בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Summary

מיאוברוב הם מתרבים תאים מקודכי להבדיל לטופס מיונוקלאוטים מיופולימרים ובסופו של דבר שריר השלד סיבים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד יעיל והתרבות של myoblasts חזיקה הראשוני של השרירים העכבר המבוגר הצעיר. השיטה מאפשרת מחקרים מולקולריים, גנטיים ומטבוליים של תאי שריר בתרבות.

Abstract

Myoblasts נמשך ראשוני הם מובחן מתרבים מקדם של שריר השלד. הם יכולים להיות מתורבתים ולמדו כלפי מקדם שרירים או המושרה להבדיל בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח שרירים. הפרוטוקול המסופק כאן מתאר שיטה איתנה עבור הבידוד והתרבות של אוכלוסיה מתרבים מאוד של תאים myoblast חוז מפני השלד הצעיר למבוגרים שרירים בשרירים. תאים אלה שימושיים למחקר של מאפייני חילוף החומרים של שריר השלד של דגמי עכבר שונים, כמו גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון העברה עם DNA אקסוגני או התמרה עם וקטורים ביטוי ויראלי. רמת הבידול ופרופיל חילוף החומרים של תאים אלה תלויה באורך החשיפה, והרכב של המדיה המשמש כדי לגרום בידול myאובאלי. שיטות אלה לספק מערכת חזקה לחקר של תא שרירי העכבר מטבוליזם לשעבר vivo. חשוב לציין, בניגוד לדגמים vivo, השיטות המתוארות כאן מספקות אוכלוסיית תאים שניתן להרחיב וללמוד ברמות גבוהות של האפשרות הניתנת למחקר.

Introduction

בעוד מצוטט לעתים קרובות כאינדיקציה לבריאות מטבולית כוללת, מחקרים מרובים הראו כי מדד מסת הגוף (BMI) אצל מבוגרים לא קשורה בעקביות עם סיכון גבוה יותר של תמותה. עד כה, הגורם היחיד המוצג להיות עקבי עם תמותה מופחתת באוכלוסייה זו הוא מוגבר מסת השריר¹. רקמת השריר מייצגת את אחד המקורות הגדולים ביותר של תאים רגישים לאינסולין בגוף, ולכן הוא קריטי בתחזוקת הומאוסטזיס הכולל מטבולית². הפעלה של רקמת שריר השלד באמצעות פעילות גופנית קשורה מגדילה הן רגישות מקומית אינסולין הכולל בריאות מטבולית³. בעוד במודלים vivo חיוניים לחקר הפיזיולוגיה שרירים ההשפעה של תפקוד שרירים על חילוף החומרים משולב, התרבויות הראשיות של מיוכי מספקים מערכת צייתן המפחית את המורכבות של מחקרים בעלי חיים.

מוביאוטיבי נגזר השרירים שלאחר לידה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של הטיפול בתנאים רבים והצמיחה באופן מאוד מיוניתן. זה כבר מזמן הוכרה ומספר שיטות לבידוד myoblast חוז ותרבות תוארו^4,5,6,7,8,9. חלק מהשיטות הללו משתמשות בשרירי הילדים ומפיקות מספר נמוך יחסית של myoblasts חזיק^5,8, המחייב כמה בעלי חיים למחקרים בקנה מידה גדול יותר. כמו כן, השיטות הנפוצות ביותר לשימוש בשיטת "ציפוי מקדים" להעשרת עבור myoblasts אשר הם פחות חסיד מאשר סוגי תאים אחרים. מצאנו את שיטת ההעשרה החלופית המתוארת כאן כדי להיות הרבה יותר יעילה ומיושבה להעשרת אוכלוסיית מחוז מאוד מתרבים. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר את הבידוד של myoblasts צמיחה מאוד מתרבים מפני השרירים הצעירים explants בוגרים, באמצעות צמיחה לתוך מדיה התרבות. ניתן לקצור את המכשולים שוב ושוב, במשך מספר ימים, להרחיב במהירות, והמושרה כדי להבדיל לתוך שפופרות. פרוטוקול זה מייצר מספר רב של תאי מחוז מיאובלי בריאים אשר מבדילים באופן ספונטני מיופופרות. הוא איפשר לנו ללמוד חילוף החומרים ומקצבים מעגליות ב מיוכי הראשי של עכברים של מגוון של גנוסוגים. לבסוף, אנו כוללים שיטות להכנת מיוצינורות לחקר מטבוליזם חמצוני, באמצעות מדידות של שיעורי צריכת החמצן ב 96-לוחיות.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים של סקריפס מחקר.

1. איסוף ועיבוד של הרחבות רקמת שריר

1. ביום שלפני הניתוח, לחטא את כל הציוד לחיתוך (מלקחיים, סכיני גילוח, ומספריים) ולהכין את כל המדיה הנדרשת: פוספט באגירה מלוחים (PBS), מדיה ציפוי MB (12.5 mL של DMEM זיכרון, 12.5 mL של בשר החזיר F12, 20 מ ל של בחום מופעל העוברי שור סרום (FBS), 5 מ ל של תוספת בינונית של נוזל השפיר), ואת פתרון ציפוי (24 מ ל של DMEM, 24 מ ל של החזיר F12, 1.7 מ ל של קולגן, 1 מ ל של מטריצות).
2. היום של הניתוח, מעיל אחד 6-ס מ צלחת עם ציפוי פתרון לכל שריר להיות גזור. הוסף 2 מ ל של פתרון ציפוי על פני השטח של כל צלחת, לנענע בעדינות כדי ליצור מעיל אפילו על פני השטח, ו מודקת את הצלחות עם פתרון ב 4 ° c עבור 1 h.
3. הסר פתרון ציפוי מהלוחות וחזור לפתרון המניה.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון הציפוי לשישה חודשים ויש לאחסנם ב-4 ° c.
4. לשטוף את הצלחות פעמיים עם 2 מ ל של PBS להסיר קולגן לא מאוגד מטריצות.
5. מניחים את הצלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח.
6. הכינו תא לח על-ידי הצבת 2-3 גיליונות של נייר סופג סמיך לשקית ניילון או מנה סטרילית בגודל 15 ס מ והשתמשו בפיפטה כדי להרטיב את המשטח של הנייר במים סטריליים.
7. מניחים את התא תחת אור UV עבור 5 דקות לחטא.
8. לנתח את השרירים הרצויים מעכבר בן 4 עד 8 שבועות. כדי לעקר את רקמת השריר, לשטוף בעדינות ב-PBS המכיל 40 μg/mL gentamicin.
   הערה: . שריר אחד לכל צלחת עבור הסוליה, plantaris ו אדי, לשלב שרירים משתי הרגליים בצלחת אחת.
9. השתמש מלקחיים סטרילי להעביר את השריר לצלחת פטרי מצופה 10 ס"מ ללא ציפוי. הוסף 0.5-1.0 mL של ציפוי מדיה על השריר כך הרקמה היא לחה אך לא צף (איור 1A).
10. השתמש בסכין גילוח סטרילי או תער כדי לחתוך בעדינות את השריר לרסיסים קטנים (כ 1-3 מ"מ³).
    הערה: חשוב למזער את הטיפול ברקמת השריר לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
11. השתמש מלקחיים או פיפטה כדי להעביר את שברי שריר על פני השטח של צלחת מצופה מראש 6 ס מ. בעדינות רבה יותר 0.8 מ ל של ציפוי מדיה על הרקמה. צריך להיות מספיק מדיה כדי לשמור את חתיכות הרקמה רטוב אבל לא צף (איור 1B).
12. מניחים את 6 ס מ מנות המכילות את שברי שריר בתוך החדר הלח ולחזור לאינקובטור (37 ° c, 5% CO₂) עבור 48 h (איור 1ג).
    הערה: זה חיוני כי שברי שריר לדבוק פני השטח של הצלחת כדי לאפשר את מחוז myoblast. אין להזיז את לוחות/חדר לפחות 48 h.
13. לאחר 48 h, בדוק בקפידה את לוחיות הרישוי כדי לוודא שרסיסי השריר הדבקו. שכבת עם 2 מ ל של ציפוי מדיה, מטפל לא להוציא את השברים.
    הערה: אם יש זיהום או פסולת גלויים על הלוחות, לשטוף בזהירות את חתיכות השריר. צלחת 2 מ ל של הפתרון PBS/gentamicin בקצה הצלחת וטיפ בעדינות לשטוף את רקמת השריר. הוצא את ה-PBS וחזור על שלב השטיפה. לאחר השטיפה השנייה, שכבת-על 2 מ ל של ציפוי מדיה.
14. שמרו את הצלחות בחממה 37 ° c למשך 3 ימים נוספים (5 ימים מניתוח מקורי) לפני איסוף myoblasts. תבדקו בכל יום אחר. לצמיחה של מכשולים
    הערה: המראה של תאים המתעוררים השרירים שרירים יהיה משתנה הטרוגנית. מקוצר ראשי מופיע כתאים קטנים, עגולים ובהירים. עם זאת, אין צורך ולא אמין לזהות אותם לפי הופעתם בשלב זה (איור 2).

2. קציר הולך וגובר

1. להכין ולחמם טרום מדיה Myoblast (17.5 mL של DMEM 17.5 mL של בשר חזיר F12, 10 מ ל של FBS, 5 מ ל של נוזל השפיר תוסף בינוני), טריפסין, ו PBS/. מעיל אחד T25 בקבוקון לקבוצה שריר להיות שנקטפו עם פתרון ציפוי וכמתואר בשלב 1.2 (ראה טבלה 1).
2. הסר מדיה ציפוי ולשטוף בעדינות את explants שרירים עם 2 מ ל של PBS/. הסר במהירות את ה-PBS (לשטוף צלחת אחת בכל פעם ואל תיתן את הצלחת לשבת PBS בשלב זה).
3. מוסיפים בעדינות 1 מ ל של PBS/gentamicin ומניחים את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 1 דקות.
4. השתמש בפיפטה P1000 כדי לאסוף תאים PBS בשפופרת צנטריפוגה של 15 מ ל.
5. הוסיפו 1 מ ג של טריפסין לצלחת וחזרו לאינקובטור 37 ° c במשך 3 דקות. הקש בעדינות על לוחיות הרישוי. לאסוף את טריפסין/תאים ולשלב עם אוסף PBS. הוסיפו 8 מ ל של המדיה של מיאובאל בשפופרת הצנטריפוגה והיפוך עדין לערבוב.
6. כיסוי בעדינות 2 מ ל של פתרונות ציפוי על לוחיות השריר ולחזור לחממה 37 ° c.
7. ספין צינורות צנטריפוגה המכיל תאים בצנטריפוגה עבור 3 דקות ב 200 x g.
8. להיות זהיר כדי להימנע. מגלולה סלולרית הוסיפו בעדינות את Myoblast מדיה (ראו לוח 1) והעבירו את התאים לבקבוקון המצופה מראש ומניחים בחממה 37 ° c. . זה הקציר P0 אם נצפתה תחת מיקרוסקופ, ייתכנו מעט מאוד תאים (איור 3).
9. חזור על הקציר המתואר מעל כל יום אחר עד שלוש פעמים. לאחר הקציר השלישי, למחוק את האקסוצמחים.

3. התרחבות והעשרה של מפיצים מתרבים

הערה: הקציר P0 יהיה הטרוגנית (~ 60% myoblasts חזיק). שני המעברים הבאים משתמשים ב-PBS כדי לקצור את היבול הסלקטיבי. רבים של תאים מחסיד יותר יישאר מאחור את myoblasts מתרבים במהירות יהיה ≥ 95% טהור בתוך 2 מעברים. לאחר הקמת מכשולים, הם צריכים להישמר בצפיפות נמוכה כדי למנוע בידול ספונטנית.

1. עבור כל T25 בקבוקון של ~ 40-50% בתאים confluent מסעיף 2, מעיל אחד T75 בקבוקון עם 5 מ ל של פתרון ציפוי ומקום ב 4 ° c עבור 1-4 h.
2. הסר פתרון ציפוי מתוך מבחנות ולחזור לפתרון המניה. לשטוף את מבחנות פעמיים עם 2 מ ל של PBS/gentamicin ומקום בחממה 37 ° c.
3. מP0 את התקשורת. מצלוחיות T25 מאובאלי לשטוף את התאים בקצרה עם 2 מ"ל של PBS חם/gentamicin. . הייתי מבין את הPBS מהבקבוקון
   הערה: מטרת שלב זה (3.3) היא להפחית את האפשרות של זיהום חיידקי. אם מבוצע במהירות ובעדינות, זה לא צריך לגרום לאובדן של myoblasts. ניתן להשמיט אותו כדי למקסם את שימור מחוז myoblast אם תרצה.
4. פיפטה 2 מ ל של PBS חם (לא טריפסין) לתוך כל בקבוקון המכיל myoblasts. מניחים את מבחנות עם PBS לתוך החממה 37 ° c עבור 3 דקות.
   הערה: מיאובלי צריך להתנתק בקלות מצלוחיות עם PBS. השימוש ב-PBS במקום בטריפסין בשלב זה הוא קריטי להפחתת הזיהום של אוכלוסיית myoblast חוז עם סוגי תאים אחרים.
5. הסר את התאים מהאינקובטור 37 ° c ומצד הברז החזק של מבחנות כדי להוציא את התאים. בדוק תחת מיקרוסקופ קל עבור מכשולים צף בחופשיות.
6. מניחים את מבחנות זקוף במכסה התרבות רקמה ולשטוף את החלק התחתון של מבחנות עם 10 מ ל של Myאובלסט מדיה 2-3 פעמים כדי להבטיח את כל התאים הם במקומם.
7. לאסוף את תערובת התא/מדיה בשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל. צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 200 x g.
8. . להיזהר למנוע את הגלולה הסלולרית הוסף בעדינות כמות מתאימה של מדיית Myoblast לצינורית צנטריפוגה וערבבו בעדינות.
9. הפץ את תערובת התא לצלוחיות T75 חדשות. הוסף 10 מ ל של Myoblast מדיה לכל חדש T75 בקבוקון. לנער בעדינות את מבחנות אופקית כדי לפזר את התאים ומניחים בחממה 37 ° c בלילה.
10. יומיים לאחר מכן, מעבר פעם נוספת עם PBS, פיצול כל T75 בקבוקון לתוך שלושה T75 צלוחיות.
    הערה: אל תאפשר myoblasts להיות יותר מ 50%-60% confluent, כמו זה יגרום להם להתחיל להבדיל ולאבד קיבולת prolifaterive.
11. למעברים נוספים, השתמשו בטריפסין. הפסנת פעמיים עם התשואות של PBS > 95% מקוצר; ניסיונות לשפר עוד יותר את הטוהר נוטה לגרום בידול עניים.

4. הבדלה של מיאובלי ראשוני ליופופרות

1. לוחית P2 (או מעבר מאוחר יותר) myoblasts חזיק במדיה של מיאובלסט על צלחות מצופות (ראה שולחן 1 לציפוי מוצעים וכלי ציפוי ומספרי תאים). שניים או שלושה ימים לאחר מכן, כאשר התאים הם ב 70-80% שליטה, לשנות את המדיה לבידול מדיה (24 מ ל של DMEM, 24 מ ל של חזיר F12, 1.5 מ ל של סרום מופעל בחום, 0.5 מ ל של אינסולין-סלניום-העברה).
2. שינוי בידול מדיה בכל יום אחר במהלך הבידול של מכשולים ראשוניים לתוך מיוכי. בידול הוא בדרך כלל להשלים לפי יום 4-5 ויסומן על ידי תאים מאורכים, התמזגו באופן ספונטני עווית. בצע ניסויים על מיולים מובחנות תוך 6 ימים. בדרך כלל תאים הם חמישה או שישה ימים לאחר התחלת בידול.

5. מדידת שיעור צריכת החמצן במינורות או ביויומטרים ב 96-צלחות ועוד

1. מעיל 96-ובכן צלחות עם 25 μL של פתרון ציפוי לכל טוב. צנטריפוגה את לוחיות ב 58 x g עבור 1 דקות כדי להסיר בועות כלשהן.
2. מודאת לוחיות הרישוי בפתרון ציפוי עבור 1-4 h ב -4 ° c. השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי להסיר את הפתרון ציפוי ולשטוף שלוש פעמים ב 25 μL של הקרה PBS/gentamicin. צנטריפוגה לפחות אחד מאותם שוטף כדי להבטיח כי בועות לא לכודים.
3. הוסף 40 μL של בידול מדיה לכל באר. צנטריפוגה את התקשורת על צלחת מצופה ללא תאים עבור 1 דקות ב 58 x g כדי למנוע בועות ולהסיר את המתח פני השטח כדי לקבל שכבה אחידה של מדיה.
4. הוסף תאים שהושעו ב-40 μL נוסף של מדיה לכל באר. ספין שוב ב 58 x g.
   הערה: העקביות בציפוי חשוב עבור התוצאות הטובות ביותר ואת מספר התאים מצופה לכל טוב צריך להיות ממוטב עבור כל התקנה ניסיונית, וסביר להניח בטווח של ~ 10000-25000 myoblasts מצופה מדיה בידול לכל טוב של צלחת 96-באר.
5. שנה בעדינות את המדיה היומית במהלך בידול. אין להוריד את המדיה אלא להסיר אותו בעזרת פיפטה, להשאיר את הנפח הקטן מאחור כדי להימנע מפירוק התאים או לחשוף אותם לאוויר. לדוגמה, החלף 50 μL בכל פעם עבור שלוש חזרות ולא את כל 80 μL בו.
6. השתמש 8-15 בארות לכל תנאי. ייתכן שיהיה צורך להשמיט כמה בארות אם התאים אינם יוצרים שכבה אחידה של מיומים.
   הערה: השמט בארות על קצות הצלחת כי הם רגישים מאוד התאיידות. לשנות את כיוונון הצלחת לשכפל ניסיוני כדי למנוע שגיאות שיטתיות.
7. לבצע את הצורך הרצוי על מיולים הבדיל בתוך 1-2 ימים של בידול מלא (יום 4-6 מתחילת בידול). מכשירים מומלצים וריאגנטים למדידת שיעורי צריכת החמצן מפורטים בטבלת החומרים.

Results

לאחר סעיף 1 של הפרוטוקול המסופק יש להניב תאים ראשוניים המתעוררים מתוך explants שיהיו גלויים תחת מיקרוסקופ אור רגיל (איור 2). אוכלוסיית תאים הטרוגנית יראו גדלה ומקיפה כל רקמת שריר לחקור. מיאובלי יופיע כספירות קטנות, עגולות ובהירות. לאחר סעיף 2 של הפרוטוקול תניב יבול מוקדם של myoblasts מתוך הרחבות רקמות, אשר יכיל תאים מעטים יהיה הטרוגנית (איור 3). סעיף 3 של הפרוטוקול מתאר מעבר יבול מוקדם עם ה-PBS (ולא טריפסין), אשר יספק אוכלוסייה ט...

Discussion

שריר השלד חיוני להקמת ותחזוקה של הומאוסטזיס מטבולית¹¹. המחקר של הפיזיולוגיה שרירים הוא מסובך על ידי השונות הבינאישית, כמו גם קושי להשיג דגימות, במיוחד במקרה של מחקרים אנושיים. מיולים הראשי מתורבת הוכחו לכידה של תכונות רבות של פיזיולוגיה שרירים, כולל סידן הומאוסטזיס¹², התחדשות של רקמת שריר פגום⁵, שינויים מטבוליים בתגובה לתרגיל¹³, ו שינויים בחילוף החומרים כתוצאה ממחלות כגון סוכרת¹⁴. התרבות הראשית של myobl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<תמיסת ציפוי >חזקה:
DMEM	Gibco	10569010	להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל
HAMS F12	Lonza	12-615F	יש להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 מ"ל
מטריג'ל	פישר		CB40234A 1 מ"ל
<חזק>חומרי ציפוי:
DMEM	Gibco	10569010	להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 12.5 מ"ל
HAMS F12	Lonza	12-615F	הוסף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 12.5 מ"ל
Life Technologies	מומת בחום	16000044	20 מ"ל; ניתן לרכוש כ-FBS רגיל ומנוטרל בחום על ידי הכנסת 40 מעלות; אמבט מים C למשך 20 דקות
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 מ"ל
<חזק>Myoblast מדיה:
DMEM	גיבקו	10569010	להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 17.5 מ"ל
HAMS F12	Lonza	12-615F	הוסף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 17.5 מ"ל
חום FBS	Life Technologies	16000044	10 מ"ל; ניתן לרכוש כ-FBS רגיל ומנוטרל בחום על ידי הצבה ב-40 מעלות; אמבט מים C למשך 20 דקות
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 מ"ל
<חזק>מדיית בידול:
DMEM	Gibco	10569010	להוסיף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל
HAMS F12	Lonza	12-615F	הוסף תמיד גנטמיצין (1:1,000 בנפח) לפני השימוש; 24 מ"ל
חום סרום סוס מושבת	Sigma	H1138	1.5 מ"ל
אינסולין-סלניום-טרנספרין	Life Technologies	41400045	0.5 מ
<חזק>חומרים אחרים:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	הכן כ -10% DMSO במדיה Myoblast להקפאת תאים
מלקחיים	כל
סכיני גילוח	כל
מספריים	כל
נייר Whatman	VWR	21427-648
צלחת 60 מ"מ	VWR	734-2318
צלחת 10 ס"מ	VWR	25382-428 (CS)
T25 צלוחיות	ThermoFisher	156367
T75 צינורות		ThermoFisher
(15 מ"ל)	BioPioneer	CNT-15
<חזק>שיעורי צריכת חמצן:
סוסון ים XFe96 מנתח	Agilent	Seahorse XFe96 מנתח	מכשיר המשמש למדידת שיעורי צריכת החמצן שנקרא על ידי החמצה של המדיה החוץ-תאית
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	צלחות 96 בארות לשימוש ב-XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	רכיבים ניתן לרכוש מספקים אחרים לאחר קביעת הבדיקה; חלק מההמלצות מפורטות להלן
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO	Agilent	102720-100	מספקים אחרים לאחר קביעת הבדיקה; כמה המלצות מפורטות להלן
חומצה פלמיטית	Sigma	P5585-10G	למדידת חמצון חומצות שומן
Carnitine	Sigma	C0283-5G	למדידת חמצון חומצות שומן
Etomoxir	Sigma	E1905	למדידת חמצון חומצות שומן
BSA	Sigma	A7030	משמש כבקרה או בצמידות עם חומצה פלמיטית לשימוש במדידת חמצון חומצות שומן