מאמר שיטה

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

DOI:

10.3791/60334

⸱

28 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע עובריים האדם להפגין יכולת ייחודית להגיב מורפולגנים בחוץ גופית על ידי דפוסי ארגון עצמי של מפרט הגורל התא המתאימות היווצרות שכבת הנבט העיקרי במהלך embryogenesis. לפיכך, תאים אלה מייצגים כלי רב-עוצמה שעליו לבחון את המנגנונים שנוהגים בהתפתחות האנושית המוקדמת. פיתחנו שיטה לתרבות האדם תאים גזע עובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי המספק שליטה על הגיאומטריה של המושבות הסביבה המכנית שלהם כדי ללכוד את הפרמטרים הפיזיים ש embryogenesis. התכונה המפתח של שיטה זו היא היכולת לייצר הידרואקרילאמיד polyג'לים עם דפוסים מוגדרים של מטריקס ליגתאי מטריצות על פני השטח כדי לקדם את הקובץ המצורף לתא. זה מושגת על ידי בדיית סטנסילים עם דפוסים גיאומטריים הרצוי, באמצעות סטנסילים אלה כדי ליצור דפוסים של מטריקס ליגתאי מטריצה על שמיכות זכוכית, והעברת דפוסים אלה להידרואקרילאמיד הידרוג'לים במהלך הפלוניזציה. שיטה זו תואמת גם עם מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשר למשתמש למדוד ולמפות את התפלגות הכוחות המופקים התא בתוך המושבות הסגורים. בשילוב עם מידות ביוכימיות סטנדרטיות, ניתן להשתמש במידות אלה כדי לבחון את מספר הסימנים המכאניים במפרט הגורל ומורפולגנזה במהלך התפתחות האדם הקדומה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) להחזיק הבטחה גדולה לשימוש ברפואה משובי ויישומים הנדסה רקמות. האופי הפלוריאני של התאים האלה נותן להם את היכולת להבדיל לכל סוג של תא מבוגר. בעוד צעדים גדולים נעשו בבימוי גורלם של hESCs לסוגי תאים מסוימים, זה נשאר קשה מאוד לייצר רקמות שלמות או איברים דה נובו1,2,3,4, 5. המשך הדבר נובע, במידה רבה, להבנה מוגבלת של המנגנונים הנוהגים ביצירת רקמות אלה במהלך התפתחות האדם. כדי למלא את הפער הזה בידע, מספר שיטות הופיעו בשנים האחרונות כדי לדגמן את העובר המוקדם ובשלבים הבאים של פיתוח עם תאי גזע עובריים6,7,8,9 ,10,11,12,13.

זמן קצר לאחר הנגזרת של קווי hESC הראשון14, זה הוכח כי גופים embryoid נוצר מ hESCs היו מסוגלים לייצר באופן ספונטני תאים של שלוש שכבות הנבט הראשי6. עם זאת, בשל חוסר השליטה הטבועה בגודל ומורפולוגיה של גופים embryoid, הארגון של שכבות הנבט מגוונות באופן משמעותי ונכשל להתאים את הארגון של העובר המוקדם. לאחרונה, חימום פלאש et al. פיתחה שיטה להגבלת מושבות של hESCs על מצעים זכוכית באמצעות מיקרופיקנינג, מתן שליטה ועקביות על הגודל והגיאומטריה של המושבות8. בנוכחות BMP4, מורפוגן חשוב בהתפתחות מוקדמת, אלה מושבות מוגבלים היו מסוגלים לארגון העצמי דפוסים מסוימים של מפרט לגורלות המייצגים את שכבות הנבט העיקרי. למרות שזה סיפק מודל שימושי ללמוד את המנגנונים שבהם שכבות הנבט העיקרי מבוססים, דפוסי מפרט הגורל לא התאימו בדיוק את הארגון ואת מורפולגנזה נצפתה במהלך embryogenesis15. לכידה נאמנה יותר של התפתחות עובריים מוקדם הושגה על ידי הטבעת hESCs במטריצה תלת ממדית החילוץ (ECM) של מטריקס11, מתן הראיות החזק ביותר עד כה על היכולת של hESCs לארגן ולדגמן מודל השלבים המוקדמים של embryogenesis ex vivo. עם זאת, שיטה זו מפיקה תוצאות לא עקביות ולכן היא אינה תואמת למספר דרישות שניתן להשתמש בה כדי לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של הארגון העצמי ומפרט הגורל.

בהינתן אלה השיטות הקיימות ואת המגבלות המתאימות שלהם, חיפשנו לפתח שיטה המתספשות culturing מושבות hESC של גיאומטריות מוגדר בתנאים המודל את הסביבה החילוץ של העובר המוקדם. כדי להשיג את זה, השתמשנו אלקטרופורזה הידרוג'לים של אלסטיות מסוגל לשלוט על תכונות מכניות של המצע. בעזרת מיקרוסקופ כוח אטומי על עוברי העוף הבמה-שלב, מצאנו כי האלסטיות של אפיהפיצוץ נע בין מאות משתמשים בעלי משקפיים לכמה קילו-מיימת. לכן, אנו מתמקדים ביצירת הידרואקרילאמיד polyג'לים עם אלסטיות בטווח הזה כדי לשמש את המצע עבור המושבות hESC. שנינו את השיטות הקודמות שלנו עבור culturing hESCs על אלקטרופורזה הידרוג'ל7,9 כדי לספק שליטה איתנה על הגיאומטריה של המושבות. השגנו זאת על ידי הראשון המכונה ECM ליגנדס, כלומר מטריצות, על שמיכות זכוכית באמצעות סטנסילים מיקרו מפוברק, כפי שדווח בעבר16. לאחר מכן עיצבנו טכניקה מקורית כדי להעביר את הליגלים ולמשטח ההידרואקרילאמיד בזמן הפילמור. השיטה שאנו מתארים כאן כרוכה בשימוש פוטוגרפיה כדי לייצר וופל סיליקון עם דפוסים גיאומטריים הרצוי, יצירת בולים של תכונות גיאומטריות של תזות עם polydiמתיל siloxane (pdms), ושימוש בולים אלה כדי ליצור את הסטנסילים ש בסופו של דבר לאפשר מתקן של ליגנד על פני השטח של כיסוי זכוכית העברה polyacrylamide.

בנוסף על הפיכת הסביבה המכנית של העובר המוקדם, הקמת מושבות hesc על אלקטרופורזה מאפשר את המדידה של כוחות שנוצרו בתא עם מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm), כפי שדווח בשיטה הקודמת שלנו9. בקצרה, חרוזי פלורסנט יכול להיות מוטבע פוליאקרילמיד ומשמש סמנים fiducial. הכוחות שנוצר התא מחושבים על ידי הדמיה העקירה של חרוזים אלה לאחר זריעת hESCs על מצע בדוגמת. יתר על כן, כתוצאה מכך מפות כוח המתיחה יכול להיות משולב עם assays מסורתי, כגון מכתים, כדי לבחון כיצד התפלגות של כוחות התא שנוצר מושבות hESC המוגבלת עשוי לווסת או לווסת איתות במורד הזרם. אנו מצפים שיטות אלה יחשפו כי כוחות מכניים לשחק תפקיד קריטי בתוך המפרט של מפרט הגורל התא במהלך הפיתוח העובריים המוקדמים, כי הוא התעלמו כעת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן בנוגע לשימוש hESCs אושרו על ידי האדם Gamete, העובר ומחקר תא גזע (GESCR) ועדת האוניברסיטה של קליפורניה בסן פרנסיסקו.

1. הכנת וופל סיליקון עם תכונות גיאומטריות

  1. צור פושאול עם תכונות גיאומטריות רצויות. השתמש בתוכנת שרטוט בעזרת מחשב כדי לעצב את התכונות. לשימוש עם photoresist שלילית, הפוך את התכונות לאטומות ושארית המסיכה שקופה.
    הערה: לצורך הקפדה על שמיכות בקוטר 18 מ"מ, תכונות הקבוצה עבור כל תנאי ניסיוני לתוך 10 x 10 מילימטר אזורים כדי להבטיח את הסטנסילים שנוצרו בשלב 3 להתאים על הכיסויים.
  2. מעיל ספין שלילי photoresist על הסיליקון 100 מ"מ וופל. השתמש בגליון הנתונים photoresist כדי לקבוע את המהירות והאורך של ספין כדי ליצור עובי סרט של 100-250 μm.
    הערה: יש לכוונן את עובי הסרט כך שיחס הגובה-רוחב של רוחב הדפוסים לגובה הסטנסיל יהיה קרוב ל1:1 ככל האפשר. עם זאת, אנו ממליצים על עובי מינימלי של 100 μm, כמו כל דבר פחות מייצרת סטנסילים עדינים בקלות דמעה.
  3. עבד את הphotoresist בהתאם לגליון הנתונים של המוצר. זה בדרך כלל כרוך אפייה רכה, חשיפה UV עם פושאול במסכה מסכה, לאחר לאפות החשיפה, פיתוח, ולאפות קשה. כדוגמה, ההליך המשמש לעיבוד המופלים המשמשים בפרוטוקול זה מתואר בטבלה 1.
    הערה: להיות זהירים בעת טיפול וופלים סיליקון כפי שהם שבירים. לאחר שנוצר, ניתן להשתמש בוייפרים שוב ושוב כל עוד הם אינם פגומים.

2. הכנת שמיכות

  1. הכנת כיסוי שטוף חומצה "טופ"
    1. במקום 18 קוטר מ"מ #1 שמיכות בעובי זכוכית צלחת פטרי. המספר המתאים של שמיכות תלוי בגודל של המנה. עבור מנה 100 מ"מ, הכינו 50-100 שמיכות בכל פעם. סכומי הנפח שניתנו בשאר הסעיף מתאימים לצלחת 100 מ"מ.
    2. הוסף 20 מ ל של הHCl 1 מ ' לצלחת פטרי בעדינות לנער את הצלחת לפזר את הכיסויים. לוודא שכל הכיסויים הם שקועים ולשחרר בועות אוויר בין הכיסויים. המלון מעמיד לילה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
      התראה: הHCl חומצית ומאכל. שימוש בזהירות וללבוש PPE מתאים בזמן העבודה עם HCl.
    3. . הHCl הדטית ממנה הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
    4. לאחר להשליך את הכביסה האחרונה, להוסיף 20 מ ל של 100% אתנול למנה. באמצעות מלקחיים, להסיר את הכיסויים בנפרד ולסדר בין שתי פיסות נייר סינון להתייבש.
    5. אחסן שמיכות מיובשות במיכל אטום. שמיכות חומצה שנשטפו ניתן להכין מראש ומאוחסן במשך חודש או יותר בתנאים ללא אבק.
  2. הכנת כיסוי גלוטאלדהיד מופעל "תחתון"
    הערה: עיין בשיטות קודמות לקבלת פרטים נוספים7,9.
    1. במקום 18 קוטר מ"מ #1 שמיכות עובי לצלחת פטרי.
    2. הוסף 20 מ ל של 0.2 M HCl לצלחת פטרי בעדינות לנער את הצלחת לפזר את הכיסויים. לוודא שכל הכיסויים הם שקועים ולשחרר בועות אוויר בין הכיסויים. המלון מעמיד לילה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
    3. . הHCl הדטית ממנה הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
    4. לאחר מחיקת השטיפה הסופי, להוסיף 20 מ ל של 0.1 M NaOH ולטלטל בעדינות כדי לפזר ולטבול שמיכות. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין עבור 1 h.
    5. . כן. הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
    6. לאחר מחיקת השטיפה הסופית, להוסיף 20 מ ל של 1:200 דילול של 3-aminopropyltrimethoxysilane במים באולטרטהורים לרעוד בעדינות כדי לפזר ולטבול שמיכות. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין עבור 1 h או לילה.
      התראה: 3-aminopropyltrimethoxysilane דליק ועלול לגרום לגירוי בעור. לטפל בזהירות, ללבוש PPE מתאים, ולהשליך פסולת על פי תקנות הרשות המקומית.
    7. Decant הפתרון 3-aminopropyltrimethoxysilane מדולל ממנה. הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של לפחות 5 שוטף. זה קריטי להסיר את כל 3-aminopropyltrimethoxysilane לפני שתמשיך.
    8. לאחר להשליך את השטיפה הסופית, להוסיף 20 מ ל של 1:140 דילול של 70% גלוטאלדהיד ב מלוחים באגירה פוספט (PBS) ולטלטל בעדינות כדי לפזר ולטבול שמיכות. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין עבור 1 h או לילה.
      התראה: 70% גלוטארלדהיד הוא רעיל ועלול לגרום לגירוי בעור. לטפל בזהירות, ללבוש PPE מתאים, ולהשליך פסולת על פי תקנות הרשות המקומית.
    9. Decant הפתרון הדבקי מדולל ממנה. הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
    10. לאחר מחיקת השטיפה הסופי, להוסיף 20 מ ל של 100% אתנול. באמצעות מלקחיים, להסיר את הכיסויים בנפרד ולסדר בין שתי פיסות נייר סינון להתייבש.
    11. אחסן שמיכות מיובשות במיכל אטום. גלוטראלדהיד-מופעל כיסוי ניתן להכין מראש ומאוחסן עד שישה חודשים.

3. הדור של סטנסילים לצורך הפקה של ECM ליגאנד

  1. יצירת חותמות ביניים פולימתיתיל (PDMS)
    1. מערבבים בסיס PDMS עם הסוכן לריפוי PDMS ביחס 10:1, לפי משקל. מערבבים ביסודיות.
      הערה: עבור היישום הראשוני של PDMS, להכין כ 100 g של PDMS למלא צלחת 100 מ"מ. עבור יישומים הבאים, הסר PDMS רק ממרכז המנה שבה תכונות סיליקון וופל ממוקמים ולהכין 20-30 g של PDMS חדש.
    2. דגה את התערובת PDMS ב desiccator עבור 30-60 דקות או עד כל בועות האוויר יוסרו.
    3. מניחים את וופל סיליקון שונה משלב 1 לתוך הצלחת 100 mm פלסטיק. שופכים לאט ובאופן שווה את תערובת PDMS על פני השטח של וופל. הקש על המנה על משטח העבודה כדי לשחרר בועות אוויר מהמשטח של הפרוסת.
    4. דגה תערובת PDMS נשפך על וופל עבור 10 דקות או עד כל בועות האוויר יוסרו או הגיעו אל פני השטח של PDMS.
    5. אופים PDMS ב 70 ° c עבור 2 h. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר.
    6. באמצעות אזמל או חותך תיבות, גזור את הקטע של PDMS ממרכז המנה המכילה את התכונות הגיאומטריות.
    7. חותכים את PDMS לתוך בערך 10 x 10 מ"מ ריבועים, כל המכיל את התכונות עבור תנאי אחד ניסיוני. אלה מכונים "חותמות" בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
  2. יצירת לוחות שטוחים של PDMS
    1. מערבבים בסיס PDMS עם הסוכן לריפוי PDMS ביחס 8:1, לפי משקל. להכין כ 20 g עבור כל 100 mm צלחת לשמש. מערבבים ביסודיות.
    2. דגה את התערובת PDMS ב desiccator עבור 30-60 דקות או עד כל בועות האוויר יוסרו.
    3. באיטיות ובאופן שווה לשפוך את PDMS לתוך צלחת 100 mm נקי. הקש על המנה על משטח העבודה כדי לשחרר בועות אוויר.
    4. אופים PDMS ב 70 ° c עבור 2 h. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר.
    5. הסר את ה-PDMS ממנה. היפוך כזה שמשטח ה-PDMS שהיה במגע עם החלק התחתון של המנה פונה כלפי מעלה.
    6. עבור כל חותמת שנוצרה בשלב 3.1, לחתוך ריבוע 15 x 15 מ"מ של PDMS. אלה נקראים "לוחות שטוחים" בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
  3. יצירת סטנסילים
    1. ארגון לוחות שטוחים של PDMS על המכסה של צלחת 150 מ"מ, או משטח שטוח אחר לטיפול קל יותר. להבטיח מרווח מספיק בין לוחות (למשל, עבור צלחת 150 מ"מ, לסדר תשעה לוחות שטוחים עם מרווח אפילו).
    2. היפוך כל חותמת שנוצרת בשלב 3.1 אל לוח שטוח של PDMS, כך שהתכונות על החותמת נמצאות במגע עם הלוח השטוח של PDMS. לחץ בעדינות על החלק העליון של החותמת עם מלקחיים כדי להבטיח אפילו קשר.
    3. בזהירות האביזר המכסה מחזיק PDMS חותמת/לוח זוגות על בסיס של המנה, כך המכסה נח בזווית. זה מסייע החירור של פולימר לריפוי UV בשלב הבא.
    4. מניחים טיפה קטנה של פולימר לריפוי UV בממשק העליון של כל זוג חותמת/לוח. הפולימר יהיה מרושע בין שני על ידי מתח פני השטח, בסיוע כוח הכבידה.
      הערה: פולימרים שונים לריפוי UV עשויים לעבוד בפרוטוקול זה. בחרנו Norland אופטי 74 עבור המאפיינים הבאים: i) מהיר ריפוי על החשיפה לאור UV, ii) הסרה קלה מ-PDMS חותמות על ריפוי, iii) הדבקה חזקה שמיכות זכוכית עם לחץ ידני.
    5. לאחר הפולימר כבר מרושע לחלוטין דרך, למקם את המכסה עם חותמת/לוח זוגות שטוח על משטח העבודה. מניחים טיפה קטנה של פולימר בריפוי UV בכל אחד משלושת הצדדים הנותרים של כל חותמת/לוח ממשק.
    6. באמצעות טיפ 200 μL הצינורות, לחבר את טיפות של פולימר סביב הקצוות של הממשק חותמת/לוח. פעולה זו יוצרת גבול שיחזיק את הפתרונות והפתרון בשלב 4.
      הערה: להיזהר כאשר עובדים את הפולימר סביב קצות החותמת. אם הממשק חותמת/לוח מופרת, הפולימר יהיה הפתיל מתחת לתכונות והסטנסיל לא טופס כראוי.
    7. מניחים בזהירות את צמדי החותמות/הלוח לתוך תיבת העיקור של UV. השתמש בהגדרת צריכת החשמל הסטרילית "Str" והתחשוף אותה למשך 10 דקות.
    8. הסר את צמדי החותמות/לוח מתוך תיבת העיקור של UV. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להסיר בעדינות את החותמת PDMS תוך החזקת את הלוח שטוח ואת הסטנסיל שנוצרו מפולימר לריפוי UV.
    9. באמצעות מלקחיים, בזהירות להסיר את הסטנסיל ולהפוך אותו כך את פני השטח שהיה במגע עם הלוח השטוח של PDMS הוא פונה כלפי מעלה.
      הערה: הסטנסילים עדינים. היזהר בעת מתן אותם, במיוחד בעת הסרתם הראשונית של PDMS, כך שהם לא לקרוע.
    10. מניחים את הסטנסילים הפוכים בחזרה לתוך תיבת עיקור-UV. השתמש בהגדרת צריכת החשמל הסטרילית "Str" והחשיפת המשך 3 דקות.

4. המשך התנועה של ECM ליגאנד על שמיכות

  1. הקשה סטנסילים על שטיפת חומצה שנשטפו
    1. מקום אחד שטוף חומצה שטופים עבור כל סטנסיל על פיסת נקי של סרט מעבדה.
    2. באמצעות מלקחיים, בזהירות למקם כל סטנסיל, שטוח בצד-למטה, על שטיפת חומצה שטוף שמיכות. מקום כזה תכונות ממורכזים על הכיסויים.
    3. מניחים פיסת סרט מעבדה קטנה על גבי כל סטנסיל. לחץ בחוזקה ובאופן שווה על הסטנסיל כדי ליצור קשר חזק בין הסטנסיל לבין הכיסויים.
      הערה: זהו צעד קריטי! לחץ בחוזקה על פני השטח כולו של הסטנסיל. אם לא נוצר קשר מספיק, הפתרון ידלוף בין הסטנסיל לבין הכיסויים והמפנג ייכשל. אופציונלי: כדי לאשר את הקשר מספיק בין הסטנסיל לבין שמיכות, פיפטה 100 μL של מים סטרילי באולטרסאונד על פני השטח של כל סטנסיל ו הדגירה בטמפרטורת החדר. . אחרי השעה 1, תבדקו אם יש דליפה מתיף מים מסטנסילים מוצלחים וממשיכים.
  2. פלזמה ניקוי המשטח של הכיסויים שמיכות כדי להגדיל את hydrophilicity
    1. מניחים את הכיסויים עם סטנסילים לתוך מנקה פלזמה. החלת פלזמה בעוצמה גבוהה עבור 30 s.
  3. הכנת תמיסת ECM
    הערה: יש להשלים את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים, במידת האפשר.
    1. המקום סטרילי 100 mM HEPES, 100 mM הנאקל, pH 8.0 פתרון על קרח. פעם קרה קרח, להוסיף מטריצות ו קולגן כדי להשיג ריכוזים של 225 μg/mL ו 25 μg/mL, בהתאמה. אופציונלי: לפתרון בעיות או לליגיון ויזואליזציה, כוללים ליגולי מתויג בתמיסה מתוייגת.
      1. הערה: ליגנדס שונים של ECM ניתן להשתמש בשיטה זו. עבור ליגניות שונות, אופטימיזציה נוספת עשויה להיות נדרשת כדי לקבוע ריכוז אידיאלי, זמן דגירה, וטמפרטורת דגירה. לקבלת מידע נוסף, עיין בסעיף הדיונים.
    2. הפיפטה והתמיסה על פני השטח של כל סטנסיל. עבור סטנסילים שנעשו מ 10 x 10 מילימטר בולים מרובעים, להחיל 100 μL לכל סטנסיל.
    3. בדוק אם יש בועות אוויר בתכונות סטנסיל. במקרה הצורך, השתמשו בעזרת מלקחיים משובחים או בתשר 2 μL כדי להסיר בועות אוויר מהתכונות.
      הערה: זהו צעד קריטי! אם בועות אוויר נשארים לכודים על פני השטח של שמיכות, ליגאל לא ספוח על פני השטח ואת הדפוס שנוצר יהיה לא שלם.
    4. מניחים את הכיסויים שמיכות עם ליגנד לתוך תבשיל, לעטוף עם סרט מעבדה, ו דגירה ב 4 ° c בלילה.

5. העברת ליגל ג'ל פוליאקרילמיד

  1. הסרת פתרונות וסטנסיל מכל שמיכות
    1. מנושף את התמיסה מפני השטח של סטנסיל. ניתן לאסוף ולאחסן פתרון לligand במהלך 4 ° c ולהשתמש בו במשך עד חודש.
    2. באמצעות מלקחיים, בקצרה להטביע את שמיכות עם סטנסיל לתוך מנה המכילה PBS סטרילי לשטוף.
    3. בקצרה לטבול את שמיכות עם סטנסיל למנה השנייה של ה-PBS סטרילי לשטוף.
    4. הסר את הסטנסיל מהמשטח של הכיסויים. . תיזהר לא לשבור את הסרבל
    5. בקצרה לטבול את שמיכות לתוך תבשיל המכיל מים סטרילי באולטרסאונד כדי להסיר מלחים משטף PBS. הקש על קצה הכיסויים כדי למחוק משימה עדינה כדי לנקות את המים העודפים.
    6. , תייבש את הסרבל תחת גז אדיש. כמו חנקן סמן את החלק התחתון של הכיסויים כדי לעקוב אחר האוריינטציה מנקודה זו והלאה. להיזהר לשמור על הצד בצד כלפי מעלה.
    7. חזור על הצעדים ה5.1.1 דרך 5.1.6 עבור כל שמיכות.
  2. הפיכת פוליאקרילאמיד הידרוג'לים עם שמיכות מקושטות
    הערה: עיין בשיטות קודמות עבור פרטים נוספים7,9 לעקר את כל מחזיקי כובע, צינורות, מרווחים המשמשים כדי ליצור ג'לים אלקטרופורזה על ידי שטיפת עם 10% אקונומיקה לילה, שטיפה עם מים לפחות חמש פעמים כדי להסיר אקונומיקה, ולשטוף לזמן קצר ב-70% אתנול. מניחים את כל החלקים על מגבונים משימה עדינה בארון ביולוגי סטרילי להתייבש לפני השימוש.
    1. הכינו פתרון פוליאקרילמיד להשגת אלסטיות הידרוג'ל רצויה (שולחן 2). מערבבים יחד את כל הרכיבים למעט מיקרואואונטים של הפלורסנט ופרסולפט האשלגן (PPS).
      הערה: הכינו פתרון של 1% אשלגן פרסולפט טרי בכל פעם.
    2. דגה פתרון פוליאקרילאמיד, מיקרוספירות, ו-PPS בצינורות נפרדים תחת ואקום עבור 30 דקות.
    3. עבור כל שמיכות בדוגמת מילוי, הכינו שמיכות "תחתון" המופעל עם מרווח (בקוטר 18 מ"מ, קוטר 14 מ"מ) הממוקם על גבי.
    4. לאחר הsonicate, בקצרה ומוסיפים את הנפח המתאים לפתרון פוליאקרילאמיד. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה, להיות זהירים לא להציג בועות אוויר. . Sonicate בקצרה
    5. הוסף נפח מתאים של PPS לפתרון הפוליאקרילמיד. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הפתרון, להיות זהירים לא להציג בועות אוויר.
      הערה: לאחר הוספת PPS, עבוד במהירות כדי להשלים את הצעדים 5.2.6 דרך 5.2.11 לפני פוליאקרילאמיד פילמור.
    6. פיפטה 75-150 μL (בהתאם לעובי של מרווח) למרכז של כל מחליק גלוטאלדהיד מופעל.
    7. באמצעות מלקחיים, מקום שמיכות בדוגמת על כל glutarאלדהיד מופעל coverslip עם פוליאקרילאמיד ומרווח, כך בדוגמת ליגאט הפנים את הפתרון אלקטרופורזה. אם התווסף פתרון פוליאקרילמיד, מתח פני השטח יהיה לפתיל אלקטרופורזה בין שתי שמיכות ולא בועות אוויר יהיה נוכח.
    8. להרים כל אלקטרופורזה "סנדוויץ" ובזהירות לגעת בצד כדי משימה עדינה לנגב כדי הפתיל החוצה פתרון אלקטרופורזה העודפים.
    9. בזהירות המקום כל אלקטרופורזה "סנדוויץ" לתוך מחזיק כובע עם חוטים התואמים 15 mL בצינורות התחתון חרוי. הכיוון צריך להיות כזה כי החלק התחתון של שמיכות glutarאלדהיד היא במגע עם החלק התחתון של מחזיק כובע, ואת שמיכות בדוגמת הוא על גבי.
    10. בורג 15 מ"ל בתחתית הצינור לתוך כל מחזיק כובע להחזיק את" סנדוויצ'ים "פוליאקרילאמיד במקום. הצינורות צריכים להיות צמודים כדי למנוע דולף, אבל להיזהר לא להדק ולפצח את הכיסויים.
    11. צנטריפוגה את "סנדוויצ'ים" פוליאקרילאמיד בצינורות הסווינג ב-200 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את הצינורות מהצנטריפוגה והניחו בארונות הצינורות כדי לשמור על אוריינטציה של 50 דקות נוספות על מנת להבטיח את מלוא הפילמור. לשמור מכוסה נייר כסף כדי למנוע הלבנת של מיקרוספירות פלורסנט.
      הערה: צנטריפוגה הוא קריטי בעת שימוש בשיטה זו לביצוע TFM. הכוח הצנטריפוגלי מזיז את כל המיקרוספירות למישור אחד, שבסופו של דבר יהיה ממש מתחת לפני המים של ההידרוג'ל. הדבר אידיאלי עבור הדמיה ננו-ספירה displacements מיקרוספירה המשמשים לחישוב מדגיש המתיחה התא שנוצר. אם לא ביצוע TFM, ניתן להשאיר את המיקרוספירות מחוץ לתמיסה הפוליאקרילמיד, והפלוניזציה יכולים להופיע בראש הספסל ללא צנטריפוגה.
    12. להסיר את "סנדוויצ'ים פוליאקרילאמיד" מצינורות ולטבול ב-PBS בצלחת 100 מ"מ. לעטוף את הסרט מעבדה הדגירה עבור 3 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
  3. הכנת ג'לים מקושטות לזריעת תאים
    1. השתמש אזמל מלקחיים כדי להסיר בזהירות את שמיכות בדוגמת ואת מרווח מן הסנדוויץ ' אלקטרופורזה "כאשר הוא נשאר מתחת לשמש ב-PBS. הדוגמאות הללו יועברו לפוליאקרילאמיד בזמן הפילמור ויישארו לאחר הסרת הכיסויים. ג'ל הפוליאקרילמיד יישאר מחובר. לכיסויים של הגלואלדהיד
      הערה: זהו צעד קריטי! הפוליאקרילאמיד חייב להיות מתחת לערוץ הPBS בזמן הסרת הכיסויים או הליגודפוסי יושמדו.
    2. מניחים כל שמיכות עם פוליאקרילאמיד בדוגמת מחזיק כובע. מניחים אטם (בקוטר 18 מ"מ החיצוני, 14 מ"מ קוטר פנימי) על גבי coverslip וסביב פוליאקרילאמיד, שם החלל היה ממוקם. בורג הצינור 15 מ"מ מתחת למכסה הכיפה, ויוצרים באר עם פוליאקרילמיד בתחתית. ההרכבות הללו מתאימות לבארות של צלחת 12-באר סטנדרטית לטיפול קל.
    3. לשטוף כל ג'ל על ידי הוספת 500 μL של PBS להרכבה היטב. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין. הסר את PBS וחזור פעמיים על סך של שלוש שטיפות.
    4. לאחר שטיפת PBS הסופי, להוסיף 500 μL של מדיית נוקאאוט-DMEM דיה ל ג'לים ו-דגירה ב 37 ° c לילה. ג ' לים ניתן לשמור ב 37 ° צ' עם מדיה עד 5 ימים לפני זריעת תאים.
    5. יום לפני זריעת תאים, החלף את נוקאאוט-DMEM עבור התקשורת המלאה KSR ו-דגירה ב 37 ° c לילה.

6. culturing hESCs על בדוגמת ג'ל

הערה: אם אתה מתכנן לתקן דגימות עבור מכתים לאחר TFM, לקחת תמונות של תנוחות מיקרוספירה לא הדגיש לפני זריעת תאים. במקרה זה, מתויג ליגולי יש להשתמש בשלב 4.3.1 כך שמיקומי התאים בסופו של דבר יהיו ידועים לפני זריעה ומיקרוספירות ניתן לדימות באזורים אלה.

  1. שמירה על תרבויות hESC מניות ותרבויות ללא מאכיל משני הכין לוחות מצופים מטריצות ב-KSR מדיה ממוזג לפני זריעה על ג'ל פוליאקרילאמיד בדוגמת כמתואר בעבר9.
    הערה: ליצור מדיה KSR ממוזג על ידי העכבר הקרינה מעובריים מתחלקים בכלי התקשורת KSR מדיה בתוספת 4 ng/mL בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם (bFGF). לאסוף ולהחליף מדיה כל 24 שעות.
  2. . מרוב התקשורת מhESCs שטוף בקצרה עם מדיית נוק-דאמ. הוסף 0.05% טריפסין-EDTA שיושלם עם 10 μM Y27632 (Rho קינאז מעכבי) ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 5-10 דקות.
  3. הוסיפו מדיה עם סרום למניעת טריפסין. מתיף בעדינות את המדיה ואת הפיפטה מעל הצלחת כדי להסיר תאים. המשך ללטף בעדינות כדי להסיר את כל התאים ולנתק אשכולות תאים לתאים בודדים.
  4. לאסוף את ההשעיה התא ואת צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות.
  5. ולהקפיא את הגלולה בנפח שווה ערך של מדיית KSR כדי לשטוף. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות.
  6. מריף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה במדיית KSR ממוזגת בתוספת 10 ng/mL bFGF ו -10 μM Y27632.
  7. לספור את התאים עם הומוציטוטומטר ולהתאים את ההשעיה התא לריכוז של 300,000 תאים לכל mL. פיפטה 500 μL של התא הבולם על כל ג'ל בדוגמת מילוי (150,000 תאים לכל ג'ל).
  8. 3 שעות לאחר זריעה, להשתמש בפיפטה כדי להפיח בקפידה את המדיה מכל ג'ל ולהחליף עם מדיה ממוזג KSR טריים בתוספת 10 ng/mL bFGF ו 10 μM Y27632. פעולה זו מסירה את התאים העודפים שאינם דבקים באזורים בדוגמת הפוליאקרילאמיד.
    הערה: זהו צעד קריטי! בתאים אלה בשלב זה יהיה באופן רופף לגמתבנית. היזהר מאוד בעת החלפת מדיה כדי לא לנתק את התאים. יש לקחת טיפול שווה עם כל אחד מחילופי המדיה בצעדים הבאים.
  9. 24 שעות לאחר זריעה, השתמש בפיפטה כדי להפיח בזהירות את התקשורת ולהחליף מדיה ממוזג KSR בתוספת 10 ng/mL bFGF ו 5 μM Y27632.
  10. 48 h לאחר זריעת, השתמש בפיפטה כדי להפיח בזהירות את התקשורת ולהחליף מדיה KSR ממוזג בתוספת 10 ng/mL bFGF. דבר זה מסיר את מעכבי Rho קינאז מהתקשורת ומהניסיונות להתחיל ביום הבא, 72 h לאחר זריעה.

7. ביצוע TFM

  1. כאשר תרצה, בצע TFM כפי שתואר בעבר9 תחת התנאים הניסיוניים הרצוי.
  2. אם משרות מיקרוספירה לא הדגיש את התמונה לפני זריעת תאים, לתקן את התאים לאחר נטילת עמדות מיקרוספירה הדגיש ולבצע כתמים כדי לקבוע לוקליזציה של חלבונים הריבית ביחס אזורים של כוחות המתיחה גבוה ונמוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האתגר העיקרי להתגבר בניסיון hESCs תרבות במושבות של גיאומטריה מבוקרת על מצעים תואמי הוא ליצור דפוס הומוגנית של ECM-ligand על פני השטח של המצע. האסטרטגיה המוצגת בשיטה זו כרוכה תחילה ביצירת התבנית הרצויה על פני השטח של שמיכות זכוכית ולאחר מכן מעבירים את הדפוס למשטח של הידרואקרילאמיד במהלך פולימוניזציה של ג'ל (איור 1 A). לכן, חשוב לוודא שהתבנית הרצויה נוצרת בהצלחה על פני השטח של שמיכות הזכוכית לפני שממשיכים לנוע בעזרת ההידרוג'ל והעברת התבנית (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לפשט פרוטוקול ארוך ומפורט, שיטה זו מורכבת משלושה שלבים קריטיים: 1) יצירת תבניות של ecm ליגנד על כיסוי זכוכית, 2) העברת הדפוסים להידרואקרילאמיד במהלך פולימוניזציה של ג'ל, ו 3) זריעה hESCs על ה בדוגמת הידרוג'ל. ישנם שלבים קריטיים שיש להתחשב בהם בכל אחד משלושת השלבים הללו. על מנת ליצור דפוסים בעלי אמינות גבוהה על שמיכות זכוכית, הסטנסיל חייב להיות לחוץ היטב על שמיכות כדי למנוע דולף של הפתרון ואת כל בועות האוויר יש להסיר לאחר הוספת ליגנד פתרון למשטח של הסטנסיל ( איור 1ג). אם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוני לאשר מימון מ-CIRM גרנט RB5-07409. J.M.M. רוצה להודות FuiBoon Kai, Dhruv Thakar, ו רוג'ר ריה עבור דיונים שונים שהדריך את הדור ופתרון בעיות של שיטה זו. J.M.M. גם תודה מלגת הגילוי של מדינת קליפורניה לתמיכה המתמשכת של עבודתו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסיןגיבקו25300054
צלחת פטרי מזכוכית 100 מ"מפישר סיינטיפיק08-747B
צלחת פטרי מפלסטיק 100 מ"מפישר סיינטיפיקFB0875712
15 מ"ל צינורות תחתונים חרוטייםקורנינג352095
150 מ"מ צלחת פטרי מפלסטיקפישר סיינטיפיקFB0875714
18 מ"מ קוטר #1 כיסוייםThermo Scientific18CIR-1
2% ביסקרילאמידBio-Rad161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilaneACROS Organics313251000
40% אקרילאמידBio-Rad161-0140
רדיד אלומיניוםפישר סיינטיפיק01-213-100
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסיSigma-AldrichF0291
אקונומיקהCloroxN/A
צנטריפוגה עם דליים מתנדנדיםEppendorf22623508דגם: 5804 R
קולגןקורנינג354236
DessicatorFisher Scientific08-642-7
אתנולפישר סיינטיפיקAC615095000
עוברי סרום בקרGibco16000044
מיקרוספירות פלואורסצנטיותThermo ScientificF8821
מלקחיים (לכיסויים)Fisher Scientific16-100-122
מלקחיים (לפלים)Fisher Scientific17-467-328
מחזיקי ג'לN/AN/Aמחזיקי ג'ל מודפסים בתלת מימד בהתאמה אישית, ציור CAD זמין על פי בקשה
GlutaraldehydeFisher Scientific50-261-94
HEPESThermo ScientificJ16926A1
פלטה חמהFisher ScientificHP88854100
חומצה הידרוכלוריתFisher ScientificA144S-500
איזופרופיל אלכוהולFisher ScientificA416-500
Kimwipes (מגבונים עדינים למשימה)החלפת סרום Kimberly-Clark Professional34120
KnockoutGibco10828028
Knockout-DMEMGibco10829018
Mask (לפוטוליתוגרפיה)Karl Suss America, Inc.Karl Suss MJB3 Mask Aligner
MatrigelCorning354277
מיקרוסקופ לכוח משיכהNikonN / Aדגם: Eclipse TE200 U
שלב מיקום ממונעמדעי קודם/Aדגם: HLD117
גז חנקןAirgasNI 250
דבק אופטי נורלנד 74 (פולימר הניתן לריפוי UV)נורלנד מוצריםNOA 74
תנורתרמו סיינטיפיקPR305225G
פרפילם (סרט מעבדה)פישר סיינטיפיק13-374-12
PDMS (סילגארד 184)פישר סיינטיפיקNC9285739
פוטומסכת צילוםCAD/Art Services, Inc.מסכות צילום לא ישימות מיוצרות בהתאמה אישית. ציור CAD לעיצובים שלנו זמין על פי בקשה
מנקה פלזמהפישר סיינטיפיקNC9332171
פלסטיק לאטםמריאן שיקגוHT6135
פלסטיק למרווחTAP פלסטיקN / Aגיליון פוליקרבונט, עובי 0.01 אינץ'
אשלגן כלורי (להכנת PBS)פישר סיינטיפיקP217-500
אשלגן פוספט מונוביסי (להכנת PBS)פישר סיינטיפיקP285-500
פוטאסיום פרסולפטACROS Organics424185000
אזמלפישר סיינטיפיק14-840-00
פרוסת סיליקוןמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית71893-06סוג P, 3 אינץ', פרוסות סיליקון
נתרן כלורי (להכנת PBS)פישר סיינטיפיקS271-1
נתרן הידרוקסידפישר סיינטיפיקS318-100
נתרן פוספט דיהידראט (להכנת PBS)פישר סיינטיפיקS472-500
SU8-3050 פוטו-רזיסטMicroChemSU8-3000
SU8-מפתחMicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
קופסת עיקור UVBio-RadN/ABio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (מעכב Rho kinase)StemCell Technologies72304
N

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001(2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Human Embryonic Stem CellsPolyacrylamide HydrogelsTraction Force MicroscopyColony Geometry ControlCompliant SubstratesExtracellular Matrix PatterningPDMS Stencil FabricationFluorescent Ligand TransferCell Fate SpecificationMechanical Cues Analysis

מאמרים קשורים