לתמיסת MV-2
Adson ForcepsFine Science Tools (FST)11006-12משמש להסרת שרירים ועור
Adson Ocps, איכות הסטודנטFST91106-12זהה לאמור לעיל אך זול יותר
סרום בקר אלבומין (BSA)Millipore SigmaA7906-100Gמשמש לתמיסת MV-3, חסימה ומדלל נוגדנים
Corning 100 μ מסננת תאים mMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m מסננת תאיםMillipore SigmaCLS431751-50EA
קורנינג עבודת שולחן טיפים מחייבים נמוכיםMillipore SigmaCLS4151זהה למטה אך זול יותר.
Cultrex פולי-D-ליזיןR& D3439-100-01משמש לציפוי שקופיות
חמור נגד עיזים IgG-ALEXA 555ThermoA21432משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד עכבר IgG-ALEXA 488ThermoA21202משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד ארנב IgG-ALEXA 488ThermoA21206משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד ארנב IgG-ALEXA 647ThermoA31573משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
חמור נגד חולדות IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
פיק רקמות דו-שינייםFST18067-11משמש להסרת קרומי המוח ומקלעת הכורואיד
Dumont #3c מלקחייםFST11231-20משמש לטיפול ברקמות CNS עדינות ו/או קטנות יותר (כמו יותרת המוח)
Dumont #7 מלקחייםFST11274-20משמש לדיסקציה וטיפול במערכת העצבים המרכזית
Dumont #7 מלקחיים, סטודנטFST91197-00זהה לאמור לעיל אך זול יותר
EP Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008איכות טובה יותר מהטיפים לעיל (יקר יותר).
מלקחיים עדינים במיוחד,FST11151-10משוננים המשמשים להסרת עצם
מספריים עדינים, חדFST14060-09משמש להסרת חזיר ושק דוראלי
שק זכוכית עלי זכוכית 1.5 מ"ל הומוגנייזר מטחנת רקמות צינור מיקרוצנטריפוגה, חבילה של 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10משמש להיפותלוס קטן ויותרת המוח.
עיזים אנטי-CXCL12, ביוטינילציהPeproTech500-P87BGBTמשמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ: 1:20.
עיזים נגד JAM-BR& DAF1074משמש כנוגדנים ראשוניים להערכת דלקת עצבית. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עיזים נגד עכבר IgG-ALEXA 488ThermoA11001משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד עכבר IgG-ALEXA 555ThermoA21424משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד PDGFR ובטא;מו"פ DAF1042משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עיזים נגד ארנב IgG-ALEXA 555ThermoA21249משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד ארנב IgG-DyLight 488Thermo35552משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
עיזים נגד חולדות IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021משמש כנוגדנים משניים. דילול מומלץ של 1:200.
מלקחיים Graefe, קצה מעוקל, 1X2 שינייםFST11054-10השתמש להחזקת רשת מסנן ניילון וניעור
HBSS, מאגר 1X עם סידן ומגנזיוםקורנינג21-022-CMמשמש לתמיסת MV-1
HEPES, מאגר נוזלי 1Mקורנינג25-060-CIמשמש לתמיסת MV-1
איזולקטין GS-IB4-ביוטין-XXThermoFisher Scientific (תרמו)I21414גליקופרוטאין מבודד מקטניות Griffonia simplicifolia הקושר שאריות D-galactosyl של תאי אנדותל glycocalysx. משמש למיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של עופות וחזירים. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
LaGrange מספריים, משונניםFST14173-12משמשים לדיסקציה של גולגולת וכריתת למינקטומיה (למעט חזיר ומקוק)
Millicell EZ slide 8-well unitMillipore SigmaPEZGS0816
Mouse anti-CLDN5Thermo35-2500משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי CNS מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עכבר אנטי-GGT1Abcamab55138משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עכבר אנטי אנושי CD31R& DBBA7משמש כנוגדנים ראשוניים על מיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של פרימטים. ריכוז מומלץ: 16.5 μ גרם/מ"ל.
עכבר anti-NFMThermoRMO-270משמש כנוגדנים ראשוניים על מיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
עכבר אנטי-&אלפא;SMAThermoMA5-11547משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
ניילון מסנן נטו, גלילMillipore SigmaNY6000010לייזר חתוך לדיסקים נטו מסנן בקוטר 13 מ"מ. משמש להיפותלוס ותירי קטן ויותרת המוח.
רשתות סינון ניילון, 25 מ"מMillipore SigmaNY2002500משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנות, למעט ההיפותלמוס והיפופיזה. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.
רשתות סינון ניילון, 47 מ"מMillipore SigmaNY2004700משמש לרקמות מקוק וחזיר CNS, למעט היפותלמוס והיפופיזה.
מגיב אנטי-דהייה זהב ProLong עם DAPIThermoFisherP36935משמש לכיסוי שקופיות.
ארנב אנטי-AQP4Millipore SigmaA5971משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
ארנב נגד LSRMillipore SigmaSAB2107967משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
ארנב אנטי-NG2Millipore SigmaAB5320משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
ארנב נגד OSPAbcamab53041משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 1 μ גרם/מ"ל.
ארנב אנטי-VE-CadherinAbcamab33168משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
ארנב אנטי-ZO-1Thermo61-7300משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית מכל הדגימות. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
חולדה נגד CD31Becton DickinsonBD 550274משמש כנוגדנים ראשוניים למיקרו-כלי מערכת העצבים המרכזית של עכברים. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
חולדה נגד GFAPThermo13-0300משמש כנוגדנים ראשוניים במיקרו-כלי CNS מכל הדגימות. דילול מומלץ של 1:200.
חולדה נגד VCAM-1Becton DickinsonBD 553329משמש כנוגדנים ראשוניים להערכת דלקת עצבית. ריכוז מומלץ: 5 μ גרם/מ"ל.
תמיסת צלצול סטרילי, תאגיד צפרדעאלדוןIS5066משמש להרדמה אמפיבית
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355משמש כנוגדנים משניים לסימון נוגדנים ראשוניים ביוטיניליים. דילול מומלץ של 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357משמש כנוגדנים משניים לסימון נוגדנים ראשוניים ביוטיניליים. דילול מומלץ של 1:500.
מספריים כירורגיים, חדיםFST14002-12משמשים להסרת שרירים ועור
מספריים כירורגיים, חדים-קהיםFST14001-16משמשים לעריפת ראש (למעט חזיר ומקוק)
מחזיק מסנן Swinnex, 13 מ"מMillipore SigmaSX0001300שונה על ידי חיתוך לייזר. משמש להיפותלוס ותירי קטן ויותרת המוח.
מחזיק מסנן Swinnex, 25 מ"מMillipore SigmaSX0002500שונה בחיתוך לייזר. משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנים, למעט היפותלמוס ויותרת המוח. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.
מחזיק מסנן Swinnex, 47 מ"מMillipore SigmaSX0004700שונה בחיתוך לייזר. משמש לרקמות מקוק וחזירים במערכת העצבים המרכזית, למעט היפותלמוס ויותרת המוח.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277משמש לחסימה ודילול נוגדנים.
Wheaton 120 Vac Overhead StirrerVWR (ספק DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)משמש לרקמות מקוק וחזיר CNS עם מטחנת רקמות של 55 מ"ל, למעט היפותלמוס והיפופיזה.
מטחנת רקמות Wheaton Potter-Elvehjem עם עלי PTFE, 10 מ"לVWR (ספק DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)משמש ברוב רקמות מערכת העצבים המרכזית של בעלי חוליות קטנים, למעט היפותלמוס והיפופיזה. משמש לקופי מקוק וחזירים, היפותלמוס ויותרת המוח.
מטחנת רקמות Wheaton Potter-Elvehjem עם עלי PTFE, 55 מ"לVWR (ספק DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)משמש לרקמות מקוק וחזירים במערכת העצבים המרכזית, למעט היפותלמוס והיפופיזה.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MV 1

מאמרים קשורים