מודל שלפוחית השתן מאפשר גישה ישירה לסובורוטנום כדי ללמוד מנגנונים מקומיים לוויסות זמינות מגשרת פעילה ביולוגית בסווברואלינום/לאמה קינאה במהלך אחסון ובדיקת שתן. ההכנה דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן והיא מאפשרת לבצע מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו ללא השפעות מערכתיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מבוזרים (Ex Vivo) מורלין מודל שלפוחית השתן עם השריר הדטראאור הוסר עבור גישה ישירה Suburothelium במהלך מילוי שלפוחית השתן
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרים קודמים הקימו את שחרורו של חומרים כימיים מן הסדינים שטוח רירית השלפוחית מודבקת בתאי Ussing וחשופים שינויים בלחץ הידרוסטטי או למתוח מכני ומתאי אורוטאליאל מתורבת על שינויי לחץ הידרוסטטי, למתוח, תא נפיחות, או לגרור כוחות, ובשלפוחית השתן בסוף מילוי. ממצאים כאלה הובילו את ההנחה כי מגשרים אלה שוחררו גם suburothelium (SubU)/lamina קינא (LP) במהלך מילוי שלפוחית השתן, שם הם משפיעים על התאים עמוק בקיר שלפוחית השתן כדי להסדיר בסופו של דבר את שלפוחית השתן. יש לפחות שתי מגבלות ברורות במחקרים כאלה: 1. אף אחת מגישות אלה אינה מספקת מידע ישיר על נוכחות המגשרים בסובו/LP, ו-2) הגירויים ששימשו אינם פיסיולוגיים ואינם ממלאים את השלפוחית במילוי אותנטי של שלפוחית השתן. כאן, אנו דנים הליך המאפשר גישה ישירה אל פני השטח suburothelial של רירית שלפוחית השתן במהלך מילוי שלפוחית השתן. ההכנה המבטלת-חופשית שיצרנו דומה מאוד למילוי של שלפוחית השתן ומאפשרת מחקרים בלחץ-נפח שיבוצעו על שלפוחית השתן בהעדר איתות מתוך רפלקסים מעמוד השדרה והשריר החלק. באמצעות מודל שלפוחית השתן הרומן הספר, הדגמנו לאחרונה כי מדידות הפנימי של המגשרים אינם יכולים לשמש כפרוקסי למה שוחרר או נוכח SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן. המודל מאפשר בדיקת מולקולות איתות נגזרות מסוג urothelium שפורסמו, שנוצר על-ידי חילוף החומרים ו/או מועברים לתוך SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן כדי להעביר מידע לנוירונים ושריר חלק של שלפוחית השתן ולווסת את הרגש שלה במהלך המשך ו-micturition.
מבוא
מטרת מודל זה היא לאפשר גישה ישירה לצד submucosal של רירית שלפוחית השתן במהלך שלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן.
שלפוחית השתן חייבת להימנע התכווצות מוקדמת במהלך מילוי וריק כאשר הנפח הקריטי והלחץ מגיעים. מסלול לא תקין או הרקה של שתן משויכים לעתים קרובות עם מרגש נורמלי של שריר הדטרואו חלק (DSM) במהלך מילוי שלפוחית השתן. הרגש של DSM נקבע על ידי גורמים פנימיים לתאי השריר חלקה ועל ידי השפעות שנוצרו על ידי סוגי תאים שונים בתוך הקיר שלפוחית השתן. הקיר של שלפוחית השתן מורכב מאורואלינום (רירית), סובורוטנום (SubU)/לאמינה קינאה (LP), שריר החלקה (DSM) ו serosa (איור 1A). האורוטנום מורכב מתאי מטריה (כלומר, השכבה החיצונית ביותר של האורואלינום), תאי ביניים ותאי בסיס (כלומר, השכבה הפנימית ביותר של האורואלינום). סוגים שונים של תאים, כולל תאים ביניים, תאי מסופים, מסופי עצבים כלי לימפה, כלי דם קטנים, ותאים חיסוניים שוכנים subu/LP. ההנחה היא ששלפוחית השתן היא עוגב חושי היוזם מיקרו-מתווכים של רפלקס ומוסר על ידי שחרור המגשרים לתוך רירית המשנה המשפיעים על התאים ב-subu/LP ו-DSM1,2,3. לרוב, הנחות כאלה מבוססות על מחקרים שהפגינו שחרור מגשרים: מפיסות רירית חשופים לשינויים בלחץ ההידרוסטטי4,5; מתוך מגוון התאים המתורבתות חשופים למתיחה6,7, היפוטונזה המושרה תא נפיחות7 או לגרור כוחות8; מתוך שלפוחית בודדה רצועות קיר על הקולטן או הפעלה עצביים9,10,11,12,13,14; ובשלפוחית השתן לומן בסוף שלפוחית השתן מילוי15,16,17,18,19. בעוד שמחקרים כאלה היו אינסטרומנטלי להפגין שחרור של מגשרים על גירוי מכני של מקטעי קיר שלפוחית השתן או תאים מתורבתים של אורוטאליאל, הם צריכים להיות נתמכים על ידי ראיות ישירות לשחרור של מגשרים ברירית המשנה כי הוא הרוויח על ידי גירויים פיסיולוגיים לשכפל מילוי שלפוחית השתן. זוהי משימה מאתגרת בהתחשב בעובדה SubU/LP ממוקם עמוק בתוך הקיר שלפוחית השתן מכניסה את הגישה הישירה לקרבת SubU/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן.
כאן, אנו להמחיש מבוזר (ex vivo) מודל שלפוחית השתן murine עם שריר השריר הוסר13 אשר פותחה כדי להקל על מנגנונים מקומיים של המנגנון המנגנון השתתפות האיתות בין שלפוחית השתן urothelium, DSM וסוגי תאים אחרים בקיר שלפוחית השתן. גישה זו היא מעולה לשימוש סדינים שטוח הקיר, רצועות הקיר שלפוחית השתן או התאים התרבותיים אורוטאליאל משום שהוא מאפשר מדידות ישירה בקרבת SubU/LP של urothelial המגשרים, כי הם שוחרר או הוקמה בתגובה ללחצים פיזיולוגיים וכלי שלפוחית השתן וימנע השינויים הפוטנציאליים בתרבות התא ניתן להשתמש בו כדי למדוד זמינות, שחרור, חילוף החומרים והעברת התחבורה של המגשרים SubU/LP בשלבים שונים של מילוי שלפוחית השתן (איור 1B). ההכנה יכולה לשמש גם כדי לבחון את האיתות האורואליאל והמכונה במודלים של תסמונות שלפוחית השתן הפרוע.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים המתוארים בכתב יד זה נערכו על פי מכון הבריאות הלאומי לטיפול והשימוש בבעלי חיים מעבדתיים והשימוש בבעלי חיים מוסדיים וועדת הטיפול באוניברסיטת נבאדה.
הערה: הדגם המוצג כאן מורכב מהסרת השריר הדטראאו בעוד שהאורוטאום וסובו/LP מנותרים ללא פגע (איור 1ב) כדי לאפשר לחוקרים גישה ישירה אל subu/LP במהלך מילוי שלפוחית השתן.
1. הכנת הדטראאור-הכנה לשלפוחית השתן ללא תשלום
- מניחים את שלפוחית השתן המבודדת בצלוחית מחולקת עם קור (10 ° c) ו חמצן עם 5% CO2/95% O2 קרבס ביקרבונט פתרון (kbs) עם ההרכב הבא (mM): 118.5, 4.2 Kbs, 1.2 mgcl2, 23.8 נחקו3, 1.2 KH2PO4, 11.0 דקסטרוז, 1.8 cacl2 (pH 7.4)13.
- להצמיד חלק קטן של הכיפה של שלפוחית השתן המבודד כדי מכסה מכוסה Sylgard ממולא KBS. ודא כי הסיכה עוברת דרך פיסת serosa או הקצה החיצוני של השריר העמוק הרחק מן הקצה הפנימי של השריר הפונה אל SubU/LP.
- באמצעות מיקרוסקופ, לזהות את השופכה ואת ureters ולהצמיד כל אחד מהם לתחתית הצלחת לבתר.
- הסירו את עודפי האדיפוז ורקמות החיבור כך שכל הגוף העיקרי של שלפוחית השתן, השופכה ושני השופכה יוצגו.
- לקשור את הureters עם 6-0 תפרים ניילון. לאחר מכן, הצמד את הקצוות הפתוחים של השופכה לעבר החלק התחתון של הצלחת הבתר כדי לאבטח את התכשיר.
- בעזרת מלקחיים דקים, משוך בעדינות את החלק של serosa בפינה בין השופכה לבין גוף שלפוחית השתן.
- התאימו את האור של המיקרוסקופ כדי להגדיל את השקיפות ולהבדיל בין משולי רירית המשנה שמתחת לשריר הדטראאו.
- התחל לחתוך (לא לקילוף!) קיר שלפוחית השתן עם מספריים עצה משובחת לאורך המשטח הפנימי של שכבת השריר הדטרואו תוך כדי בעדינות למשוך את קטע החיתוך הרחק מן ההכנה. בכל עת, לוודא את הקצה לרוחב של רירית ניתן לראות ולהימנע מלגעת בו.
- הסר את השריר הדטראאו לחלוטין על-ידי הפעלת המנה המחרטה כך שמיקום ההכנה יהיה נוח להמשיך לבתר את השריר החוצה.
- השאירו חתיכה קטנה של שריר הדטרואו על החלק העליון של כיפת שלפוחית השתן כדי להבטיח את היכולת לשתק את ההכנה במהלך השלבים הנותרים של הפרוטוקול.
- לעשות לולאה כפולה של 6-0 ניילון חוט, למקם אותו סביב הצוואר של הכנת שלפוחית השתן, ולהשאיר את הלולאה רופף.
- להוסיף לולאה כפולה השני של 6-0 חוט משי, למקם אותו סביב הצוואר של הכנת שלפוחית השתן, ולהשאיר את הלולאה להפסיד. שני תפרים מונעים. דליפות מסביב לתפרים
- חותכים כ 2 ס מ של 20 הצינורות PE (קטטר), להתלקח את הקצה על ידי הזזת לאט את הקצה קרוב ללהבה.
- ממלאים את הצנתר בחום (37 ° c) מחמצן.
- הכנס את הצנתר בתוך הפתח של השופכה שלפוחית השתן ובעדינות לדחוף את הקטטר עד קצה הקטטר מגיע בערך באמצע שלפוחית השתן.
- לקשור את התפר סביב הקטטר ואת הרקמה המקיפה של צוואר שלפוחית השתן.
- באיטיות למלא את שלפוחית השתן עם כ 50-100 μL של חם (37 ° c) חמצון KBS, להרים אותו בקצרה (< 10 s) מעל פני השטח של KBS, ולפקח על דליפות בגוף התפרים ושלפוחית השתן.
- אם לא נצפתה דליפה, ההכנה היא מוכנה לניסוי. אם הדליפה סביב התפר הוא נצפתה, להסיר את התפר ולהחליף אותו. אם הדליפה מתוך חור בגוף שלפוחית השתן הוא הבחין, להיפטר ההכנה.
2. מילוי הכנת שלפוחית השתן הדנית
- מבשם KBS (37 ° c) לחדר של 3 מ ל של מים (37 ° c) כיסה כלי עוגב עם תחתית סילגארד.
- . התאימו את קווי החמצן והיניקה
- מניחים את ההכנות. לשלפוחית השתן בחדר
- אבטחו את הקטטר לצד החדר כך שההכנה לא תצוף מעל פני השטח של פתרון הפרפיוז.
- לחבר את הקטטר שלפוחית השתן PE20 אבובים יותר (קו העירוי) מחובר שלוש הדרך רזלים תרנגול באמצעות התאמת גודל זהה.
- ודא כי הקווים בין משאבת העירוי, מתמר הלחץ ושלפוחית השתן פתוחים.
- ממלאים את מזרק האינפוזיה בחום, חם וחמים (37 ° c) וכיריים מחמצן.
- להתאים את הפרמטרים המשאבה: סוג/נפח של מזרק (כלומר, 1 מ ל), הפעלה (כלומר להשרות), זרימה (כלומר, קבוע), ואת קצב הזרימה (כלומר, 15 μL/min).
- לחץ על לחצן התחל על משאבת המזרק כדי למלא את שלפוחית השתן.
- ניטור נפח המילוי והלחץ הפנימי במהלך מילוי שלפוחית השתן.
3. זיהוי מגשרים בהיבט של הכנת שלפוחית השתן הדנית
- לאסוף המרכיטים של פתרון האמבטיה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה קר-קרח או כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (בדיקות) מוסיף.
- הכן ועבד את הדגימות בהתאם ליישום הזיהוי המתאים. במקרה של זיהוי זמינות של פורין, עבד את הדגימות על-ידי בדיקות באמצעות זיהוי של קרינה פלואורסצנטית13,18.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
קיר של הכנת שלפוחית השתן מורטין ללא פגע והוא מכיל את כל השכבות מלבד DSM ו serosa. לימודי הוכחת העיקרון הוכיחו שחומת השלפוחית החופשית של ה-DSM כוללת את האורואלינום וסובו/LP, בעוד שבטונאיקה מוסקולריס והסראוסה נעדרים (איור 2)13.
מילוי שלפוחית השתן הדטראלית. ממלאת את שלפוחית השתן הרגילה איור 3 מציג תרשימים של ההתקנה הניסיונית למילוי ההכנות v...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלפוחית השתן יש שתי פונקציות: אחסון ו-ווצמה של שתן. הפעולה הרגילה של פונקציות אלה דורש חישה מכנית נאותה של נפח intraluminal והלחץ והתמרה של אותות דרך תאים בקיר שלפוחית השתן כדי לווסת את השרירים שרירים או מרגש. רירית שלפוחית השתן (אורוטאלינום) הוא האמין לווסת את הרגש שלפוחית השתן על ידי שחרור מגוון של מולקולות איתות ב SubU/LP המשפיעים על סוגי תאים רבים בקיר שלפוחית השתן. כיום, רוב הנסיונות באפיון המגשרים הנגזרים מעורבים בשימוש בהכנות לשלפוחית השתן (לדוגמה, יריעות קיר שטוחות, רצועות קיר שלפוחית השתן, או תאים מתורבתים) שאינ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
חלקים מעבודה זו פורסמו בעבר בכתב העת לפיזיולוגיה (PMCID: PMC6418748; דוי: 10.1113/JP27692413). הרשות ניתנה על ידי ויילי ובניו, Inc. לשימוש בחומרים מפרסום זה. למחברים אין התנגשויות פיננסיות או אחרות לגלות.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות גרנט DK41315.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | מקור גמיש |
| דקסטרוז | פישר | D16 | מקור גמיש |
| סיכות חיתוך | Fine Science Tools | 26002-20 | מקור |
| משאבת עירוי | קנט Scientific | GenieTouch | מקור גמיש |
| KCl | Fisher | P217 | מקור גמיש |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | מקור גמיש |
| אור | SCHOTT ACEI | מקור גמיש | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס SZX7 | גמיש לשימוש בכל היקף | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | מקור גמיש |
| NaCl | Fisher | S671 | מקור גמיש |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | מקור מחטים |
| גמישות 25G | Becton Dickinson | 305122 | מקור אמבט |
| איברים | בהתאמה | מקור גמיש; עשינו את זה מצינור ניתוח צלחת Radnoti | |
| PE-20 | Intramedic | 427405 | מקור גמיש |
| מתמר לחץ | AD מכשיר | גמיש | |
| S& T מלקחיים | Fine Science Tools | 00632-11 | מקור תוכנה גמישה |
| לחץ-נפח | AD מכשירים | מעבדת | |
| תפר ניילון, 6-0 | AD כירורגי | S-N618R13 | מקור |
| תפר גמיש משי, 6-0 | Deknatel באמצעות Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | מקור מזרקים גמישים |
| 1 מ"ל | Becton Dickinson | 309602 | מקור גמיש |
| Vannas מספריים קפיצים | Fine Science | Tools 15000-08 | מקור גמיש |
| מחזור מים | בקסטר | K-MOD 100 | מקור גמיש |
מקורות
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
