אפיון מרובה של סוגי תאים שאוחזרו ממוח העכבר/חוט השדרה דרך שיטות הומוקות שונות

Summary

אנו מציגים שיטת הזרמה cy, כדי לזהות בו סוגי תאים שונים שאוחזרו ממוח העכבר או חוט השדרה. שיטה זו יכול להיות מנוצל כדי לבודד או לאפיין אוכלוסיות תאים טהורה במחלות ניווניות או לכמת את היקף המיקוד של התא על vivo ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים.

Abstract

ההתקדמות האחרונה ב וקטורים וקטוריים ומדעי הננו פתחו את הדרך לגישות חדשניות לקידום החקירה או לטיפול במערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, אופטימיזציה נוספת של טכנולוגיות אלה היה להפיק תועלת מהשיטות המאפשרות מהירה ולייעל את היקף מידת המיקוד הספציפי לתא על ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים בגוף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מנצל את התפוקה הגבוהה ואת יכולות ריבוב של זרימה cy, נסה לאפשר כימות ישירה של תת תאים שונים מבודדים ממוח העכבר או חוט השדרה, כלומר microglia/מקרופאגים, לימפוציטים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך, נוירונים ותאי אנדותל. אנו מיישמים גישה זו כדי להדגיש הבדלים קריטיים בין שתי שיטות הומוקות רקמות במונחים של התשואה התא, הכדאיות והקומפוזיציה. הדבר יכול להורות למשתמש לבחור את השיטה הטובה ביותר בהתאם לסוג התא (ים) של עניין וליישום הספציפי. שיטה זו אינה מתאימה לניתוח של התפלגות אנטומית, שכן הרקמה היא הומוגניים כדי ליצור השעיה תא בודד. עם זאת, הוא מאפשר לעבוד עם תאים קיימא והוא יכול להיות משולב עם מיון תאים, פתיחת הדרך עבור מספר יישומים שיכולים להרחיב את הרפרטואר של כלים בידיים של נוירומדען, החל הקמת התרבויות הראשיות נגזר אוכלוסיות תאים טהורים, לניתוח גנים ביטוי ביוכימיים או פונקציונלי מוגדר על תת-מוגדרים היטב תאים בהקשר של מחלות ניווניות, על טיפול תרופתי או טיפול גנטי.

Introduction

ג'ין וטכנולוגיות משלוח התרופה (כגון וקטורים וקטורי חלקיקים) הפכו כלי רב עוצמה שניתן להחיל כדי להשיג תובנות טובות יותר על מסלולים מולקולריים ספציפיים שונה במחלות ניווניות ולפיתוח גישות טיפוליות חדשניות^1,2,3. אופטימיזציה של כלים אלה מסתמך על כימות של: (1) את היקף החדירה בתוך ה-CN על נתיבי שונים של ניהול ו (2) פילוח של אוכלוסיות תאים ספציפיות. ניתוחים היסטלוגיים מוחלים בדרך כלל על הדמיה של הכתב הפלורסנט גנים או fluorescently אופן מתויג חלקיקים באזורים שונים של המרכז העצמי ועל פני סוגי תאים שונים, מזוהה על ידי כתמים חיסוני עבור סמנים תא ספציפיים^4,

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של דנה פרבר סרטן המכון (פרוטוקול מספר 16-024).

1. הכנת הפתרונות הדרושים לניסוי

1. הכינו את פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS) על ידי דילול של 10 x HBSS עם מים סטריליים. . לפני שתרגיע את הפתרון בקרח לפחות 25 מ ל של פתרון נחוצים עבור כל דוגמה.
2. להכין את התמיסה הפרסואלי של חלחול (IPS) על ידי ערבוב של 10x 1:10 HBSS סטרילי עם צפיפות מעבר בינונית (כלומר, חלחול). . לפני הצינה בקרח
   הערה: IPS ניתן לאחסן עד 30 יום ב -4 ° c.
3. להכין את הזרימה cy, לחסום את התמיסה (BL) פתרון (1% בסרום פרה אלבומין [BSA], 5% סרום של שור העובר [FBS] ב מלוחים מואגור פוספט [....

Results

השוונו שתי שיטות שונות של הומוגון (DH נגד PD) להחיל על המוח העכבר ואת חוט השדרה, כדי לבדוק את היעילות באחזור סוגי תאים שונים קיימא מתאים ליישומי מטה. כדי לעשות זאת, אנו מנצלים 9-צבע הפאנל cy, לנסות לאפיין, במדגם זהה, סוגים שונים של תאי ה-CN הכוללים microglia, לימפוציטים, נוירונים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך ו אנדותל.

המוח ורקמות חוט השדרה אוחזרו מעכברים שונים (n ≥ 6), פיצול בשני חצאים longitudinally, שקלה ומעובד במקביל על ידי החלת שיבוש מכני או באמצעות הומוגניד (שיטת DH) או טחון בעדינות.......

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח שיתוף טיהור וזרימה במקביל של חלק מתאי ה-CN הרלוונטיים ממוח העכבר וחוט השדרה. באופן מסורתי, ניתוחים היסטולוגיים הוחלו כדי לתאר את התפלגות חלקיקים או את היעילות התמרה של וקטורים ויראליות ב-cn^5,13, או כדי לספק תובנות על שינויים מורפולוגיים ומולקולריים המתרחשים סוגי תאים ספציפיים במהלך פתולוגיה או על טיפול תרופתי¹⁴. עם זאת, היסטולוגיה חסר מעבד והוא אינו מאפשר בדיקה מקיפה של תכונות מרובות באותם דגימות היסטולוגית, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (ללא סידן, מגנזיום כלוריד ומגנזיום גופרתי)	Gibco	14185-052
70 מ"מ מסננת תאים	קורנינג	431751
נוגדן נגד עכבר ACSA/ACSA2	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC
מצומד בקר סרום אלבומין	סיגמא אולדריץ'	A9647-1KG
CD11b נוגדן	נגד עכבריםInvitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 מצומד
CD31 נוגדן נגד עכבר	חולדה BD Bioscience	562939	BV421
מצומד CD45 נוגדן נגד עכבר	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 מצומד
CD90.1/Thy1.1 נוגדן נגד עכבר עכברים	Biolegend	202518	PE/Cy7 מצומד
CD90.2/Thy1.2 נוגדן	נגד עכבר עכבריםצינורות	1005325	PE/Cy7
(15 מ"ל)	צינורות חרוטיים של CellTreat	229411
(50 מ"ל)
Dounce (כולל טיט כמו גם עליים A ו-B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) נוגדן נגד עכבר עכברוש	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 נוגדן נגד עכברים/חולדות/אנושיים	Miltenyi Biotec	130-095-895	ביוטין מצומד
Percoll	GE Healthcare	10266569	נמכר כמגיב לא סטרילי
Percoll	Sigma	65455529	מגיב סטרילי (שישמש ליישומים הדורשים סטריליות)
מגיב Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	המכיל עקבות נמוכים מאוד של אנדוטוקסין
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 מצומד