הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סיליקון הפיך שמן המושרה מודל יתר לחץ דם בעכברים

10.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60409

⸱

15 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Department of Ophthalmology, Second Xiangya Hospital of Central South University, 4Department of Ophthalmology, Veterans Affairs Palo Alto Health Care

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום לחץ דם עינית וglaucomatous ניוון בעיני העכבר על ידי הזרקה תאיים של שמן סיליקון ואת ההליך להסרת שמן סיליקון מן החדר הקדמי כדי להחזיר את הלחץ התוך בעינית מוגבה ל נורמלי.

תקציר

לחץ בעינית מוגבר (IOP) הוא גורם סיכון המתועד היטב עבור גלאוקומה. כאן אנו מתארים רומן, שיטה יעילה לגרימת בעקביות העלאת IOP יציבה בעכברים המחקה את הסיבוך שלאחר הניתוח של שימוש בשמן סיליקון (SO) כסוכן טמפונאדה בניתוח הגוף האנושי. בפרוטוקול זה, הוא מוזרק לחדר הקדמי של עין העכבר כדי לחסום את האישון ולמנוע זרימה של הומור מימית. החדר האחורי מצטבר הומור מימית וזה בתורו מגביר את ה-IOP של הקטע האחורי. הזרקה אחת SO מייצרת אמין, מספיק, יציבה IOP העלאת, אשר מעורר glaucomatous נוירוניוון משמעותי. מודל זה הוא שכפול אמיתי של גלאוקומה משנית במרפאת העין. כדי לחקות עוד יותר את ההגדרה הקלינית, ניתן להסירו מהתא הקדמי כדי לפתוח מחדש את מסלול הניקוז ולאפשר זרימה של הומור מימית, אשר מנוקז דרך העבודה הטרטותית (TM) בזווית החדר הקדמי. בגלל IOP במהירות חוזר נורמלי, המודל יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעה של הנמכת IOP על glaucomatous בתאי גנגליון ברשתית. שיטה זו פשוטה, אינה דורשת ציוד מיוחד או הליכים חוזרים, מדמה באופן מדוק מצבים קליניים, ועשויים להיות ישימים למינים שונים של בעלי חיים. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה לדרוש שינויים משניים.

מבוא

הפסד פרוגרסיבי של תאים גנגליון ברשתית (rgcs) ו אקסונים שלהם הוא סימן ההיכר של גלאוקומה, מחלה ניווניות נפוצה ברשתית1. זה ישפיע על יותר מ 100,000,000 אנשים 40 על 80 שנים על ידי 20402. IOP נשאר גורם הסיכון היחיד הניתן בפיתוח והתקדמות גלאוקומה. כדי לחקור את הפתוגנזה, התקדמות, וטיפולים פוטנציאליים של גלאוקומה, אמין, הinducible, ומודל לחץ דם עינית ניסיוני/גלאוקומה המשכפלת תכונות מפתח של חולי האדם הוא הכרחי.

ה-IOP תלוי בצורת הומור מימית לחדר הקדמי מתוך הגוף המקולל בחדר האחורי והזרימה הקדמית של העבודה בזווית החדר הקדמי. לאחר שהגיע למצב קבוע, IOP נשמרת. כאשר הזרימה הנכנס עולה או פחות מ-זרימה, IOP עולה או נופל בהתאמה. על ידי הפחתת זרימה רציפה מימית או על ידי הסגר את זווית החדר הקדמי או על ידי פגיעה TM, כמה דגמים גלאוקומה הוקמו3,4,5,6,7,8,9,10. מודלים אלה משויכים בדרך כלל עם נזק בלתי הפיך רקמת העינית, ואת iop גבוה בחדר הקדמי גם גורם סיבוכים לא רצויים כגון בצקת הקרנית ודלקת תוך העין, אשר להפוך הדמיה רשתית ופונקציה חזותית בחני קשה לבצע ולפרש.

כדי לפתח מודל הגוברת על חסרונות אלה, התמקדנו בגלאוקומה המשני המתועדות הנגרמת על ידי שמן הסיליקון (SO) המתרחשת כסיבוך פוסט-פעיל של ניתוח ויטריאורי111,12. SO משמש כטמפונדה ניתוחים ברשתית בגלל מתח משטח גבוה שלה. עם זאת, ניתן לסגר פיזית את התלמיד משום שהוא בהיר יותר מאשר הנוזלים המים והווימים, המונעים זרימה מימית לתוך החדר הקדמי. החסימה גורמת להעלאה בחדר האחורי בגלל הצטברות ההומור הימית. זה מונע מאיתנו לפתח ולאפיין את מודל העכבר לחץ דם העינית הספר מבוסס על הזרקה תאיים ובלוק אישונים13, עם תכונות מפתח של גלאוקומה משני: בלוק אישונים יעיל, העלאת iop משמעותי שיכול לחזור נורמלי לאחר SO להסרת, ו glaucomatous נוירוניוון.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליתר לחץ דם עינית המושרה בעין העכבר, כולל SO הזרקה והסרה ומדידה IOP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סטנפורד.

1. ביתר לחץ דם אינדוקציה על ידי הזרקה תאיים של SO

  1. הכינו מיקרופיפטה מזכוכית להזרקה באמצעות משיכת נימי זכוכית בעזרת פולר לייצור מיקרופיפטה. חותכים את הפתח בקצה המיקרופיפטה ומשחיזים עוד יותר את הטיפ בעזרת מכונת מיקרו-מסתובב העושה שיקוע של 35 ° עד 40 °.
  2. להבריק את קצות השיקוע ולהסיר את כל הפסולת על ידי שטיפת מים. השתמש במיקרופיפטה לפני השימוש.
  3. הכינו את מחט הפרנטזיס. לכניסת הקרנית כדי לעשות זאת, לצרף 32 G מחט ל 5 מזרק mL על נעילת Luer, ולאבטח אותו בקלטת. לכופף את המחט משופע קצה הפנים למעלה ב 30 °.
  4. הכן את מזרק SO על ידי הצמדת ואבטחת בקצה קהה 18 גרם מחט על מזרק 10 mL ראשון. ואז לצרף צינור פלסטיק עם המחט 18 G על קצה אחד ולהתמלא עם כך כנדרש דרך הקצה השני.
  5. חברו את המיקרופיפטה העקר לצינור הפלסטיק ודחפו את המזרק למילוי המיקרופיפטה כולו עם SO.

2. הזרקת כל כך החוצה לעין אחת

  1. מניחים 9 עד 10-שבוע בן זכר C57B6/J העכבר לתוך חדר אינדוקציה עם 3% isof ane מעורבב עם חמצן ב 2 L/min עבור 3 דקות.
  2. Intraperitoneally להזריק 2, 2, 2-triברומאואתנול ב 0.3 מ"ג/g משקל גוף.
    הערה: בניגוד קטמין/xylazine, 2, 2, 2-טריברואואתנול לא גורם התרחבות האישון הברורה.
  3. בדוק את חוסר התגובה לצביטה בבוהן ואת חוסר התנועה של השפם או הזנב כדי לקבוע את חוזק ההרדמה.
  4. למקם את העכבר בעמדה לרוחב על פלטפורמת ניתוח. כדי להפחית את רגישותו במהלך ההליך, להחיל טיפה אחת של 0.5% proparacaine הידרוכלוריד לקרנית לפני הזריקה.
  5. בצע חיתוך כניסה עם מחט 32 G הפרנטזיס ברביע superotemporal, כ 0.5 מ"מ מתוך לימבוס.
  6. מנהרה דרך שכבות הקרנית עבור כ 0.3 מ"מ לפני פירסינג לתוך החדר הקדמי. להיזהר לא לגעת בעדשה או איריס.
  7. למשוך את המחט לאט כדי לשחרר כמה הומור מימית (כ 1-2-2μl) מהתא הקדמי דרך המנהרה (הפאראנטזיס).
  8. המתן ~ 8 דקות כדי להקטין עוד יותר את IOP. זה יכול להיקבע על ידי מדידת הצלעות, עין בקרה.
  9. הכנס את מיקרופיפטה הזכוכית טעונה מטעון עם SO דרך מנהרת הקרנית אל החדר הקדמי, עם השיקוע הפונה מטה אל פני השטח של הקשתית.
  10. דחף את המזרק באיטיות כדי להזריק כך לתוך החדר הקדמי עד שה "מכסה את רוב משטח הקשתית, בקוטר של כ-2.4 מילימטר.
  11. השאר את המיקרופיפטה בחדר הקדמי במשך 10 ס מ לפני שהוא נסוג לאט.
  12. בעדינות לדחוף את העפעף העליון כדי לסגור את החתך קרנית כדי למזער דליפה SO.
  13. החל משחה אנטיביוטית (bacitracin-neomycin-polymyxin) למשטח העין.
  14. במהלך התהליך, לעתים קרובות להרטיב את הקרנית עם דמעות מלאכותיות.
  15. לשמור על העכבר על משטח החימום עד התאושש באופן מלא מן ההרדמה.

3. SO הסרה

  1. . הכן את מערכת ההשקיה
    1. הכינו את פתרון הגירויים בהתאם להוראות היצרן והניחו אותו בבקבוק ההשקיה. העלה את בקבוק פתרון ההשקייה ל-110-120 ס מ מעל פלטפורמת הניתוח.
    2. חברו את הממשל הרביעי. לבקבוק תמיסת השקייה להסיר בועות אוויר מתוך אבובים IV. לחבר מחט 33 G כפוף הפנים 20 ° עד אבובים IV.
  2. כדי להכין את מערכת הניקוז, להסיר את הבוכנה ממזרק 1 mL. לחבר מחט 33 G למזרק ולכופף את המחט ל 20 °.
  3. . תסיר את זה מהתא הקדמי
    1. Intraperitoneally להזריק 2, 2, 2-triברומאואתנול (0.3 מ"ג/g משקל גוף). בדוק את היעדר תגובה צביטה הבוהן כדי לקבוע את חוזק ההרדמה ואת חוסר התנועה של השפם או הזנב.
    2. למקם את העכבר על פלטפורמת ניתוח ולאבטח אותו במצב לרוחב עם קלטת. החל טיפה אחת של 0.5% proparacaine הידרוכלוריד לקרנית כדי להפחית את הרגישות שלה.
    3. לעשות שני חתכים ברביע הזמני של הקרנית בין ~ 2 ו-5 השעה בקצה של ה-SO droplet באמצעות מראש 32 G הפרנטזיס מחט.
    4. הכנס מחטים השקיה 33 G המחובר לפתרון שוטף דרך חתך הקרנית אחד, מהירות מקסימלית.
    5. הכנס עוד 33 G המחט ניקוז מוצמד למזרק ללא בוכנה דרך חתך הקרנית אחרים כדי לאפשר את ה-droplet כדי לצאת מהתא הקדמי תוך שהוא מוסיף פתרון שוטף.
    6. למשוך את המחט ניקוז, ואז את המחט השקיה.
    7. להזריק בועת אוויר לתוך התא הקדמי כדי לשמור על עומק נורמלי שלה ללחוץ כדי לסגור את חתך הקרנית.
    8. החלת משחה אנטיביוטית לשתי העיניים.
    9. לשמור על העכבר על משטח ההתאוששות החימום עד התאושש באופן מלא מן ההרדמה.

4. מדידת IOP פעם בשבוע

  1. מניחים את העכבר לתוך חדר אינדוקציה עם 3% isof, מעורבב עם חמצן ב 2L/min עבור 3 דקות.
  2. Intraperitoneally להזריק xylazine ו קטמין (0.01 mg xylazine/g, 0.08 mg קטמין/g).
  3. לשמור על קרנית לחה על ידי החלת דמעות מלאכותי במהלך ההליך.
  4. המתן כ-15 דקות כדי לאפשר לתלמיד להתרחב במלואה.
  5. למדוד את IOP של שתי העיניים באמצעות טונמטר על פי הוראות המוצר. הביאו את הטונמטר ליד עין העכבר. לשמור על המרחק מהקצה של המכשיר לקרנית העכבר בערך 3-4 מ"מ. לחץ על לחצן מדידה 6x כדי ליצור קריאה אחת. שלושה קריאות מכונה מתקבלים מכל עין כדי לרכוש את IOP מתכוון.
  6. להקריב את החיות ב 8 שבועות לאחר SO הזרקה ולבצע אימונוהיסטוכימיה של הרשתית השלמה של הר, הספירה RGC, לספור את העצב האופטי (על) חלקים דקים, ו כימות של axons ששרדו, אשר תוארו לפני13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זמן קצר לאחר ההזרקה אנחנו יכולים בקלות לזהות עכברים שאינם מייצרים לחץ דם עינית יציבה בגלל טיפות SO להיות קטן מדי (≤ 1.5 mm)13. בעלי חיים אלה אינם נכללים בניסויים הבאים. בעקבות הליכי ההזרקה, יותר מ 80% של עכברים מוזרק SO בסופו של דבר עם טיפות גדול יותר 1.6 מ"מ. מדדנו את IOP של עיני העכבר האלה פעם בשבוע עבור 8 שבועות לאחר הזרקה אחת כל כך. IOP של העין מקבל כל כך נשאר גבוה, בדרך כלל כפול IOP של העין בקרת הצלעות, המציין חסימת התלמיד יעיל (איור 1). בצקת בקרנית העכבר ניתן לב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מדגימים הליך פשוט אך יעיל לגרימת העלאת IOP מתמשכת בעין העכבר על ידי הזרקה תאיים של SO. הליך זה ניתן ללמוד במהירות על ידי כל אדם עם ניסיון מיקרו בניתוח תחת מיקרוסקופ. הסיכון הפוטנציאלי העיקרי של כישלון הוא דליפה של SO מחתך הקרנית. עם זאת, אחד היתרונות של שימוש SO היא כי השמן droplet הוא גלוי ומדידה, אנחנו יכולים בקלות לזהות עכברים שהתקבלו טיפות קטן מדי כדי לגרום ללחץ דם עינית יציב מיד לאחר ההזרקה להוציא אותם מניסויים עוקבים. השגנו באופן שגרתי 80% שיעור הצלחה ולא כולל כ 20% של עכברים בשל אז droplet קטן (≤ 1.5 מ"מ)<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על-ידי מענקי NIH EY024932, EY023295 וEY028106 לYH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5% פרופרקאין הידרוכלורידאקורן, סומרסט
10 מ"ל סיינגBDLuer-Lok קצה
18 גרם מחטBDעם שיפוע רגיל, אורך מחט: 25.4 מ"מ
2,2,2-טריברומו-אתנול (אברטין)פישר סיינטיפיקCAS# 75-80-950 גרם
32 גרם ננוBD320122BD ננו מחט עט עדינה במיוחד-32 גרם 4 מ"מ
מחט אופלמולוגיה 33GTSK/VWRTSK3313/ 10147-200
5 מ"ל מחטLuer-Lok Tip
AnaSed הזרקה (קסילזין)Butler Schein100 מ"ג/מ"ל, 50 מ"ל
דמעות מלאכותיותAlcon Laboratories300651431414Systane Ultra Lubricant טיפות עיניים
BSS PLUS תמיסת השקיהמעבדותאלקון
דו-שלבי זכוכית מיקרופיפטה חולץNARISHIGEPC-10
EZ-7000 מערכת קלאסיתמערכת EZ איזופלורן
VetOne502017איזופלורן, USP, 250 מ"ל/בקבוק
IV ערכות ניהולEXELint / Fisher29081
הזרקת קטמין הידרוכלורידVEDCO50989-996-06קטבד 100 מ"ג/מ"ל * 10 מ"ל
מכונת שיפוע מיקרו-גריינדNARISHIGEEG-401
צינורות EVA מיניאטורייםMcMaster-Carr1883T40.05 אינץ' ID, 0.09 אינץ' OD, 10 רגל
אורך שמן סיליקון (SILIKON)Alcon Laboratories80656011851,000 mPa.s
נימי זכוכית סטנדרטייםWPI / Fisher1B150-44 אינץ'. (100 מ"מ) OD 1.5 מ"מ קוטר פנימי 0.84 מ"מ
טונומטר TonoLabאספקה רפואית קולוניאלית, פינלנד
משחה אנטיביוטית וטרינריתDechra Veterinary1223RXBNP משחת עיניים, Vetropolycin
BD 65080050

מקורות

  1. Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
  4. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
  5. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
  7. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  8. Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
  9. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  10. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  11. Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
  12. Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
  13. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
  14. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  15. Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
  16. Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הזרקת שמן סיליקוןהעלאת לחץ תוך-עיניניתוח עין בעכברפרוצדורה בתא הקדמיניוון עצבי גלאוקומהטכניקה למדידת IOPהסרת שמן סיליקוןשימוש בטונומטראנליזה של תאי גנגליון ברשתית
סיליקון הפיך שמן המושרה מודל יתר לחץ דם בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.