פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תא עיתונאי מקרופאג שיטה לבחון קולטן שיחת כמו-תיווך NF-kB/AP-1 איתות על שכבות חלבון Adsorbed על משטחים פולימריים
במאמר זה
סיכום
תקציר
התגובה מארח דלקתי מתמשך ביוביוחומר מושתל, המכונה תגובת גוף זר, הוא אתגר משמעותי בפיתוח ויישום של מכשירים ביו ומבנים הנדסת רקמות. מקרופאגים, תא חיסונית מולדת, הם שחקני מפתח בתגובת הגוף הזר משום שהם נשארים באתר השתל למשך החיים של המכשיר, והוא למדו בדרך כלל כדי להשיג הבנה של תגובה זו מארח מזיקה. חוקרים רבים ביואטיליים הראו כי שכבות חלבון נספחת על חומרים מושתלים להשפיע על התנהגות מקרופאג, ולאחר מכן להשפיע על התגובה המארחת. השיטות במאמר זה מתארים מודל בלתי מתורבת באמצעות שכבות חלבון נספחת המכילים נזק תאי מולקולות על משטחי פולימר משטחים כדי להעריך תגובות מקרופאג. NF-кb/AP-1 עיתונאי מקרופאג קו התא ואת העיבוד המקושר באופן אלקליין פוספספטאז משמש כשיטה מהירה כדי לבחון בעקיפין NF-кb/AP-1 פעילות שעתוק בתגובה לשכבות חלבון מורכבות נספחת המכילים חלבונים בדם הקשורים לנזק דפוסי מולקולרי, כמודל של שכבות החלבון המורכבות הנוצרות על משטחי ביומטריה בvivo.
מבוא
תגובת הגוף הזר (FBR) היא תגובת מארח כרונית שיכולה להשפיע לרעה על הביצועים של חומר או מכשיר מושתל (למשל, התקני משלוחים לסמים, ביוחיישנים), באמצעות שחרור מתמשך של מגשרים דלקתיים ובאמצעות השתלבות בשילוב בין החומר המושתל לבין הרקמה הסובבת1. זה התגובה החיסונית מולדת היא ביוזמת הליך ההשתלה מאופיין על ידי נוכחות ארוכת טווח של תאים חיסוניים מולדים היווצרות קפסולה סיבי סביב השתל1. בהקשר של תגובות מארח חומרים, לאינטראקציות חומרים מקרופאג יש השפעה משמעותית על ההתקדמות של התגובה המארחת ופיתוח של FBR1. מקרופאגים הם האוכלוסייה החיסונית מגוונת מולדים המערכת, גויס לאתר השתל או מתוך רקמות תושב האוכלוסייה מקרופאג א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה לתקשורת ומגיב
- . הכן מדיה בפיברובלסט שילוב 450 mL של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 50 mL של סרום של שור עוברי (FBS), ו-5 מ ל של פניצילין/סטרפטומיצין. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
- הכינו כתבת מקרופאג מדיית גדילה ב50 mL. שילוב 45 mL של DMEM, 5 מ ל של FBS, 5 μg/mL mycoplasma אלימינציה מגיב (טבלת חומרים), ו 200 μg/Ml phleomycin D1 (טבלת חומרים). החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
- הכינו כתבת מקרופאג מדיה ב50 mL. שילוב 45 mL של DMEM, 5 מ ל של חום מופעל FBS (HI-FBS), 5 μg/mL mycoplasma אלימינציה מגיב, ו 200 μg/mL phleomycin D1. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
2. ציפוי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטות ניקוי עבור משטחים מצופי פולימר נבדקו כדי להבטיח שלא היה הפרעה של ציפוי, אשר ניתן היה לראות כשינוי בזווית מגע המים לתוך שמיכות זכוכית ללא ציפוי (איור 2). הטבילה PMMA מצופה מיקרוסקופ שקופיות 70% אתנול עבור 1 h נמצא כדי להסיר את ציפוי PMMA (איור 2, שמאל פאנל), כנראה בשל מסיסות של pmma ב 80 wt x אתנול13, ולכן pmma מצופה משטחים נוקו באמצעות 30 דקות של העיקור של UV לבד. הריכוז של PMMA לציפוי היה אופטימיזציה בעבר5. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המוקד העיקרי של המעבדה שלנו היא התגובה המארחת על שתלים מוצק רקמת רקמה רכה, ובמיוחד איך הנזק התאי שנגרמו במהלך השתלת הליך משפיע על התגובה המארחת. העבודה המוצגת כאן מתארת ניסויים ראשוניים באמצעות כתבת קו מקרופאג cell באמצעות מבחנה לחות הסלולר המכילים לחות, כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות שפורסמו במהלך הנזק התאי (כלומר, מהניתוח השתל) על התגובות מקרופאג ביואטילים. תא פיברודפיצוץ ליפוסט השתמשו כדי לדגמן את הנזק התאי ושחרורו של DAMPs בשל מיקום ביומטריה. פיברותקיעות נבחרו כדי ליצור את הליפוסט בגלל שכיחות הפיברובליות ברקמה רכה, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מכירים בהכרת תודה מבצעית מהמכונים הקנדיים של פרויקט מחקר הבריאות (PTJ 162251), הסנאט של אוניברסיטת המלכה ועדת המחקר המייעצת ותמיכת תשתית של הקרן הקנדית לחדשנות קרן ג'ון אוון (פרויקט 34137) ומשרד המחקר והחדשנות באונטריו קרן המחקר (פרויקט 34137). L.A.M. היה נתמך על ידי אוניברסיטת המלכה R. סמואל מקלפלין מלגת, מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי של קנדה בוגרת מלגת בוגר הפרס של מאסטר בוגרת אונטריו מלגה. המחברים רוצים להודות לד ר מיירון סצ'ואן על מתנתו הנדיבה של הכתבת NF-κB/AP-1 מקרופאג line ו ד"ר. מיכאל בלנרסט וסנדרה לורנסו לשימוש מערכת הדמיה ג'ל שלהם וקורא צלחת.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים לתרבית תאים | |||
| נגד עכברים/CD282 אנושי (TLR2) | Biolegend | 121802 | |
| CLI-095 (מעכב TLR4) | Invivogen | TLRL-CLI95 | |
| C57 פלזמה משלימה K2 EDTA 10 מ"ל, פלזמת עכבר חדשנית בדרגה אמריקאית | InnovativeResearch | IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml | |
| מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) | Sigma Aldrich | D6429-500ML | |
| תמיסת מלח פוספט חוצצת (DPBS) של Dulbecco | Fisher Scientific | 14190250 | ללא סידן, ללא מגנזיום |
| סרום בקר עוברי (FBS), דרגת מחקר | Wisent | 98150 | |
| LPS-EK | Invivogen | TLRL-EKLPS | ליפופוליסכריד מבית Escherichia coli K12 |
| NIH/3T3 פיברובלסטים | ATCC | CRL-1658 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-PMS | ליפופפטיד טריאצילטי סינתטי - TLR1/2 ליגנד |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סיגמא אולדריץ' | P4333-100ML | |
| פלסמוצין | Invivogen | ANT-MPP | מגיב חיסול מיקופלזמה |
| תאים גולמיים-כחולים | Invivogen | raw-sp | NF-κ B/AP-1 מדווח קו תאי מקרופאגים |
| תמיסה כחולה טריפאן, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE אקספרס אנזים (1X) | Fisher Scientific | 12604021 | אנזים דיסוציאציה של תאים רקומביננטיים ללא מקור מהחי |
| Zeocin | Invivogen | ANT-ZN-1 | |
| ערכות ובדיקות | |||
| צלחות מצופות מראש של ELISA, עכבר IL-6 | Biolegend | B213022 | |
| צלחות מצופות מראש של ELISA, עכבר TNF-ואלפא; | Biolegend | B220233 | |
| אנדוטוקסין (Escherichia coli) - שליטה באנדוטוקסין סטנדרטי (CSE) | שותפים של קייפ קופ בע"מ. | E0005-5 | אנדוטוקסין לעקומה סטנדרטית בבדיקת אנדוטוקסין כרומוגנית |
| LAL מים, 100 מ"ל | Associates of Cape Cope Inc. | WP1001 | בשימוש עם בדיקת אנדוטוקסין כרומוגני |
| בדיקת חלבון מיקרו BCA | Fisher Scientific | PI23235 | |
| Limulus amebocyte lysate (LAL) ערכת בדיקת אנדוטוקסין פירוכרום | Associates of Cape Cope Inc. | C1500-5 | מגיב לבדיקת אנדוטוקסין כרומוגני |
| QUANTI-Blue אלקליין פוספטאז מדיום | Invivogen | rep-qb2 | בדיקת פוספטאז אלקליין למדידה עקיפה של NF-κ B/AP-1 פעילות |
| <חזק>ריאגנטים לציפוי פולימרי | |||
| כלורופורם, נטול מים | סיגמא אולדריץ' | 288306-1L | |
| אלכוהול אתילי | אלכוהולים מסחריים | P006EAAN | סיגמא: אלכוהול ריאגנט, נטול מים, 676829-1L |
| מלקחיים בעלי קצה דק מחודד ישר | פישר סיינטיפיק | 16-100-113 | |
| פלואורינרט FC-40 ממס | סיגמא אולדריץ' | F9755-100ML | ממס פלואור למים |
| בדרגת תרבית תאים fPTFE (ללא אנדוטוקסין) | פישר סיינטיפיק | SH30529LS | |
| פולי (מתיל מתקרילט) (PMMA) | סיגמא אולדריץ' | 182230-25G | |
| ערכת אלסטומר סילגארד 184 פישר | סיינטיפיק | 50822180 | |
| טפלון-AF (fPTFE) | Sigma Aldrich | 469610-1G | Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene] |
| חומרים מתכלים | |||
| אטמי צלחות דבק | Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Axygen microtubes, 1.5 מ"ל | Fisher Scientific | 14-222-155 | |
| בקבוקוני נצנוץ מזכוכית בורוסיליקט, עם מכסי פוליפרופילן לבנים | פישר סיינטיפיק | 03-337-4 | |
| צלחת שקוף PS 48 בארות | פישר סיינטיפיק | 08-772-52 | |
| צלחת TCPS 96 בארות | שקוף פישר סיינטיפיק | 08-772-2C | |
| צלחת TCPS 48 בארות | פישר סיינטיפיק | 08-772-1C | |
| כיסוי כוסות, עיגולים | פישר סיינטיפיק | 12-545-81 | |
| צלוחיות מטופלות בתרבית רקמות פלקון, T25 | פישר סיינטיפיק | 10-126-10 | |
| שקופיות דביקות 8 באר | איבידי | 80828 | |
| שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט | פישר סיינטיפיק | 12-550-15 | |
| צלוחיות שטופלו בתרבית רקמות, T150 | פישר סיינטיפיק | 08-772-48 |
מקורות
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
- Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
- Collier, T. O., Anderson, J. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
