הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60347

⸱

3 בדצמבר 2019

 , 
1Department of Neurobiology, Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

תקציר

כמו מקרופאגים תושב במערכת העצבים המרכזית, מיקרוגלייה פעיל שליטה בפיתוח המוח הומאוסטזיס, ואת התפקוד שלהם יכול לנהוג במחלות אנושיות. מקדמות רבות נעשו כדי לחשוף את החתימות המולקולריות של מיקרוגלייה הומטיק, כמו גם שינויים של הביטוי הגנטי שלהם בתגובה לגירויים סביבתיים. עם הופעתו והתבגרות של תא בודד מתודולוגיות גנומית, הוא מוכר יותר ויותר כי מיקרוגלייה הטרוגניים עשוי להיות מתחת לתפקידים מגוונים הם משחקים בתנאים התפתחותיים ופתולוגיים שונים. ניתוח נוסף של טרוגניות כזה יכול להיות מושגת באמצעות בידוד יעיל של מיקרוגלייה מתוך אזור נתון של עניין, ואחריו פרופיל רגיש של תאים בודדים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד מהיר של מיקרוגלייה מאזורי מוח שונים בחצי הכדור המוח העכבר המבוגר. אנו גם להדגים כיצד להשתמש מיקרוגלייה אלה מיון עבור מבוסס צלחת תא יחיד ברצף RNA רצפי. אנו דנים על הסתגלות של שיטה זו לתרחישים אחרים ולספק הנחיות לשיפור המערכת כדי להתאים למחקרים בקנה מידה גדול.

מבוא

Microglia, המייצג 5% על 10% של כל התאים העצביים, הם מקרופאגים המתמחים מפוזרים ברחבי מערכת העצבים המרכזית (CN)1. מוגן מאחורי מחסום דם-מוח, מיקרוגלייה אופייני במוח מבוגר בריא להכיל תהליכים עדינים רבים במהירות להאריך ולסגת כדי אינטראקציה עם נוירונים ותאי גליה אחרים בתוך הכימומה. Microglia יכול גם לאמץ את מורפולוגיה אמבות הקשורים בפונקציה phagocytic מוגברת במהלך שלבים התפתחותיים ספציפיים או על האתגרים החיסונית פציעה ומחלה1,2,3,4. תגליות מרגש לאחרונה הפגינו בבירור כי מיקרוגלייה הם בשום מקרה פסיבי עוברי אורח פסיבית המוח או אותות פתולוגיים, אבל לשחק תפקידים מרכזי בשליטה המוח התפתחות הומאוסטזיס, למשל, על ידי תמיכה הישרדות עצבי, גיזום הסינפסות בלתי האוליגודנדרוציטים, קידום תאים השושלת היוחסין בידול, כמו גם אנגיוגנזה1. ככל פונקציות יותר של מיקרוגלייה מובהר, ההתרגשות היא נוספת מונעת על ידי מחקרים גנטיקה של האדם, אשר הראו כי הרבה מחלות נוירוניווניות הסיכון גנים, כגון TREM2, הם בעיקר או בלעדית מבוטא על ידי מיקרוגלייה5,6,7. בהתחשב במשמעות שלהם בפיתוח וסביר מחלות נהיגה תפקידים, מאמץ עצום לאחרונה הושם לקראת ההבנה שלנו של רגולציה גנטית microglial ותפקוד בתקווה למצוא מטרות טיפוליות חדשות עבור מחלות ניווניות1,8.

רצפי RNA (RNA-seq) מאפשר אפיון לא משוחד של הביטוי הגן הספציפי לסוג תא, אשר בתורו המדריכים מדענים לחקור פונקציות גן ברשתות הסלולר צפוף7. RNA-seq נעשה בעיקר על דגימות בצובר, המוביל לגילוי של חתימת גנים microglial הומאטית המבדיל אותם מתאים עצביים אחרים החיסונית9. עם זאת, גישה כזו יכולה להתעלם הבדלים מולקולריים ופונקציונליים בקרב microglia, במיוחד אלה הנוכחים בפיתוח, או הקשורים הזדקנות ומחלות. אכן, תא בודד RNA-seq (scRNA-seq) מציע את הרגישות ואת הרזולוציה כי יש מהפכה בשדה על ידי חשיפת בעבר העריכה הטרוגניות של מיקרוגלייה במגוון של ההקשרים2,3,10. בנוסף, בשל נוכחותם של תאים אחרים החיסונית דומים בממשק מחזור המערכת, scRNA-seq מספק מידע לסייע לעיצוב של כלים חדשים כדי להפריד ולנתח פונקציונלית אלה תאים הקשורים עם מעט לפני ידע2,11.

מערך מגוון של פלטפורמות scRNA-seq הומצאו, כל אחד מתאים יישומים מסוימים12. באופן כללי, שיטות המבוססות על droplet, כגון: x גנומיקה, גבוהות יותר בתפוקה עם (עשרות) אלפי תאים ברצף בכל הפעלה, והם פחות סלקטיבית עבור הקלט שעשוי להכיל אוכלוסיות תאים מעורבות הדורשות סיווג נרחב. שיטות מבוססות לוח לספק רגישות גבוהה יותר לקרוא עומק13,14, בדרך כלל מיקוד אוכלוסיות ספציפיות ממיון התא כדי לחשוף הבדלים עדינים או תעתיקים נדירים. בהינתן אחוז קטן של תאים microglial, במיוחד אלה התפתחות-או מחלות הקשורות אוכלוסיות, בין כל סוגי התאים של ה-cn, זה לעתים קרובות רצוי לבודד מיקרוגלייה מאזור מסוים של עניין ולקבל מידע עמוק ובאורך מלא ההמרה על מנת להבין את טרוגניות.

כאן, אנו מספקים פרטים על איך לבודד מיקרוגלייה מאזורים שונים במוח העכבר גזור מאונה אחת, אשר משמשים עבור תא בודד (או בצובר) RNA-seq בעקבות הליך הכנה חצי אוטומטי המבוסס על לוח הספריה. לאחר מכן ניתן להשתמש בחצי הכדור השני לאימות היסטולוגית. באופן יעיל משיטה שפורסמה בעבר9, פרוטוקול בידוד זה שואפת למקסם את התשואה מכמות קטנה של חומרי ההתחלה, ובינתיים לשמור על פרופילי מיקרוגליאל גנטי ביטויים. אנו משתמשים מיון תא מופעל-פלואורסצנטית (facs) כדי להעשיר מיקרוגלייה (או תאים אחרים הקשורים החיסונית של עניין) לתוך 96-ובכן צלחות ממזער את הכרכים של ריאגנטים להכנת הספריה כדי להגדיל את התפוקה. אנו מדגישים את פלטפורמת scRNA-seq הרגישה הזאת, למרות שניתן ליישם אסטרטגיות אחרות המבוססות על צלחת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לבידוד מיקרוגלייה מרקמות אחרות, כגון פציעה או מחלה, וגיל העכבר יכול להשתנות כמעט בכל שלבי הלידה. בידוד יעיל של מיקרוגלייה אזוריים למחקרים בעלי תא יחיד הטרנססקריפט יסייע להבנה טובה יותר של התפקודים שלהם בריאות ומחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים מעורבים מכרסמים להתאים הנחיות אוניברסיטת סטנפורד, אשר עומדים בפני חוקי המדינה ומדיניות. כל ההליכים בעלי חיים אושרו על ידי פאנל מינהלי של אוניברסיטת סטנפורד על טיפול בעלי חיים מעבדה.

הערה: כל קומפוזיציות הפתרונות והמאגרים ניתנים ברשימת חומרים.

1. הכנה ביום הבידוד התאי

  1. להכין את הריאגנטים הבאים ולצנן אותם על הקרח: בינוני A (50 mL), תא מגנטי המופעל מיון (MCS) מאגר (30 mL), מאגר FACS (25 מ"ל), פוספט באגירה מלוחים (PBS; 30 mL), DNase (320 μL), ו-RNase מעכב (30
    הערה: אמצעי האחסון המסופקים כאן מספיקים כדי לבודד מיקרוגלייה מ 4 אזורי המוח (למשל, קליפת המוח הזעירה, ההיפוקמפוס והסטריאטום) של האונה האחת של המוח העכבר. הקנה מידה אם נעשה שימוש ברקמות נוספות.
  2. מקום ארבע נקי 2 מ"ל המגון הומוזים על הקרח ולהוסיף 2 מ ל של בינוני A עם 80 μL של DNase (12,500 יחידות/mL) ו-5 μL של מעכבי RNase לתוך כל הומוגניד1. לצנן את הפיסטונס ב 15 מ ל צינורות.
  3. תווית 4 6 ס מ מנות פטרי עם מחוזות המוח לאוסף רקמות ולהוסיף 200 μL של בינוני קר A לתוך כל מנה על הקרח. הוסיפו כ-5 מ ל בינוני בצלחת פטרי בגודל 6 ס מ לניתוח.
    הערה: לפני השימוש, לוודא שכל הריאגנטים הם סטרילי מתאים ליישומים RNA. כלי הספסל והחיתוך צריך להיות נקי ומרוסס עם פתרון טיהור RNase (טבלת חומרים).

2. מחוז המוח חיתוך

הערה: שלב זה אמור להימשך ~ 30 דקות.

  1. הכנס 400-כ 500 μL של קטמין/xylazine (24 מ"ג/מ"ל קטמין ו 2.4 mg/mL xylazine) לתוך צפק של קטין לעכבר בשלב מבוגר (> 1 חודש).
    הערה: עכבר גברי משמש כאן להמחשה, אבל או מגדר מתאים.
  2. לחכות 5 דקות וקמצוץ רגל האחוריות כדי להבטיח חוסר הנסיגה.
  3. באופן מיידי להשתמש 26 G x 3/8 מחט לבצע מיזוג באמצעות 20 ל 30 מ ל של הקרח קר PBS עד מאגר אוזל ללא דם גלוי.
  4. הוא ערוף את ראשו של העכבר. עם זוג מספריים כירורגיים להשתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת מתחת, ולאחר מכן לחתוך את התפר המשונן, תפר מ, ותפירה מקורלית. מלקחיים להשתמש כדי למשוך את שני הצדדים של עצם הקודקוד ועצם הקודקוד מבלי לפגוע ברקמה, ובזהירות להעביר את המוח לתוך צלחת פטרי בינונית.
  5. השתמש להב מראש מקורר לחתוך את המוח דרך קו האמצע לשתי אונות.
    הערה: ארבעת האזורים המוח שתוארו כאן מתוך האונה אחד התשואה מספר מספיק של מיקרוגלייה עבור תא יחיד או בתפזורת RNA-seq יישומים. בחצי הכדור השני ניתן להשתמש עבור אימונוהיסטוכימיה או RNA באימות באתרו.
  6. הפרד את המוח החצי מהאונה הקורטיקלית ואת גזע המוח עם מלקחיים #55 ולהעביר את הרקמה לתוך אוסף צלחת פטרי.
  7. השתמש #55 מלקחיים כדי לנתח בזהירות את ההיפוקמפוס ואת הסטריאטום מקליפת המוח ולהעביר כל רקמה לתוך אוסף צלחת פטרי.

3. רקמת דיסוציאציה מכנית

הערה: לשמור על תאים וריאגנטים מגניב כל הזמן, למעט במהלך מכתים שלבים. שלב זה אמור להימשך ~ 30 דקות.

  1. קוצצים כל רקמת מוח עם להב תער לתוך < 1 מ"מ3 חתיכות קנס.
  2. השתמש בפיפטה 1 מ ל (עם טיפים לחתוך) כדי להעביר את חתיכות הרקמה לתוך מקורר לפני העור Dounce הומוזים, כל אחד המכיל 2 מ ל של בינונית A עם DNase ו-RNase מעכב.
  3. המגון לסדר את הרקמה על ידי הטיית באיטיות את הבוכנה פנימה והחוצה של מכשיר ההומוגניזה של הדיאונקיה עבור 6-10 משיכות מלאות, עד שלא קיימים גושים גלויים.
    הערה: Douncing הורג נוירונים ותאים גליה ביותר אחרים אבל לעזוב את התאים microglial ולא שלמים. שניהם לא מספיקים ו-over-douncing יכול לגרום לתשואה נמוכה של תאים.
  4. העברת רקמות שאינן מקבילות לתוך צינורות 50 mL דרך 70 יקרומטר בכיינים.
  5. לשטוף כל הומוגנידצר בוכנה עם סכום כולל של 6 מ ל של בינוני קר A ולסנן את פתרון השטיפה דרך מסננת אותו לתוך הצינור המקביל.
  6. להעביר את השעיות התא בודד (כ 8 mL כל) לתוך 15 מ"ל שפופרות חרוט ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' עם בלם = 5.

4. הסרת מיאלין

הערה: שלב זה צריך לקחת ~ 60 דקות.

  1. הכן 1 עמודת דלדול (LD) גדולה (לקליפת קליפה) ו-3 עמודות מבחר גדולות (LS) (עבור 3 האזורים האחרים) במפריד מגנטי (טבלת חומרים). שטפו כל עמודה עם 3 מ ל של מאגר MCS.
  2. ברגע שצנטריפוגה מסתיים, הצינורות החוצה וזורקים את הסופרנטאנט בלי להפריע לגלולה. לגבי קליפת המוח ורקמות המוח, השהה מחדש תאים ב-850 μL של מאגר MCS עם 1.8 μL של מעכב RNase. עבור רקמות ההיפוקמפוס ו סטריאטום, השעיית התאים מחדש ב-400 μL של מאגר MCS עם 0.9 μL של מעכב RNase.
    הערה: העמודים (LD לעומת LS) ואמצעי האחסון המשמשים לההשעיה ממוטבים על בסיס כמות המיאלין הקיימת ברקמה. אם אזורים אחרים במוח מאחרים, ייתכן שיהיה צורך לכוונן תנאים אלה בהתאם לגודל הרקמה ולכמות המיאלין העשויה להתקיים. האפקטיביות של הסרת המיאלין יכול להיות מוערך בשלב 4.9.
  3. הוסף 100 μL של חרוזים הסרת המיאלין כל אחד לתוך תאים מקליפת המוח ולהוסיף 50 μL של חרוזים הסרת המיאלין כל אחד לתוך תאים מהיפוקמפוס וסטריאטום.
  4. בעדינות לערבב את התאים עם חרוזים ו-מודטה את הצינורות על הקרח 10 דקות.
  5. הביאו את עוצמת השפופרת עם תאים קורטיקליים ל -2 מ ל עם מאגר MCS, וכל האחרים ל-1 מ ל (כלומר, מוסיפים 1 מ ל לתאי קליפת המוח; 500 μL עבור תאים היפוקמאל וסטרילאטאל; אין צורך להוסיף מאגר לתאים מקרבלאר).
  6. לאחר שהעמודות ריקות ממאגר השטיפה, הניחו שפופרת של 15 מ ל מתחת לכל עמודה. טען תאים קורטיקלית (2 מ ל) לעמודת ה-LD, וכל האחרים (1 mL כל אחד) על העמודות LS. מיד להשתמש 1 mL של מאגר MCS כל אחד כדי לשטוף את הצינורות המקוריים ולטעון את הפתרון על העמודות המתאימות.
  7. שטוף את עמודת ה-LD פעם אחת עם 1 מ ל של מאגר MCS ושטוף כל עמודה LS פעמיים עם 1 מ ל של מאגר MCS כביסה. המשך לאסוף את פתרון הזרימה במהלך הכביסה.
  8. לסנן את התאים לתוך צינורות facs לתחתית עגול באמצעות כמוסות מסננת 35 יקרומטר.
    הערה: כל צינור צריך לאסוף כ 4 מ ל של השעיית תא יחיד מרוקן של מיאלין.
  9. באופן אופציונלי, לקחת 10 μL של ההשעיה התא ולערבב אותו עם 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר 10x כדי להעריך את התשואה, שיעור ההישרדות ואת רמת המיאלין שיורית.
    הערה: הכנה מוצלחת צריך ליצור מעל 90% תאים חיים (עגול בצורה ולא להוציא את הצבע הכחול) עם מעט ללא פסולת מיאלין.
  10. גלולה תאים בצינורות FACS ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, עם בלם = 5. שופכים לאט החוצה את הסופר ומזגו את קצה הצינור על נייר טישו. השהה תאים מחדש בכל צינור עם 300 μL של מאגר FACS.
    הערה: אם מיון mcs הוא המועדף, CD11b חרוזים ניתן להשתמש כדי לבחור מיקרוגלייה ותאים אחרים מיאלואידים בעקבות הסרת מיאלין. תאים אלה יכולים לשמש לאחר מכן עבור שאינם מבוססי לוח scRNA-seq כמו גם בצובר RNA-seq. האזהרה של גישה חלופית זו היא כי חרוזים CD11b לא להפריד מיקרוגלייה מתאים אחרים החיסונית הקשורים אשר גם חיובית עבור אנטיגן זה.

5. צביעת עבור מיון התא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית

הערה: שלב זה צריך לקחת ~ 40 דקות.

  1. הוסף 5 μL של העכבר קולטנים לחסום מגיב (לוח חומרים) לתוך כל צינורית. מודקון למשך 5 דקות על הקרח.
  2. הוסף 1 μL של CD45-PE-Cy7 ו-1 μL של CD11b-BV421 לתוך כל צינורית.
    הערה: נוגדנים עם fluorophores אחרים עשוי לשמש. נוגדנים נגד TMEM119, סמן ספציפי עבור הומאוטיות מיקרוגלייה9, ניתן גם לכלול, אבל זה מומלץ לשמש יחד עם CD45 ו CD11b, כי מספר אוכלוסיות מיקרוגלייה מסוימות עלול לאבד TMEM119 הביטוי פני השטח.
  3. מודטה את הצינורות על שייקר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  4. הוסף 2 מ ל של מאגר FACS כדי לשטוף.
  5. כדוריות התאים ב 4 ° צ', 400 x g עבור 5 דקות לאט לשפוך supernatant ולטפוח על הקצה של הצינור על נייר טישו. השעיה מחדש של תאים בכל צינור באמצעות 400 μL של מאגר FACS עם 1 μL של מעכב RNase ו 0.5 μL של propidium יודיד (PI, 1:1000 דילול).

6. מיון FACS באינדקס

הערה: . השלב הזה אמור לקחת ~ 1 h

  1. בעקבות נוהל FACS סטנדרטי, לצייר שערים המבוססות על פיזור (לא כולל פסולת), תאים בודדים, תאים חיים (PI שלילי), מיקרוגליה תאים מיאלואידים (CD45+, CD11b+).
    הערה: תאים microglial אופייני express CD45 ברמות נמוכות יותר לעומת מקרופאגים אחרים הקשורים בגבול, כגון perivascular ו-מקרופאגים של מנצ, ולכן על CD45 low CD11b+ צריך להיות מספיק אם המוקד של המחקר הוא ביטוי גנים פרופילים אלה מיקרוגלייה קלאסי1,2. עם זאת, מערכות משנה מסוימות של מיקרוגלייה יכול להיות גבוה יותר ביטוי CD45 וזה נכון במיוחד במהלך הפיתוח או בתנאי מחלה. כדי להבטיח ניתוח לא משוחדת של ביטוי הגנים microglial, CD45 גבוהה CD45 החיסונית נמוכה ניתן להקליט באמצעות הגדרת מיון המדד ושתי האוכלוסיות שנאספו לניתוח רצף במורד הזרם. בנוסף, TMEM119 ביטוי פני השטח עשוי לשמש כדי למקד את אוכלוסיית microglial הומאטית (ראה שלב 5.2) ונותחו יחד עם רמות CD45 ואת התוצאות הרצף.
  2. מיון מיקרוגלייה יחיד (עם זרבובית 100 יקרומטר) לתוך 96-ובכן פולימראז תגובת שרשרת (PCR) צלחות, המכיל 4 μl של מאגר הליזה כל טוב (עיין בפרוטוקול שפורסם14 לפרטים).
    הערה: הקונסורציום החיצוני בקרת RNA (ERCC) RNA ספייק-in mix (טבלה של חומרים) ניתן להוסיף ב 1:2.4 x 107 במאגר הליזה למטרות בקרת איכות ונורמליזציה2.
  3. מערבולת בקצרה את הצלחות. ומסתובבת באמצעות צנטריפוגה מלמעלה
  4. הקפא מיד את הדגימות על הקרח היבש. אחסן את הצלחות ב-80 ° צ' עד להכנה לספרייה.
    הערה: לחילופין, תאים נוספים ניתן לאסוף לתוך 1.5 mL צינורות עם מאגר החילוץ RNA עבור רנ א-seq בצובר. על פי הניסיון של המחברים, 3,000 תאים מספיקים כדי ליצור ספריות באיכות טובה לאחר הפרוטוקול שפורסם2,14.

7. הכנה לספריית RNA ברצף של תא יחיד

הערה: כאן, הפרוטוקול שפורסם14 מלווה בהפקת ספריות scRNA-seq בעזרת רובוטיקה לטיפול נוזלי וכמה שינויים. במאמר זה, ההליך מתואר רק בקצרה, וההבדלים מודגשים. עיבוד 4 צלחות בו לוקח בערך 2.5 ימים.

  1. הפשרת צלחות על קרח ולבצע תמלול הפוכה עם Oligo-dT30VN פריימר (במאגר הליזה) כדי ליצור cDNA עם ציקלנים תרמית (שולחן 1): 42 ° c 90 דקות; 70 ° c, 5 דקות; 4 ° c להחזיק. לאחר מכן להגביר את cDNA עם העיכול תוספת בדקה בתחילת (שולחן 2) באמצעות התמהיל הראשי pcr ו-pcr באתרו (ispcr) התחל (טבלת חומרים) ואת המצב הבאים Pcr: 37 ° צ' 30 דקות; 95 ° c 3 דקות; 23 מחזורים של 98 ° c, 67 ° c, 72 ° צ' 4 דקות; 72 ° c, 5 דקות
  2. טיהור cDNA באמצעות 18 μL של חרוזים מגנטיים לכל טוב (0.7:1 יחס). מודקת את הצלחת על דוכן מגנטי עבור 5 דקות ולשטוף דגימות פעמיים עם טרי שנעשו 80% אתנול, 80 μL לכל טוב בכל פעם. לאחר ייבוש את הצלחת עבור 15-20 דקות, elute cDNA לאחר מכן עם 20 μL של מאגר הימנעות לכל טוב.
    הערה: עבור בקרת איכות, השתמש מנתח קטע (רגישות גבוהה ברצף הדור הבא [NGS] ניתוח קטע, 1-6000 bp) כדי לבדוק גודל הפצות וריכוזים של cDNA, רק עוד דגימות התהליך עם הכתם בין 500-5000 bp, ויותר מ 0.05 ng/μL.
  3. כדי ליצור ספריות, לערבב 0.4 μL של כל דגם cDNA עם 1.2 μL של Tn5 tagmentation מערכת הכנת הספרייה (טבלת חומרים) בצלחת 384-באר עם הסיוע של מכונת ההכנה של nanoliter, ב 55 ° c 10 דקות.
    הערה: כאן, 1/12.5 של נפח התגובה המוצע (5 μL לדוגמה ו-15 μL של החומרים האחרים) מתווסף כדי להפחית את העלות ובינתיים להגדיל את התפוקה. מכונת פיאוליטר ליטוף (טבלת חומרים) משמשת להעברת ריאגנטים (זה והצעדים הבאים) מ ועד 384-צלחות.
  4. הוסף 0.4 μL של נטרול מאגר כדי להפסיק את תגובת הטמנטציה ב-RT עבור 5 דקות.
  5. הוסף 384 אינדקסים (טבלת חומרים, 0.4 μl קדימה ו 0.4 μl הפוך), 1.2 μl של שילוב PCR לדגימות (2 μl כל אחד), ולהגביר את הספריות באמצעות התנאי הבא: 72 ° צ' 3 דקות; 95 ° c; 10 מחזורים של 95 ° c, 55 ° צלזיוס 30, 72 ° צ' 1 דקות; 72 ° c, 5 דקות
  6. בריכת כל הספריות הבודדות (לקחת 1 μL כל אחד) מאותה צלחת 384-ובכן יחד, ולהשתמש חרוזים מגנטיים (טבלת חומרים, 0.7:1 יחס) כדי לטהר את הספריות האחרונות במאגר.
  7. השתמש בפלואורומטר (טבלת חומרים) כדי למדוד את הריכוזים ואת bioanalyzer (טבלת חומרים) כדי לבחון את הפצות הגודל של ספריות במאגר לפני הרצף. מקד את עומק רצף ב 1,000,000 raw קריאות לכל תא.
  8. בצע את ההליכים הביומטיים הסטנדרטיים כדי לסנן ולקצץ ברצף קריאות ולבצע יישור2. השתמש בטבלת הספירה ובמטא-נתונים כקלט לביצוע ניתוח באשכולות עם חבילת Seurat15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ומיון מיקרוגלייה מאזורי מוח שונים בחצי הכדור המוח האדם המבוגר, ואחריו scRNA-seq. אנו משתמשים douncing כדי ליצור תא השעיה בודד גם כצעד הראשון להעשיר microglia. לא מספיק או over-douncing מפחית את התשואה. בנוסף, מוחות עכבר למבוגרים מכילים רמות גבוהות של מיאלין, אשר יכול גם להפחית את יעילות מיון ותשואה אם לא הוסרו כראוי. לכן, אנו בודקים את ההשעיה התא תחת מיקרוסקופ באמצעות טריקון כחול ו היציטוטומטר כדי להעריך את התשואה, הכדאיות התא יעילות של הסרת המיאלין (שלב 4.9) לפני ביצוע כתמים נוגדן (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Microglia אינטראקציה פעילה עם סוגי תאים אחרים ב-CN, והם רגישים מאוד גירויים סביבתיים. על מנת למזער תגובות דלקתיות שינויים ביטוי הגנים שלהם במהלך תהליך הבידוד, פרוטוקול זה היה יעיל מתוך שיטה שפורסמה בעבר9, והוא מתאים כעת לבודד מיקרוגלייה מאזורים מרובים של המוח בודד בצורת העכבר במקביל. הרקמות והריאגנטים נשמרים בטמפרטורה קר וניסויים מבוצעים בזמן (כ 3.5 h מניתוח למיון) עם פחות שוטף ומלא ריאגנטים פחות מבוסס על גדלים רקמות מוגבלות. אנחנו בוחרים douncing על שיטות אחרות הומוקות, כגון העיכול אנזימטי, כי די...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים למריקו ל. בנט, ליאנה ניקול בונאנו, ו Spyros דארמני על עזרתם במהלך פיתוח פרוטוקול זה. אנו מודים גם למתקן ה-FACS המשותף של סטנפורד, במיוחד מרדית ווגלז וליסה ניקולס; ין טראן, מייקל Eckart מאוניברסיטת סטנפורד וחומצות גרעין מתקן (פאן) על התמיכה הגדולה שלהם לצילום. עבודה זו ממומנת על ידי קרן JPB ו וינסנט ג'יי קוטס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5 מ בטאיןסיגמא-אולדריץ'חתול # B0300-5VL
10 מ"מ dNTP תערובתתרמו פישר סיינטיפיקחתול # R0192
0.5 מ EDTA, pH 8.0תרמו פישר סיינטיפיקחתול # 15575020
10X הנקס' תמיסת מלח מאוזנתThermo Fisher ScientificCat# 14185-052
1 M HEPESThermo Fisher ScientificCat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master MixKapa BiosciencesCat# KK2602
5 מ"ל צינור פוליסטירן תחתון עגול, עם מכסה מסננת תאיםCorningCat# 352235
AATI, ערכת ניתוח שברי NGS ברגישות גבוהה (1 bp – 6,000 bp)AnalyticalCat# DNF-474-1000
בקר סרום אלבומיןסיגמא אולדריץ'Cat# A8806
DNase Iוורת'ינגטוןCat# LS002007פתרון עבודה: 12500 יחידות/מ"ל
DTT, דרגה מולקולריתPromegaCat# P1171
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher ScientificCat# 4456740
סרום בקר עובריתרמו פישר מדעיחתול# 10437-028
ערכת אינדקס Illumina XT v2 סט A (96 אינדקסים)IlluminaCat# FC-131-2001
ערכת אינדקס Illumina XT v2 סט B (96 אינדקסים)IlluminaCat# FC-131-2002
ערכת אינדקס Illumina XT v2 סט C (96 אינדקסים)IlluminaCat# FC-131-2003
ערכת אינדקס Illumina XT v2 Set D (96 אינדקסים)IlluminaCat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μ l)ניו אינגלנד BioLabsCat# M0262S
עכבר Fc בלוקBD PharmingenCat# 553142
חרוזים להסרת מיאליןMiltenyl BiotecCat# 130-096-433
Nextera XT ערכת הכנת דגימת DNAIlluminaCat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 ערכת תפוקה גבוהה v2.5 (150 מחזורים)IlluminaCat# 20024907
PBS ( 10X), pH 7.4Thermo Fisher ScientificCat# 70011044
חרוזי PCRClean DXAline BiosciencesCat# C-1003-50
Propidium IodideThermo Fisher ScientificCat# P3566מכתים: 1:1000
קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקהתרמי Thermal Fisher ScientificCat# Q32851
חולדה חד שבטית נגד עכבר/אנושי CD11b, סגול מבריק 421 (שיבוט M1/70)BioLegendCat# 101236; RRID: AB_11203704מכתים: 1:300
חולדה חד שבטית נגד עכבר CD45, PE/Cy7 (שיבוט 30-F11)Thermo Fisher ScientificCat# 25-0451-82; RRID: AB_469625צביעה: 1:300
מעכב RNase רקומביננטיTakara BioCat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μ l)ClontechCat# 639538מכיל 5x מאגר גדיל ראשון
<חזק>אוליגונוקלאוטידים
0.1 μ M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" הוא forribobases ו-"+" הוא בסיס LNA)		(Picelli et al., 2014)
<פתרונות>חזקים
FACS מתכון: 1% FBS מסונן סטרילי, 2 מ"מ EDTA, 25 מ"מ HEPES ב-1X PBS
MCS מאגרמתכון: מסנן סטרילי 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ב-1X PBS
בינונימתכון: 15 מ"מ HEPES, 0.5% גלוקוז ב-1X HBSS ללא פנול אדום
<חזק>צלחות
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen ScientificVWR89005-556
צלחות PCR קשות 96 בארותBio-RadHSP9631
<חזקות>אחרות
Dumont #55 מלקחייםFine Science Tools11295-51
Dounce הומוגנייזר, 2 מ"לWheaton
357422 עמודת דלדול גדולהMiltenyi Biotec130-042-901
עמודת בחירה גדולהMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
מפריד QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
RNAzapThermo Fisher ScientificAM9780
מסננת (70 μ m)Falcon352350
Equipment
BD FACSAria IIBD Bioscienceshttp://www.bdbiosciences.com/
BioanalyzerAgilent2100
מנתח שבריםAgilent5300
יתושים HTS רובוט פיפטינג ננוליטרTTP Labtechhttps://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 פלואורומטרתרמו פישר מדעיQ33226
Advanced

מקורות

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FACSCD45 CD11B
בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.