ייצור ויישום של פלטפורמת מיקרוסקופית כוח המתיחה ללא התייחסות

Summary

פרוטוקול זה מספק הוראות להטמעת ליתופי מולטיפוטון כדי להמציא מערכים תלת-ממדיים של סמנים fiducial פלורסנט מוטבע פולי (אתילן גליקול) מבוססי הידרוג לשימוש כמו ללא התייחסות, כוח המתיחה מיקרוסקופ פלטפורמות. באמצעות הוראות אלה, מדידה של זן חומר תלת-ממד וחישוב של תיחות הסלולר הוא פשוט כדי לקדם תפוקה גבוהה כוח המתיחה מדידות.

Abstract

עיוות חומרים המושרה על-ידי תא מספק מידע שימושי בנוגע לאופן התחושה של תאים ולתגובה למאפיינים הפיזיים של סביבת המיקרו שלהם. בעוד שגישות רבות קיימות למדידת זן החומר המושרה בתא, כאן אנו מספקים מתודולוגיה לניטור המתח עם החלטה תת מיקרון באופן חופשי התייחסות. באמצעות שימוש בשני פוטון המופעלות פוטוגרפיה תהליך, אנו מדגימים כיצד ליצור מכני ביו-אקטיבי מצעים סינתטיים המכילים מערכים מוטבעים של fiducial סמנים פלורסנט כדי למדוד בקלות תלת מימדי ( 3D) לדפורמציה החומר פרופילים בתגובה לפני השטח. בעזרת מצעים אלה, ניתן למפות פרופילי מתח בתא באמצעות מחסנית אחת של תמונה תלת-ממדית של תא מעניין. המטרה שלנו עם מתודולוגיה זו היא להפוך כוח המתיחה מיקרוסקופ קל יותר ויותר ליישם כלי עבור חוקרים לומד תהליכים מכניזציה הסלולר, במיוחד חדשים לשדה.

Introduction

מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) הוא תהליך של מקורב הסלולר באמצעות שדות הזחה באינטרפולציה של fiducial סמנים שנוצרו על ידי התאים חסיד ו הקונאקטולה. באמצעות tfm, ההשפעה של רמזים מכניים בסביבה החילוץ על תהליכים סלולריים חשובים כגון התפשטות, בידול, והגירה ניתן לחקור^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12} למרבה הצער, גישות קיימות רבות יכול להיות קשה ליישם או לדרוש היכרות עם כלים אנליטיים מיוחדים מאוד חישובית עושה TFM קשה לחוקרים מנוסים להשתמש. אנו מתארים מתודולוגיה ליצירת פלטפורמת TFM המבטל חלק מהקושי בניתוח תוך מתן התפוקה הגבוהה לרכישת נתונים.

מבין הגישות הקיימות של TFM, הנפוצות ביותר לשימוש בחומרי מימוש בחומר כולל בשילוב של סמני פלורסנט קטנים (בדרך כלל מחרוזות פלורסנט בגודל ננו או מיקרומטר) להידרוג'ל מעוות, כגון פוליאקרילאמיד (צפות) או פולי (אתילן גליקול) דיאקריל (pegda)^13,14,15. גישות אלה מבוססות חרוז מספקות את היכולת לfiducial סמנים באשכולות סביב תא מעניין כדי למקסם את דגימת העקירה. למרבה הצער, התפלגות החרוזים ברחבי ההידרוג'ל אינה יכולה להיות נשלטת ישירות כך שהארגון המרחבי הוא אקראי. מיקום אקראי זה מוביל בעיות כגון חרוזים שהם קרובים מדי זה לזה כדי לפתור במדויק, או כל כך להפיץ כי טלאים של המצע להניב נתונים באיכות נמוכה. חוסר היכולת לנבא היכן סמנים fiducial לשקר בהעדר תאים גם יוצר אילוץ כי, עבור כל קבוצה שנאסף של נתוני המתיחה תא, תמונת התייחסות נוספת של סמנים הבסיסיים במצב רגוע חייב גם להילכד. תמונת הייחוס נדרשת כך שההזחה בתמונה ההתוחה יכולה להיות מתקרבת כהפרש בין התמונות ההתוחות והבלתי מתוחות. כדי להשיג מדינה רגועה, התאים הנמדדים הם נינוחים כימיים או מוסרים לחלוטין. תהליך זה מונע לעתים קרובות רכישה של מדידות נסיוניות נוספות, מעכב מחקרי תאים ארוכי טווח ומגביל תפוקה. תמונת ייחוס דורש גם טכניקות רישום התמונה כדי להתאים את הסחף אשר ייתכן שהתרחשו במהלך הניסויים, לעתים קרובות מוביל התאמת ידני מסורבלת של תמונות מצב הלחץ כדי להפנות לתמונות.

שיטות tfm אחרות הנחשבות ללא התייחסות, מיישמים צורה כלשהי של שליטה על התפלגות fiducial סמנים, או על-ידי ליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה, הדפסת מיקרואיש קשר או מיקרואודינג^{16,17,18 ,19,20}. הפניה חינם TFM מושגת באמצעות ההנחה כי המדינה רגועה עבור כל סמן fiducial ניתן לחזות בהתבסס על איך סמן עמדות נקבעו במהלך תהליך הייצור. שיטות אלה מאפשרות לכידה מלאה של מצב המתח של התא בתוך לכידת תמונה אחת שבה fiducial marker displacements נמדדים בהשוואה להפניה משתמעת מאשר ניתן להסיק מהגאומטריה fiducial marker. בעוד עקביות במיקום הסמן מושגת בדרך כלל באמצעות פלטפורמות אלה, הם בדרך כלל סובלים החסרונות שלהם ביחס מבוססי חרוזים נרחב הגישות כולל: 1) ירידה ברזולוציית המתיחה; 2) דיוק מופחת של displacements מחוץ למישור (במקרים מסוימים חוסר יכולת מלאה למדוד); ו-3) ירידה ביכולת ההתאמה האישית של מצעים וחומרי הפלטפורמה (למשל, ליגיום ומצגת, תכונות מכניות).

כדי לטפל בחסרונות האלה, עיצבנו פלטפורמת TFM חדשה ללא התייחסות. הפלטפורמה מנצל מרובת פוטון כימיה מופעל כדי crosslink נפח קטן של fluorophore לתוך מיקומים תלת-ממד ספציפיים בתוך ההידרוג'ל המשמשים כסמנים fiducial למדוד חומר להתאמץ. בדרך זו, עיצבנו פלטפורמה הפועלת באופן דומה לגישות המבוססות על חרוזים, אך עם התועלת המשמעותית שfiducial סמנים מאורגנים לתוך מערכים מסוג gridded המאפשרים מעקב אחר החומרים ללא התייחסות. מאפיין זה נטול התייחסות מעניק יתרונות רבים. בראש ובראשונה, זה מאפשר ניטור לא פולשנית של מצבי המתיחה הסלולר (כלומר, לעקוף את הצורך להירגע או להסיר תאים כדי לרכוש עמדות התייחסות של עקורים fiducial סמנים). זו הייתה המטרה העיקרית שלנו בעיצוב מערכת זו, כפי שהתכוונו לשלב שיטות אנליטיות אחרות במורד הזרם עם TFM, אשר יכול להיות קשה עם גישות הרסניות TFM נקודות. שנית, שימוש בהפניה משתמעת המבוססת על מערכי gridded מאפשר אוטומציה של ניתוח הזחה כמעט מלאה. הערכים החריגים של המערכים יוצרים זרימת עבודה צפויה שבה התרחשות של מקרים יוצאי דופן (כלומר, נתוני תא לדוגמה המכילים פריטים שאינם צפויים כגון ריווח סמן או אי התאמות של רישום) יכולים להישמר במינימום. שלישית, הצורך לרכוש תמונת ייחוס מספק את החופש לפקח על תאים רבים במדגם אחד על פני פרקי זמן ארוכים. זה ניגודים עם גישות מסורתיות חרוז מסורתי, שם, בהתאם לנאמנות של תנועות הבמה אוטומטי של המיקרוסקופ, שגיאות במיקום יכול להצטבר ולהגדיל את הקושי של רישום כראוי התייחסות תמונות למתח התא תמונות. באופן כללי, פלטפורמה זו מקלה על תפוקה גבוהה יותר באיסוף נתוני מתח סלולריים.

עם פרוטוקול זה, אנו מקווים להכיר את הקוראים עם שני פוטון, לייזר בטכניקת סריקת הסריקה שאנו מיושם כדי ליצור את פלטפורמת TFM התייחסות זו למדוד מטוס ומחוץ למטוס רכיבי המתיחה שנוצר על ידי תאים שנזרע על פני השטח. לא מכוסה בפרוטוקול זה הוא סינתזה של חלק ממרכיבי monomeric. באופן כללי, התגובות הללו כוללות מערכת תגובת סינתזה "אחת-סיר" כמעט זהה, שתוארה קודם לכן²¹, וניתן גם לרכוש חלופות למוצרים אלה. אנו גם מכוונים להכיר את הקוראים עם הכלים המבוססים על תוכנה שיצרנו כדי לקדם את השימוש של מיקרוסקופ לייזר מסחרית לסרוק מיקרוסקופים כמו כלים 3D הדפסה כדי להקל על ניתוח של displacements marker fiducial.

Protocol

1. פוטופוליזציה בסיס PEGDA הידרוג'ל

1. איסוף ריאגנטים
   1. לאסוף ליתיום פניקסיל-2, 4, 6-triמתילנזולייפוספאט (LAP), 3.4 kDa פולי (אתילן) גליקול דיאקריל (PEGDA), n-ויניל פירורול (NVP), אלכסיי Afluor 488 מתויג PEGDA (יתד-488), AlexaFluor 633 התווית PEGDA (יתד-633), ו הפגידים פפטיד ( יתד-RGDS) מן מקפיאים שלהם ולהביא כל אחד לטמפרטורת החדר.
   2. ב שפופרות נפרדות מיקרוצנטריפוגה ענבר, למדוד 3 מ"ג של LAP, 10 מ"ג של PEGDA, 5 מ"ג של יתד-488, 20 מ"ג של יתד-633, ו 6 מ ג של פפטיד RGDS.
2. הכנת הפתרון הקדם-פולימרי
   1. לפזר את הברכיים ב 1 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS, pH 7.4). השתמש 200 μL של הפתרון LAP מומס כדי לפזר את PEGDA. אז, השתמש 200 μL של הפתרון PEGDA לפזר את יתד-RGDS.
      הערה: אם השליטה של הצורה תא רצוי, להשמיט את המסת ה-יתד-RGDS בפתרון טרום פולימר בסיס הידרוג'ל, כפי שהוא יתווסף באמצעות שני פוטון, הדפס לייזר סריקה מאוחר יותר בפרוטוקול.
   2. השתמש 80 μL של PBS כדי לפזר את יתד-488. הוסף 2.5 μL של פתרון זה לפתרון טרום פולימר.
      הערה: יתד-488 ייתן להידרוג'ל הסופי אות פלורסנט שניתן להשתמש בו כדי לנווט במהלך הפרנינג והריכוז ניתן לשנות כדי לשנות את עוצמת האות.
   3. לסנן את הפתרון טרום פולימר השלם באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר polyטטרפלואורואתילן (מצופה) כדי להסיר את כל החלקיקים שעשויים להיות נוכח בפתרון. אם המגיבים הם מסונתז כראוי, המסנן לא צריך להיות סתום.
3. פוטופוליריזציה של ההידרוג'ל לבסיס
   1. מקום 3 μL של הפתרון טרום פולימר על גיליון שטוח דק של ביצוע alkanalkoxy. מקום שטוח 150 יקרומטר בעובי polydiמתיל siloxane (pdms) רצועות סביב, אבל לא במגע עם, ירידה של פתרון טרום פולימר. מקום שמיכות silanized אקריל^21,22,23,24 על pdms-עם droplet טרום פולימר ממורכז תחת coverslip-כדי לשטח את droplet טרום פולימר לעובי של ה . מרווחים של PDMS
   2. לחשוף את הפתרון הטרום פולימר דחוקה לאור UV עד הידרוג'ל נוצר במלואו (כ 1 דקות ב 14 mW/cm² של האור 370-400nm).
   3. הפרד בזהירות את הכיסויים של מרווח PDMS והצמד לצלחת פטרי פתוחה באמצעות ביצועים גבוהים, דבק אקרילי דו צדדי. הפעילו את הלחץ על משטח המגע הדביק כדי ליצור חותם שלם בין הכיסויים, הדבק וצלחת הפטרי-בזהירות שלא לפצח את הזכוכית.
   4. שטפו את ההידרוג'ל בצלוחית הפטרי בעזרת ה-PBS המסונן, כדי למזער את המזהמים הביולוגיים והחלקיקים.
   5. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.4 לפי הצורך כדי ליצור את המספר הרצוי של הידרו-ג'לים.
   6. הוסף 8 μL של NVP אל הנותרים 800 μL של פתרון LAP ולשמור את הפתרון הזה, כמו גם undissolved ומס פג-633 עד מוכן דפוס.
      הערה: הפתרון LAP עם NVP הוא רגיש מאוד לאור, יהיה פולימו אם לא נשמר בחושך. גלישת צינור ברדיד אלומיניום יכול לעזור לשפר את חיי המדף שלה.

2. יצירת הוראות התחלה

1. עיצוב תמונה בינארית
   1. כדי ליצור מסיכה וירטואלית לציון מערכי fiducial marker, השתמש בעיבוד תמונה או בתוכנת ציור כדי ליצור תמונה עם יחס גובה-רוחב של 100:1 (לדוגמה, 2000 פיקסלים באורך של 20 פיקסלים ברוחב).
   2. צרו שורה של 100 פיקסלים לבנים במרווח אחיד על רקע שחור הממורכז לאורך הציר הארוך של התמונה.
   3. שמור תמונה זו כסוג *. tif.
      הערה: אם השליטה בצורת תא מבוקשת על^{21,25,26,27,28}, צור מסיכה וירטואלית נוספת. השתמש בבד מרובע בצורת תמונה וצור תכונות לבנות חיוביות על רקע שחור. עבור מקורב גודל מתאים לתכונות הלבנות (אשר בסופו של דבר לתמוך הדבקה התא) להניח כי הגודל הכולל של התמונה הוא שווה ערך לגודל האשנב של המיקרוסקופ המשמש לליטוגרפיה סריקת לייזר.
2. המרת תמונה בינארית למסיכה דיגיטלית
   1. הורד את הפונקציות LSM-ROI-גנרטור זמין בחינם במאגר התוכנה²⁹.
   2. פתח את Matlab וחפש את הספריה של קבצי הפונקציות שהורדת. בפעם הראשונה בספריה, פתח את הסקריפט run_script. m Matlab והפעל את קובץ ה-script.
   3. בחר את הקובץ הבינארי *. tif להמרה. לאחר מכן, בחר תיקיה לשמירת קבצי אזורים.
   4. להזין את הגודל הסופי הרצוי, ב מיקרון, של התמונה הנבחרת. גודל תמונת הקלט יהיה בקנה מידה ומימדי כדי להתאים לפרמטרים אלה. כדי שכל התמונה תתאים בשדה התצוגה של המיקרוסקופ, הגודל הכולל של התמונה חייב להיות קטן או שווה לגודל של משטח התצוגה של המיקרוסקופ.
   5. אם יוצרים מערך פיקסל בודד, באפשרויות ROI-Generator, הקפד לבטל את הסימון בתיבת הסימון הסר את התווית תחת אזורים קטנים/פיקסלים בודדים, כדי לבדוק את הריבועיםהמסומנים בתוויות וכלה לבטל את השימוש תחת קווי הפסקה אופקית. לאחר מכן, לחץ על אישור.
      הערה: אם תיצור קובץ אזורים ליצירת תבניות תא בודדות, אפשרויות ברירת המחדל הן מתאימות.
   6. מצא את קובץ ה-*. ovl שהתקבל בתיקיה שצוינה קודם לכן. קובץ זה יש להביא למיקרוסקופ כדי לטעון את האזורים הרצויים לשלוט תריס לייזר במהלך שני פוטון לייזר סריקת ליתוגרפיה.

3. בדיית מערכים fiducial marker

1. הספגת הידרוג'ל בסיס
   1. תחת תנאי תאורה נמוכה, להוסיף 200 μL של הפתרון LAP/NVP AF633 (שניהם מוכנים בשלב 1). מערבבים ביסודיות תוך כדי הגנה מפני אור.
   2. הסר את כל פתרון ה-PBS מהצלחת פטרי המכילה הידרוג'ל PEGDA משלב 1.
   3. הוסיפו את המומסים-633-מומס להידרוג'ל כדי ליצור droplet שמקיף לחלוטין את ההידרוג'ל הבסיסי.
      הערה: אם החור בצלוחית הפטרי גדול במקצת מההידרוג'ל, הוא יכול לשמש גם כבאר כדי להחזיק את התמיסה. אחרת, ודא שהכיסויים יבשים לחלוטין לפני הוספת התמיסה הנסרטנה או שהיא עלולה לרדת מההידרוג'ל שגורם להידרוג'ל להוריד את המים במהלך התהליך.
   4. העמיסו את צלחת פטרי על מחזיק הדגימה על במת המיקרוסקופ והניחו את המכסה על צלחת פטרי. הרשו לפתרון הניקור לטבול בהידרוג'ל לפחות 30 דקות בחשיכה.
      הערה: המיקרוסקופ יכול להיות מופעל ומוגדר בזמן זה להשרות. שימוש בלייזר 488 ננומטר לדימוי ההידרוג'ל בזמן הטבילה הוא בסדר גמור.
2. הגדרת המיקרוסקופ
   1. באמצעות קו לייזר 488 ננומטר ומסננים מתאים התמונה AlexaFluor 488, לאתר את ההידרוג'ל באמצעות האות יתד-488. אוסף לחסום של אורכי גל פליטה יותר מן הגלאי כמו אלה יהיה רווי עם אות מ-יתד-633.
   2. למצוא את מרכז ההידרוג'ל במישור XY באמצעות סריקות אריחים אנכיים ואופקיים ולאפס את מיקום הבמה כאן.
   3. מצא את המשטח של ההידרוג'ל באמצעות סריקות קו והפונקציה z-מחסנית. . אפס את מיקום המיקוד כאן רמת ההידרוג'ל על ידי חזרה על הקווים האלה בסריקות מהמרכז XY כדי לזהות את מיקום המשטח והתאמת ברגים set לשלב המיקרוסקופ.
   4. בתוך סביבת העבודה של תוכנת המיקרוסקופ, ליצור קובץ ניסוי נפרד עבור photopatterning. הגדר את הכוח multiphoton ל 1.8% (15.5 mW ב 740 nm כפי שנמדד בפתח האחורי של המטרה), ואת מהירות הסריקה ל 6 (0.1 μm/μs). להתאים את גודל מסגרת התמונה בפיקסלים כדי להשיג גודל פיקסל של 0.1 יקרומטר לכל פיקסל ויחס גובה-רוחב של 100:1.
   5. טען את קובץ האזורים (*. ovl) שנוצר בשלב 2.2 לתוך הכרטיסיה אזורים. השתמש במאקרו כדי להגדיר את כל האזורים לרכישה.
   6. הפעל את הפונקציה z-מחסנית והגדר את הריווח ל-3.5 יקרומטר עבור עומק כולל של 28 יקרומטר ומספר כולל של z-פרוסות של 9.
   7. השתמש בפונקציה מיקום כדי להגדיר מיקומים ספציפיים על ההידרוג'ל שבו מערכי סמן fiducial יהיה photopatterned.
      הערה: מיקום z של מיקומים אלה יהיה להכתיב את המיקום המרכזי של כל מחסנית z; בעת הצבת מיקומים, להיות בטוח כי כל מיקום יבטיח כי נפח בדוגמת חופפים עם הידרוג'ל בכל מיקומים פני השטח.
   8. השתמש בפונקציה אריח כדי לציין שורות ועמודות נוספות בכל מיקום. היזהר כדי להימנע מאזורים בעלי תבנית חופפים. באופן אידיאלי, ודא שאזורים עם תבנית מסוימים קרובים מספיק כדי להסיר מיקומים ריקים ושאינם שמיש בין המיקומים.
3. Photopatterning המערכים fiducial marker
   1. כמו הזמן להשרות מתקרב 30 דקות סימון, לקחת רצופים z-מחסנית קו סריקות של פני השטח של הידרוג'ל כל 5 דקות כדי לבדוק נפיחות מבוסס על שינויים במיקום של פני השטח יחסית למיקום מיקוד מאופס.
   2. אם לא חל שינוי בתנוחת פני השטח על פני מרווח של 5 דקות, טען והפעל את הגדרות המתח שנוצרו בשלב 3.2.4
   3. לאחר הפעלת ניסוי הניקור, השתמש בלייזר 488 ננומטר כדי לוודא שמשטח ההידרוג'ל לא זז במהלך הניקור.
      הערה: אם משטח ההידרוג'ל לא נמצא באותו מיקום כפי שהיה לפני הזמן הנכון, קיימים מספר תרחישים. ההידרוג'ל לא הגיע לשיווי משקל מתנפח לפני הניקור, החל ההידרוג'ל להתייבש במהלך הניקור, או שמיקרוסקופ מנוסה ב-z-דריפט. המקור של תרגום פני השטח הזה צריך להיות מזוהה ותוקן בריצות הבאות.
   4. הסירו את ההידרוג'ל מהמיקרוסקופ והוציאו את התמיסה של יתד-633 מצלחת פטרי.
      הערה: ההידרוג'ל עדיין רגיש מאוד לאור. שמירה על ההידרוג'ל בחשכה חשובה מאוד עד להשלמת כל השטיפה.
   5. לשטוף את ההידרוג'ל 3 פעמים עם מסוננים סטרילי-PBS, והקפד להסיר לחלוטין את הריפוסט בין כל שטיפה לשטוף. חזור על משולש זה לשטוף כל 15 דקות עבור 1 h.
   6. הניחו להידרוג'ל לשטוף את הלילה ב-PBS.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   7. שלוש משולשים שוטפים את ההידרוג'ל עם הערוץ ואז במהירות טריפל לשטוף את ההידרוג'ל עם פתרון האתנול 200-הוכחה, ואחריו שטיפה משולשת נוספת עם PBS. אל תאפשר הידרוג'ל לשבת 200 הוכחה אתנול לפרקי זמן ארוכים.
      הערה: חלק מהרכיבים של פתרון הניקור יכול להתרסק מתוך הפתרון והפקדה על פני השטח של הידרוג'ל ולהופיע כשכבת מוצק של זריחה (~ 1-5 מיקרון עבה) תחת 633 התאורה nm. שטיפה עם אתנול 200 הוכחה צריך להסיר רכיבים לא רצויים אלה.
4. שימוש בphotopatterning עוקבות כדי ליצור תבניות תא בודדות (אופציונלי)
   הערה: אם השליטה באזור התפשטות התא והצורה רצויה, ניתן לבצע מספר סיבובים של המשך. ג'ל הבסיס חייב להיות מושמט פג-RGDS להשמיט את הניסוח הראשוני שלה. מומלץ לבצע הfiducial של מערכי סמן הסימון להתבצע האחרון כדי למנוע הלבנת של סמנים fiducial פלורסנט.
   1. התמוססות 20 מ ג של יתד-RGDS בפתרון LAP/NVP שהוכן בשלב 1.
   2. חזור על שלבים 3.1 – 3.3 באמצעות הפתרון של יתד-RGDS במקום הפתרון יתד-633. השתמש בקובץ האזורים המתאימים המגדיר את תבניות התא היחידות (ראה שלב 2 לקבלת הוראות).
      הערה: כדי להמחיש את המערכים של דפוסי ה-יתד-RGDS, קיימות מספר אפשרויות. גרסה פלואורסצנטית של פג-rgds ניתן להשתמש^21,30 או יתד-rgds יכול להיות מסומם עם הניאון יתד. מומלץ: לחילופין, קו הלייזר 488 ננומטר יכול להיות מופעל במשולב עם לייזר מרובה פוטון להלבין יתד-488 בסיס הידרוג'ל, יצירת אזורים שאינם פלורסנט החופפים עם התאגדות RGDS.

4. המחשה של מערכי fiducial סמן

1. השגת תמונת מחסנית z של מערך מפוברק
   1. החלף את ה-PBS בצלחת פטרי עם מדיית התא המשמשת לתרבות התא.
      הערה: פנול מדיה חופשית אדומה מומלצת לשימוש במהלך רכישת תמונות כדי למנוע רעילות לתמונות.
   2. אחרי 1 h של הזמן לטבול, להשתמש במיקרוסקופ מערכת הניאון מצויד מודול תאורה מובנית ההגדלה הגדלה של המים עדשה היעד כדי להמחיש את ההידרוג באמצעות מסנן להגדיר מתאים פלורסנט fiducial סמנים.
   3. לאסוף ברזולוציה גבוהה z-מחסנית של תמונות (במרווחים 0.4 יקרומטר ב z) המקיף לפחות 20 יקרומטר של עומק מהמשטח של ההידרוג'ל לתוך ההידרוג'ל באזור בתבנית, וודא הגבול העליון של מחסנית z כולל לפחות 1-2 תמונות פיזית מעל ה בדוגמת שטח (כלומר, היכן fiducial סמנים פלורסנט אינם גלויים יותר ורק רעש קיים).
      הערה: הרכישה של מחסנית תמונה זו נחוצה כדי לוודא שכל הפרמטרים מדויקים וניתן לנתח אותם לצד נתוני התא בשלב 5.3.

5. ביצוע TFM באמצעות פוטומטריה הידרוג'לים

1. זורעי תאים
   הערה: כדי לשמור על עקרות, פעל בכל השיטות הסטנדרטיות של תרבות הרקמה.
   1. לפני זריעת תאים, בצע פרוטוקולים סטנדרטיים עבור קו התא המתאים לתרבות ותחזוקה של תאים.
   2. אופציונלי אם העקרות של ההידרוג'ל היא דאגה, לדגירה את ההידרוג'ל עבור 24 שעות במדיה המכילה אנטיביוטיקה ואחריו שטיפה עם מדיה רגילה.
   3. כדי להתאים את תאי הזרע, השהה תחילה מחדש את התאים הטריסטריזציה בנפח המדיה הסופי שישמש בצלחת פטרי של הידרוג'ל.
   4. הסר את כל הפתרון מתוך צלחת ההידרוג'ל והחלף עם המדיה העמוסה בתאים.
   5. הרשו להידרוג'ל לשבת ללא הפרעה. במדיה העמוסה בתאים במשך 10 דקות
   6. הזיזו בזהירות את צלחת פטרי לאינקובטור. שמור על התאים בחממה עבור 4 שעות או עד שהתאים בעליל.
   7. החלף את המדיה העמוסה בתאים עם מדיה נטולת תאים כדי להסיר תאים שאינם מלאים.
2. השגת תמונות של תאים וסמני הfiducial
   1. הגדר את הטמפרטורה של חדר הדגירה על המיקרוסקופ כדי 37 ° c ו-CO₂ כדי 5% ולאפשר לחדר להגיע לנקודות להגדיר.
   2. מניחים את צלחת פטרי על המחזיק לדוגמה ולאתר את האזורים בדוגמת.
   3. אתר תא מעניין (COI) ורכוש תמונה משודרת או פלואורסצנטית של ה-COI.
      הערה: תמונה זו ישמשו לפלח גבול התא במהלך הניתוח, כך שהתמונה צריכה להמחיש בבהירות את הדיירים הניידים.
   4. לרכוש מחסנית z של מערך בדוגמת מתחת ל-COI כמו בשלב 4.1.4.
   5. לרכוש קבוצה שניה של תמונות משודרות או פלורסנט של התא.
      הערה: השווה את ערכת התמונה השניה לראשונה כדי לקבוע אם יש לשנות את הנזק לתא עקב הרעילות והאם יש לכוונן את הגדרות רכישת התמונות. תאים אשר לכווץ לאחר החשיפה כנראה סבלו אפקטים פוטורעילים משמעותיים, אשר עשויים להשפיע על התוצאות.
   6. חזור על שלבים 5.2.3-5.2.5 עבור כל COI.

6. ניתוח התמונות

1. הכנת קובצי התמונה לניתוח
   1. באמצעות נתונים שנאספו בשלב 5.2, הכינו מחסנית תמונה חתוכה של האזור סביב COI כך שהתמונה התחתונה (התמונה הראשונה) של המחסנית מייצגת את המסגרת הראשונה שבה: (1) > 80% מעמודות הסמן בתבנית גלויות, (2) התמונה העליונה (התמונה האחרונה) במחסנית לא מכיל עוד סמנים fiducial לעין (כלומר, מעל פני השטח הידרוג'ל), ו (3) יש לפחות 20 יקרומטר של סמנים הfiducial לא הדגיש סביב coi.
      הערה: חיתוך התמונות מפחית באופן משמעותי את זמן החישוב במהלך הניתוח. ניתן להפעיל את קוד הניתוח בשלבים מאוחרים יותר מבלי לחתוך את התמונות, אך הדבר אינו מומלץ.
   2. צרו תמונה חתוכה של התמונה המשודרת ו/או הפלורסנט כדי להתאים לחיתוך XY של המחסנית בשלב הקודם.
   3. השתמש בתמונת הפלורסנט או בתמונה הפלואורסצנטית החתוכה — המייצגת את צורת התא-כדי לפלח את התמונה באופן ידני (עקוב אחר גבול התא) או באמצעות כלי עיבוד תמונה.
   4. המר תמונה זו לתמונה בינארית שבה הפנים של התא הוא שחור (כלומר, עוצמה = 0) והאזור שמסביב לתא הוא לבן (כלומר, עוצמה ≠ 0). שמור תמונה זו כמסיכה בינארית.. טיף
   5. עבור כל COI, לאסוף את קובץ מחסנית תמונה, קובץ תמונה משודר, ואת קובץ מסכה בינארית בתיקייה אחת.
2. הפעלת קבצי script של ניתוח בתמונות
   1. שכפול או הורדה של פונקציות ניתוח TFM הזמינות ללא תשלום במאגר התוכנה²⁹. יש להוריד את המאגר כולו כאשר יש מספר משמעותי של יחסי תלות בתיקיות המשנה.
   2. פתח את Matlab והוסף את הספריה ואת כל תיקיות המשנה של השכפול המקומי של מאגר הקודים לנתיב.
   3. הגדר את הספריה בתוך סביבת העבודה Matlab למיקום התיקיה שבו אוחסנו התמונות המוכנות בשלב 6.1.
   4. פתח והפעל את קובץ המעקב. כשתתבקש, בצע את ההוראות כדי לטעון את התמונות המתאימות, בצע שלבי עיבוד מקדים ראשוניים ובדוק את אלגוריתם המעקב אחר האובייקטים.
   5. לאחר סיום הסקריפט, פתח והפעל את הפונקציה Dispshear. m . קובץ script זה אינו אמור לדרוש קלט מהמשתמש.
   6. לאחר השלמת קובץ ה -Dispshear. m , פתח והפעל את disp3D. m. אם תתבקש לפתוח תמונות כלשהן, בצע את ההוראות.
      הערה: במהלך זמן ריצה, קובץ ה-script עשוי לבקש מהמשתמש לצייר קו בתמונה של המערך בעל התבנית. קו זה צריך לייצג את ציר התנועה העיקרי של לייזר סריקה במהלך הפרינינג וצריך השורה עם שורה של fiducial סמנים בדוגמת. תהליך זה מורה לקוד לגבי הכיוון שאליו (כלומר, שורות או עמודות של fiducial סמנים) מניב את השורות המאושרות ביותר של סמני fiducial.
   7. לאחר השלמת הקוד של Dispshear. m , הפעל את הקוד dispshear. m ולאחריו את הקוד interpFinal3D_2. m . סקריפטים אלה אינם צריכים לדרוש כניסות מהמשתמש.
      הערה: ה -Script interpFinal3D_2. m ממיר נתוני הזחה לפני משטח באמצעות תוכנה שהושגה באופן חיצוני, שתוארה בעבר³¹. כדי להחיל פונקציות חיצוניות אלה, interpFinal3D_2. m מבצעת אינטרפולציה של נתוני הזחה לרשתות ממדים כדי לשמש כקלט עבור פונקציות ההמרה. אם נעשה שימוש בשיטת המרה אחרת, או אם אין צורך בפעולות מסוימות, ניתן לדלג על שלב זה.
   8. לאחר שכל קבצי ה-script יופעלו, ודא שכל הנתונים והתפוקות נמצאים בספריה הראשונית.
   9. חזור על שלבים 6.2.3 – 6.2.8 עבור כל COI.
      הערה: בתוך מאגר הקודים, ישנה תיקיה המכילה קבצי script המאפשרים הפעלת אצווה אוטומטית של כל אחד מקבצי ה-script ברשימת ספריות. עיין בסקריפטים האוטומציה עצמם (כלומר, הערות בתוך הקוד) לקבלת הוראות כיצד להשתמש בהן.

Results

במהלך הפרוטוקול, ישנם מספר מחסומים המספקים משוב להערכת איכות הליך הבדיקה. כדי לספק תובנה כלשהי בנוגע לאופן ההערכת ההתקדמות בכל אחד מנקודות הביקורת הללו, אנו מספקים תוצאות מייצגות של ניסוי אמיתי. התוצאות מדגישות את היישום של פרוטוקול זה בביצוע הידרוג'ל פוטוטנד המוכן לניתוח TFM של תאי הטבור האנושיים (HUVECs). התוצאות כוללות נתוני תמונה גולמיים, כמו גם תפוקות נתונים מעובדות בכל שלב קריטי.

המחסום הראשון מתרחש בשלב 4, לאחר מערך סמן fiducial כבר photopatterned ב הידרוג'ל. בעת איסוף מחסנית תמונה, התמ...

Discussion

המטרה של פרוטוקול זה היא לספק זרימת עבודה הקלה על רוב הקושי המשויך ליצירה ולניתוח של נתוני TFM. ברגע שהוכנו, הידרוג פוטומטריה הם פשוטים לשימוש, המחייב רק ידע של שיטות סטנדרטיות של תרבות רקמה ומיקרוסקופ פלואורסצנטית. ההיבט ללא התייחסות מאפשר ניווט שאנן על הידרו-לאדן תאים ומבטל שלבים מסורבלת עיבוד תמונה כגון רישום תמונה בין התייחסות תמונות מעוותות. הניתוח שהתקבל הוא כמעט לחלוטין אוטומטי ונתונים מתוך COIs הפרט ניתן לנתח מתחילתו ועד סופו בתוך פחות מ 10 דקות.

האתגרים העיקריים בפרוטוקול זה נובעים מה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מסנן מזרק Acrodisc, 0.2 μ m Supor Membrane, Pall מחייב חלבון נמוך		PN 4602	מאפשר סינון של תמיסות מקרומר לפני סינתזת ג'ל הבסיס ושלבי הליתוגרפיה הבאים.
אקרילט-סילאן פונקציונליזציה #1.5 Coverslips	in-house	in-house	אקרילטים מאפשרים קשירה של הידרוג'ל בסיס למשטח הזכוכית כדי לשתק את ההידרוג'לים. ראה התייחסות: 21-24
Axio-Observer Z1 עם מיקרוסקופ Apotome	Zeiss		Widefield עם מודול תאורה מובנה המשמש לצילום תמונות עבור TFM.
זיקית ויז'ן II	קוהרנט בע"מ		מצויד במיקרוסקופ סריקת לייזר המשמש לליטוגרפיה מרובת פוטונים.
סרט מצופה כפול, 9500 יחידות, 6.0 מיל	3M		קושר כיסויים פונקציונליים אקרילט-סילאן לצלחות פטרי.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	מאפשר ציפוי של סרט מצופה כפול המאפשר הזנת סרט לתוך פלוטר.
מיקרוסקופ סריקת לייזר LSM-880	Zeiss		המשמש לליטוגרפיה מרובת פוטונים.
MATLAB	Mathworks	R2018a	מפעיל סקריפטים מותאמים אישית ליצירת הוראות ליתוגרפיה למיקרוסקופ ולניתוח נתוני TFM.
דגם SC פלוטר	USCutter	SC631E	חותך סרט מצופה כפול לטבעות כדי לקשור כיסויים לצלחות פטרי.
אובייקטיבי C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		מצויד הן במיקרוסקופ שדה רחב והן במיקרוסקופ סריקת לייזר שישמש הן לליטוגרפיה והן ל-TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	גרסת PEG אקרילט עם תווית פלואורופור ליצירת סמנים פידוציאליים. ראה התייחסות: 21
PEG-DA	em>in-house	in-house	חומר בסיס להידרוג'לים. ראה התייחסות: 21
גרסת PEG-RGDS	em>in-house	in-house	RGDS עם תווית פפטיד מונו-אקרילט לקידום הידבקות תאים. ראה התייחסות: 21
צלחות פטרי	CELLTREAT	229638	חורים בגודל 8 מ"מ נחתכים במרכז כל כלי באמצעות מקדח ליבה כדי להתאים הידרוג'ל בסיסי.
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	ליצירת מרווחים לשליטה בעובי ההידרוג'ל הבסיסי (המכונה PDMS).
מזרק, Leur-Lok, 1 מ"ל	BD	309628	מאפשר סינון של תמיסות מקרומר לפני סינתזת ג'ל בסיס ושלבי הליתוגרפיה הבאים.
מנורת UV	UVP	Blak-Ray® B-100AP	מפולימר הידרוג'ל בסיס.
1-ויניל-2-פירולידינון (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	מאיץ רדיקלי וקו-מונומר. משפר את שילוב הפלואורופור הפגילטי במהלך הליתוגרפיה.