הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60295

⸱

23 בינואר 2020

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שלושה פשוטים מחוץ לגוף הרחב, שיטת ההגירה למרחקים ארוכים, שיטת ההגירה של תרבות השיתוף, והטיפול בטיפול בכימותרפיה-הערכת באופן קולקטיבי את התפקודים של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאים אנדותקיים וה אינטראקציה עם האינטרנוירונים הבינכולינרגיות.

תקציר

תפקידה של ואסילטורה המוח בפיתוח מערכת העצבים והאטיולוגיה של הפרעות במוח הוא צובר יותר ויותר תשומת לב. המחקרים האחרונים שלנו זיהו אוכלוסייה מיוחדת של תאים כלי דם, תאי האנדותל החדרית, כי לשחק תפקיד קריטי בהגירה והפצה של האינטרנוירונים במוח הקדמי של GABAergic במהלך פיתוח עובריים. זה, ביחד עם הפונקציות האוטונומיות שלהם הסלולר, מרמז על תפקידים חדשניים של תאי המוח הנוירותל בפתולוגיה של הפרעות נפשיות כמו סכיזופרניה, אפילפסיה, ואוטיזם. כאן, תיארנו שלושה שונים בתוך מבחנה מחוץ לספר כי באופן קולקטיבי להעריך את הפונקציות של תאי האנדותל החדרית והאינטראקציה שלהם עם משולבת GABAergic. השימוש באלה אומר, במיוחד בהקשר אנושי, יאפשר לנו לזהות את הקשר בין תאי האנדותל החדרית והפרעות במוח. מאמר זה הם פשוט, עלות נמוכה, הניתנים לצפיה, וניתן להתאים בקלות לכל סוג תא חסיד.

מבוא

תאי האנדותל יוצרים את הציפוי של כלי הדם ומתווכים בתפקודים חשובים הכוללים תחזוקה של חדירות הקיר, רגולציה של זרימת הדם, צבירת טסיות דם והיווצרות כלי דם חדשים. במוח, תאי האנדותל מהווים חלק ממכשול מוחי קריטי ששולט בחוזקה על חילופי חומרים בין המוח לבין מחזור הדם1. המחקרים שלנו בעשור האחרון זיהו תפקידים נוירוגניים הרומן של תאים אנדותל המוח כי יש השלכות משמעותיות על התפתחות המוח והתנהגות2,3,4,5. הראינו כי העכבר מתחלקים מראש המוח הוא vascularized על ידי שני סוגי המשנה ברורים של כלי, כלי הקיבול ואת כלי הקיבול, כי שונים באנטומיה, מקור, ופרופיל התפתחותי2. תאים אנדותל בטנה תת אלה שני כלי הקיבול להראות הבדלים שונים פרופילים גנים שלהם ביטוי. בעוד בתאי האנדותל המהירה ביותר לבטא גנים הקשורים דלקת ותגובה חיסונית, תאים אנדותל המוח מועשר באופן ייחודי ביטוי של גנים הקשורים בדרך כלל נוירוגנזה, הגירה עצבית, כימוטווניות, ו אקסון הדרכה3. תאים המוח הבין-חדרית גם הבית הספר מסלול מאותת הרומן, כי הוא נבדל מתוך מסורתית עצביים המסורתית נגבה מסלול5. במקביל עם הביטוי הגנטי שלה, תאי האנדותל החדרית נמצאו כדי לווסת הגירה והפצה של הביננוירונים GABAergic בקליפת המוח המתפתח. במהלך פיתוח עובריים, תאי האנדותל החדרית עוברים הגירה למרחקים ארוכים לאורך מעבר-הדרגתי של הבנגאני-על כדי להקים את רשת כלי הדם הפריחדרית2,3. מסלול נדידה זה משתקף יום מאוחר יותר על ידי האינטרנוירונים. הגירה האינטרנוירונים אינטראקציה גופנית עם הרשת מראש בנוי כלי דם periventricular ולהשתמש בו כמו מחבל להגיע ליעד הסופי שלהם בקליפת המוח. בנוסף למשחק כמצע פיזי, תאי האנדותל החדרית משמשים כמקור לאותות הניווט לצורך העברת נוירונים. מדריכי הגירה של התאים הבין-מנחים להגירה ומסדיר את דפוסי ההפצה הסופיים4. פגמים בהגירה והפצה משויכים להפרעות נוירופסיכיאטריות כגון אוטיזם, אפילפסיה, סכיזופרניה ודיכאון6,7,8,9,10. לכן, לימוד של פונקציות תא אנדותל המוח והשפעתם על הגירה הבין-תאית בהקשר האנושי הופך קריטי לטיפול בפתוגנזה של הפרעות אלה.

יצרנו תאים אנושיים בעלי כדוריות המוח האנטי-חדרית מתאי גזע עובריים אנושיים במעבדה שלנו11, באמצעות תא גזע המושרה pluriפוטנטי (ipsc) טכנולוגיה12,13. כדי לאמת אם תאי הגוף האנושי הפריבאלי מחקים בנאמנות את תאי האנטי-בתים של העכבר, ועל מנת לאמוד את השפעתם על הגירה בין-חדרית, פיתחנו שלושה בתוך מבחנה: שיטת הגירה ארוכת שנים, שיטת הגירה של תרבות שותפה, ושיטת הכימותרפיה-אטרקציה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים עבור אלה שאומר בפרוטרוט. כל שלושת התוספות מבוססים על השימוש בתוספים לתרבות הסיליקון כדי ליצור טלאי מלבני קטן של תאים (של ממדים קבועים) מוקפים בשטח נטול תאים. מרחק ההעברה מוערך על-ידי מדידת המרחק בין המיקומים הסופיים של תאים מהגבול של התיקון המלבני שהותווה ביום 0. בתוך שיטת ההגירה ארוכת הטווח, תאי האנדותל האנושיים הקיימים מתפעינים כטלאי במרכז המנה 35 מ"מ, והמרחקים שבהם התאים מחושבים במשך זמן ארוך. בשנת שיתוף תרבות הגירה התיקון, תאים אנושיים המוח האנושי שיתוף הזרע עם interneurons אנושיים כמו תיקון אחד בצלחת 35 mm. התקנה זו מאפשרת בדיקה של ההשפעה של אינטראקציות פיזיות ישירות של שני סוגי תאים אלה על שיעור ההגירה של האינטרנוירונים. שיטת הכימותרפיה-אטרקציה מודדת את הגירה של האינטרנוירונים בתגובה לרמזים אטרקטיביים לכימותרפיה המופרשים על-ידי תאי האנדותל האנושיים. האינטרנוירונים הם שנזרע כטלאי מלבני, עם תאי האדם הפריתאלי האנושי ושליטה בתאי האנדותל שאינם הפריקיים שנזרע כטלאים בגודל דומה בכל צד. כל אחד מתיקוני התא מופרדים על-ידי פער ללא תא של 500 μm. תגובה של האינטרנוירונים מוערך על ידי כימות מספר התאים שהועברו לעבר תאים אנדותל החדרית לעומת שליטה בתאי אנדותל שאינם הפריחדרית.

הספק האלה מספקים הערכה איתנה של פונקציות התא האנושי הפריציאלי והשפעתם על הגירה בין-תאית. כיוונון הרומן של שיטת העברת היקף ושיתוף תרבות בינעירוניות מספק שטח פנוי לתא בטווח סנטימטרים (~ 1-1.5 ס מ) כדי לאפשר זיהוי של הגירה למרחקים ארוכים. סיכום של התכונות של בחני שלנו לעומת הפופולרי אחרים בחני מוצגת בטבלה 1. באופן קולקטיבי, בחני המתואר כאן ישמש פלטפורמה להערכת "חולה" תאים אנדותל המוח הביננוירונים שנוצר מ iPSCs של הפרעות בראש כמו סכיזופרניה, אוטיזם או אפילפסיה. מספר זה יכול לשמש גם כדי לקבוע כיצד תנאים שונים (למשל, מעכבי, ליגנדס, RNAi) משפיעים על העברת תאים. לבסוף, מספר זה יכול להיות ממוטב עבור סוגי תאים אחרים כדי למדוד הגירה למרחקים ארוכים, כימותרפיה-הגירה או תא התא ההגירה מתווכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות ואחסנה של תאים אנושיים בעלי המוח האנושי

  1. שמור על התאים האנושיים בעלי המוח האנושי על ממברדת המרתף מצופה (ראה טבלת חומרים) 6-צלחות היטב בינונית התא הפריטאלי (E6 medium המכיל 50 Ng/Ml-A, 100 Ng/mL FGF2 ו 5 ΜM נגבה) ב 37 ° צ' ו 5% CO2. . שנה בינונית כל יום חלופי
  2. הפשרת מטריצת קרום המרתף ב 4 ° c, ולעשות פתרון 1:100 על ידי דילול זה בינונית DMEM/F12 בינוני. מעיל כל הבאר של 6-היטב צלחת עם 1 mL של פתרון מטריקס. הצלחות הדגירה ב 37 ° צ' לפחות 1 h לפני השימוש.
  3. הניחו לתאי האנדותל האנושיים הרגילים להגיע לשטף של 80%-90%. . מרוב מדיום מבאר שטוף את הבארות פעם אחת עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי 1x לבאר.
  4. ניתוק תאים על-ידי הוספת 1 mL של פתרון דיסוציאציה של תא (ראה טבלת חומרים) לבאר. מודקון ב 37 ° c עבור 5 דקות. לאחר 5 דקות, להוסיף 1 מ ל של המדיום התא הפריטתל החדרית. העבר את פתרון התאים לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל.
    הערה: אנו משתמשים במאקטאז עבור הדיסוציאציה התאית כאן, בניגוד ל טרילקל בסעיפים 3 ו -4.
  5. בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לבשל את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מדיום התא הפריטאלי של המוח.
  6. ספירת תאים חיים בשיטת האי-הכללה הכחולה. תאי זרעים בלוחות מצופי מטריקס טריים בצפיפות של 1.2 x 105 תאים/cm2. מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  7. מאגר האדם בתאי האנדותל האנושית על ידי cryopreserving זמנת בינוני בהקפאה (90% המוח תא אנדותל בינונית ו 10% DMSO).
    1. הנתק ולאסוף תאים הבאים שלבים 1.3 ו 1.4 לעיל. ספירת תאים בפתרון לפי שיטת ההדרה הכחולה של הטריפי.
    2. בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. ומשהה את הגלולה בגובה 5 x 106 תאים/mL של הקפאת בינונית.
    3. לחלק 1 מ ל של הקפאת בינונית פלוס תאים לכל קריובקבוקון. מניחים את הבקבוקונים בחדר מלא האיזופנול וקריר לילה ב-80 ° c ב-1 ° c/min. העברת מבחנות למיכל חנקן נוזלי ביום שלמחרת לאחסון ארוך טווח.

2. הכנת תאים בעלי החיים האנושיים לצורך שיטת העריכה

  1. הניחו לתאי האנדותל האנושיים הרגילים להגיע ל-70%-80%.
  2. נתק תאים בעקבות השלבים 1.3 עד 1.5 כמתואר לעיל. ספירת תאים בשיטת האי-הכללה הכחולה.

3. הכנת האינטרנוירונים של האדם האנושי לצורך שיטת העריכה

הערה: תא גזע בהשפעת האדם (iPSC)-שמקורם באינטרנוירונים ובמדיום העצבי היו נרכשים מסחרית (ראו טבלת חומרים). הנוירונים מופקים על ידי הבחנה של הייצור האנושי הנגזר של שורה iPSC בעקבות פרוטוקול שפותחה על ידי היצרן. התאים היו מופשרים ומתורבתים בהתאם לפרוטוקול של היצרן.

  1. הפשרת האינטרנוירונים האנושיים האנושית והתרבות אותם בצלחת 12-באר במשך שבועיים עד שליטה של 70%-80%.
  2. ביום השימוש, פתרון הדיסוציאציה החמימה של התא (ראה טבלת חומרים) ומידה של מדיום עצבי ב-37 ° c במשך 10 דקות לפני שימוש.
  3. מרוב בינוני מכל מבנה. המכיל את התאים כביסה תאים עם 1 מ ל של PBS 1x סטרילי לכל טוב.
  4. ניתוק תאים על-ידי הוספת 0.5 mL של פתרון טרום-מחומם של הדיסוציאציה לכל הטוב ו-מודטה ב-37 ° צ' עבור 5 דקות. הוסף 1 מ ל של בינוני עצבי לבאר. העבר פתרון תא לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל. . בעדינות, כדי לנתק את גושי התאים
  5. בתאי צנטריפוגה ב 380 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ומכה את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של מדיום עצבי. ספירת תאים חיים בשיטת האי-הכללה הכחולה.

4. הכנת תאים בעלי השליטה האנושית לצורך שיטת שליטה

הערה: שליטה בתאי האנדותל האנושיים הנגזרים ובינוני התאים האנדותל, נרכשומסחרית (לוח חומרים). תאי האנדותל האלה מופקים על-ידי הבחנה של שורה iPSC של האדם הנגזר לגורל אנדותל בעקבות פרוטוקול שפותח על ידי היצרן. התאים היו הופלו ומתורבתים על מצע Fibronectin בהתאם לפרוטוקול של היצרן. פיברוטין-צלחות מצופות הוכנו בעקבות פרוטוקול היצרן.

  1. הפשרת בקרת התאים האנושיים והתרבות אותם בצלחת 6-באר לשטף של 80%-90%.
  2. ביום השימוש, פתרון הדיסוציאציה החמה של התאים (ראה טבלת חומרים) ומידה של מדיום אנדותל ב37 ° c במשך 10 דקות לפני שימוש.
  3. מרוב המדיום. מכיל את התאים כביסה תאים עם 1 מ ל של PBS 1x סטרילי לכל טוב.
  4. ניתוק תאים על-ידי הוספת 0.5 mL של פתרון טרום-מחמם דיסוציאציה לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הוסף 1 mL של בינונית תא אנדותל כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה. העבר פתרון תא לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל.
  5. בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. ומשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל. של מדיום התא האנדותל ספירת תאים חיים בשיטת האי-הכללה הכחולה.

5. הכנת מוסיף תרבות אחת

  1. הפשרת 1 מ"ג/mL למינציה בתמיסה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
  2. מעיל מספר מתאים של 35 מ"מ מנות עם 0.01% פולי-L-אורלך (1 מ ל לכל מנה). מיכל המטבח בטמפרטורת החדר עבור לפחות 1 h.
  3. לדלל 1 מ"ג/mL למינציה בפתרון 1:300 במים סטרילי לריכוז הסופי של 3.3 μg/mL מיד לפני השימוש.
  4. מפחת לגמרי את האורלים. ממנה כל מנה לשטוף כל מנה ביסודיות 3x עם מים סטריליים ומלא לגמרי כדי למנוע את הרעלת התאים פולי-L-המושרה.
  5. הוסף 1 מ ל של 3.3 μg/mL למינציה בפתרון לכל מנה ו-דגירה ב 37 ° צ' לילה או לפחות 1 h. הסר את התמיסה הלמינציה ממנה מיד לפני השימוש.
    הערה: לחלופין, יש לאחסן את המנות המכילות מלמינציה ב-4 ° c. באמצעות שימוש בכלים בחממה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  6. חותכים שלושה צדדים של אחד היטב של הוסף תרבות שתי היטב סיליקון (איור 1א) שימוש בלהב סטרילי כדי ליצור הוספה של הכנסה אחת (איור 1B).
    הערה: שמרו על הכנס השני היטב המחובר בחוזקה למשטח האריזה המקורית תוך כדי גזירה כדי להבטיח גזירה חלקה ולהגן על ההיסוס של התוספת.
  7. . מרוב הצלחות משוגרות בתמיסה
    הערה: אין לשטוף את הכלים באמצעות PBS או מים עקרים לאחר למינציה בדגירה. משטחים רטובים ימנעו הדבקה הדוקה של הוספת התרבות.
  8. הסר את התוספת האחת עם מלקחיים סטריליים והכנס אותה למרכז הכלים פולי-אל-מצופה למינציה. לחץ לאורך קצות התוספת כדי לתקן אותו על פני השטח של המנה.
  9. הפוך בזהירות את המנה הפוכה כדי לוודא שההוספה מדבקה היטב.
  10. שמור את המנה הפוכה וסמן את הגבול של תא ההוספה באמצעות סמן שחור קבוע עם קצה דק במיוחד (איור 1ג).

6. שיטת ההגירה למרחקים ארוכים

  1. השהה את האינטרנוירונים האנושיים בריכוז של 3 x 104 תאים/70 μl של מדיום עצבי. Seed 70 μL של פתרון התא בתוך כל הוספה של תרבות אחת.
    הערה: הצפיפות של האינטרנוירונים היא לפי המלצת היצרן.
  2. להשעות את התאים האנושיים המוח האנושי בריכוז של 3 x 104 תאים/70 μl של מדיום התא הפריטאלי המוח. Seed 70 μL של פתרון התא בתוך כל הוספה של תרבות אחת.
    הערה: מספר תאי האנדותל האנושי הפריתאלי שנזרע ביחס 1:1 עם מספר הנוירונים שנזרע.
  3. הוסף 1 מ ל של בינוני עצבי בצלחת העצב כדי למלא את האזור סביב הכנס ולמנוע את הציפוי מייבוש. באופן דומה, להוסיף 1 מ ל של מדיום התא הפרידיקל המוח בצלחת תא המוח הפריטאלי.
    הערה: הוסף בינוני לאט לאורך קצה המנה כך שההוספה לא תהיה מופרעת.
  4. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים אינם דולף מתוך תא ההוספה.
  5. התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 24 שעות דגירה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי התאים מחוברים כראוי ואין דליפה לילה.
  6. לאחר 48 h של זריעה, להסיר בעדינות את ההכנסה באמצעות tweezer סטרילי. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא נותרת ללא הפרעה (יום 0).
  7. להסיר בינוני ממנה תא העצב ולהוסיף 1 מ ל של בינוני עצבי טרי. באופן דומה, להסיר את המדיום מתוך צלחת התא הפריטאלי המוח ולהוסיף 1 מ ל של המדיום החדש של תא אנדותל המוח.
    הערה: הגדר מספר נדרש של מנות ותקן עם 4% לחצי הראשון עבור התמונות ביום 0.
  8. התאים הדגירה 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 5 ימים, להסיר בינוני, לתקן את התאים עם 4% כדור הכיוון 10 דקות, ולשטוף את 3x עם 1x PBS.
  9. כתם נוירונים עם אנטי אדם β-טובולין או אנטי אדם נוגדן MAP2, ותאי האנדותל עם נוגדן CD31 אדם אנטי. בסופו של כתמים חיסוני, להוסיף 1 מ ל של מדיום הרכבה antifade לכל מנה.

7. משותף להעברת תרבות שותפה

  1. שיתוף השעיה 3 x 104 הביננוירונים gabaergic ו 3 x 104 בתאי האדם הפריבלי האנושית ב-70 μl של שיתוף תרבות בינונית (50% בינונית תחזוקה הפריחדרית ללא נגבה ו 50% בינוני עצבי). הזרע את פתרון התא הזה בתוך תא הוספה אחד היטב. הכינו מספר מתאים של מנות מסוג זה.
    הערה: לא נוספה החברה במדיום המשותף לתרבות כדי שלא לכלול את ההשפעה של נגבה אקסוגני על הגירה.
  2. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים אינם דולף מתוך תא ההוספה.
  3. באיטיות להוסיף 1 מ ל של שיתוף תרבות בינונית לאורך הצד של הצלחת כדי למנוע את הציפוי מייבוש.
    הערה: הוסף בינוני לאט לאורך קצה המנה כך שההוספה לא תהיה מופרעת.
  4. כפקד הראשון, הזרע 3 x 104 האדם הבין-משני GABAergic האנושית רק ב-70 μl של שיתוף תרבות בינונית לכל הוספה היטב. הכינו מספר מתאים של מנות כאלה.
  5. כפקד שני, co-seed 3 x 104 gabaergic האדם הביננוירונים עם 3 x 104 בקרת תאים אנושיים האדם בשליטה 70 μl של שיתוף תרבות בינונית לכל הוספה היטב. הכינו מספר מתאים של מנות.
  6. מודאת הצלחות 24 שעות ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 24 שעות דגירה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי תאים מחוברים כראוי אין דליפה.
  7. לאחר 48 h של זריעה, להסיר בעדינות את ההכנסה באמצעות tweezer סטרילי. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא אינה מופרעת (יום 0).
  8. הסר בינוני והוסף 1 מ ל של מדיום שיתוף תרבותי טרי.
    הערה: הניחו מספר מתאים של מנות לרכישת יום 0.
  9. התאים הדגירה 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  10. לאחר 5 ימים, להסיר בינוני, לתקן את התאים עם 4% כדור הכיוון 10 דקות, ולשטוף את 3x עם 1x PBS.
  11. כתם עם אנטי אדם β-טובולין או אנטי אדם נוגדן MAP2 לתייג את הנוירונים. בסופו של כתמים חיסוני, להוסיף 1 מ ל של מדיום הרכבה antifade לכל מנה.

8. הכימותרפיה-שיטת המשיכה

  1. מניחים שלושה היטב מגוון התרבות במרכז של פולי-L-האורלך/למינציה מצופה 35 mm צלחת באמצעות מלקחיים סטרילית.
  2. . הפוך את המנה הפוכה סמן את הגבול מסביב לחלק האמצעי של ההוספה באמצעות סמן שחור קבוע עם קצה דק במיוחד.
  3. Seed 3 x 104 האדם הבין-עצבי האנושי בתוך התא האמצעי ב-70 μl של בינונית עצבית (איור 3א).
  4. זרעים 104 תאים האדם הפריטאלי האנושי ב 70 μl של בינונית התא הפריטאני ו 104 בקרת תאים אנדותל ב 70 μl של בקרת תא אנדותל בינונית בשני התאים החיצוניים בהתאמה (איור 3א).
  5. הוסף 1 מ ל של שיתוף תרבות בינונית (50% בינונית תחזוקה המוח ללא נגבה ו 50% בינוני עצבי) לאורך הצד של הצלחת כדי למנוע את ציפוי על הצלחת מייבוש.
  6. בדקו במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא דולף מתוך תא ההוספה.
  7. התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 24 שעות דגירה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי תאים מחוברים כראוי אין דליפה.
  8. לאחר 48 h של זריעה, להסיר בעדינות את ההכנסה באמצעות tweezer סטרילי. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ששכבת התא אינה מופרעת (יום 0).
  9. הסר בינוני והוסף 1 מ ל של מדיום שיתוף תרבותי טרי.
    הערה: הנח את מספר המנות הנדרש עבור היום 0 תמונות.
  10. התאים הדגירה עבור 36 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לאחר 36 h, משוף בינוני, לתקן תאים עם 4% כדור הייט עבור 10 דקות, ולשטוף 3x עם 1x PBS.
  11. הכתם האנושי הפנימי של GABAergic עם אנטי אדם β-טובולין או אנטי אדם נוגדן MAP2. בסוף הליך הצביעת, להוסיף 1 מ ל של מדיום הרכבה antifade בכל מנה.

9. הדמיה וניתוח נתונים

  1. מניחים את הצלחת המוכתם החיסונית מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 4X.
  2. שמור על קצה אחד ארוך של הגבול המלבני (מורכב בשלב 5.10 לעיל) בשדה התצוגה. קח תמונות של תאים בשטח נטול התאים הסמוכים לגבול זה. השיגו תמונות לאורך הקצה הימני והשמאלי של הגבול המלבני (איור 2ב').
    הערה: תאים הממוקמים באלכסון ביחס למלבן אינם נחשבים בשל אי-בהירות בבחירת הקצה הקצר או הארוך כסימן התחלה. כמו כן, מספר התאים המתנודדים לאורך הקצה הקצר הם לעתים קרובות פחות משמעותית (ייתכן שבגלל מספר נמוך יותר של תאים מתחילים לאורך הקצה הקצר) ואינם נחשבים.
  3. פתח את התמונות ב-ImageJ. חשב מרחק בין כל תא לבין סימון הגבול (איור 2ד) באמצעות imagej.
  4. להערכת הגירה במונחים של מספרי תאים, קבעו מרחק מסוים מהגבול בתמונה שנרכשה ב-ImageJ. ספור את מספר התאים הנמצאים במרחק זה. חישוב מספר ממוצע, סטיית תקן ומשמעות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השלבים להגדרת הכנסת התרבות האחת בתוך מנה של 35 מ"מ מוצגים באיור 1. שיטת ההעברה למרחקים ארוכים ושיתוף העברת התרבות המשותף השתמשו בתוספת אחת היטב כדי לזרע את מספר התאים הרצוי במרכז פולי-אל-כלים/למינציה בציפוי 35 מ"מ. ביום 0, התאים היו נוכחים כטלאי מלבני (איור 2א, ג). ביום 0 תמונות, שורת היום 0 יכולה להיות מזוהה בקלות על-ידי הקצה החד של שכבת התא (קו מנוקד לבן באיור 2ג)....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, תיארנו שלושה בתוך מבחנה שאומרת שביחד מספקים הערכה כמותית של המאפיינים הייחודיים לתא האנושי. מאמר זה יהיה בעל ערך בהשגת תובנות מכניסטיות לאינטראקציה של תאים אנושיים המוח האנושי עם האינטרנוירונים האנושיים. ניסויים באמצעות ליגרים, מעכבי, או תאים עם האתר הספציפי של הגן או ביטוי יתר יזהה או לאמת שחקנים מולקולריים המתווכים תא אנדותל מונחה הגירה או מאפייני נדידה מרחוק של תאים אנדותל המוח. שינויים אלה יכולים גם להיות שונה כדי לבצע את מחקרי הגירה בתאי הזמן החיים. יתר על כן, יש ראיות לאינטראקציה של תאים אנדותל עם תאים אחרים מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

מחברים לא מצהירים על ניגוד אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי פרסים מן המכון הלאומי לבריאות הנפש (R01MH110438) והמכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (R01NS100808) ל AV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת דיסוציאציה של AccutaseMillipore SigmaSCR005תמיסת דיסוציאציה של תאים (לתאי אנדותל סביב החדר, שלב 1.4)
אנטי אנושי ונוגדני טובוליןBiolegend802001
נוגדן CD31 אנטי אנושיMillipore SigmaCBL468
נוגדן Anti- MAP2NeuromicsCH22103
נוגדן Caspase 3 אנטי אקטיביMillipore SigmaAB3623
בקרת תאי אנדותל אנושייםCellular DynamicsR1022
Control תאי אנדותל תוסף בינוניCellular DynamicsM1019
בקבוקונים קריוגנייםפישר סיינטיפיק03-337-7Y
DMEMF/12 בינוניThermofisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
E6 בינוניThermofisher ScientificA1516401
FGF2Thermofisher ScientificPHG0261
פיברונקטיןThermofisher Scientific33016-015
מיכל הקפאהThermofisher Scientific5100
GABASigma-AldrichA2129
המציטומטרסיגמא-אולדריץ'Z359629
נוירונים אנושיים GABAergicדינמיקה תאיתR1013
נוירונים אנושיים נוירונים ארגיים בסיס מדיוםדינמיקה סלולריתM1010
GABAergic נוירון אנושי תוסף עצבידינמיקה סלולריתM1032
למיניןסיגמאL2020
MatrigelCorning356230מטריצת ממברנה מרתף
הרכבהמעבדות וקטורH-1200
poly-L-ornithinSigmap4957
PBSThermofisher Scientific14190
Trypan blueThermofisher Scientific15250061
TrypLEThermofisher תמיסתדיסוציאציה של תאים 12563011 מדעית (עבור GABAergic interneurons ותאי אנדותל, סעיפים 3 ו-4)
VEGF-APeprotech100-20
VascuLife VEGF ערכה שלמה בינוניתLifeline Cell TechnologiesLL-0003רכיב של תאי אנדותל אנושי בקרה בינוני
תרבית סיליקון 2 בארות-הכנסibidi80209
3-well סיליקון תרבות-הכנסibidi80369
צלחת 35 מ"מקורנינג430165
צינור חרוטי 15 מ"לפישר סיינטיפיק07-200-886
4% תמיסת PFAפישר סיינטיפיקAAJ19943K2
צלחת תרבית רקמות 6 בארותפישר סיינטיפיק14-832-11
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכהZeissZeiss Axiovert 40C
OlympusFSX-100
בינוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מקורות

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149(2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356(2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GABAergic
הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.