הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60410

⸱

9 בינואר 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology and Genetics, Ben-Gurion University of the Negev, 2Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Human Oncology & Pathogenesis Program (HOPP), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Institute of Pathology, Barzilai University Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.

תקציר

השימוש בתאי אפיתל הראשוני נורמלי מאפשר ליצור לגרום לשינויים גנומית נדרש עבור שינוי הסלולר על ידי החדרת מוטציות ספציפיות אונגנים וגנים מדכא הגידול, באמצעות במרווחים רגולציה באשכולות לחזור קצר palindromic (CRISPR)-מבוססי הגנום עריכת טכנולוגיה בעכברים. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקות במדויק את השינויים הגנטיים המתרחשים בסרטן האנושי באמצעות עכברים. על ידי שינוי גנטי מהפך תאים ראשוניים, אנחנו יכולים ללמוד טוב יותר התפתחות סרטן, התקדמות, טיפול, ואבחון. במחקר זה, השתמשנו inducible Cas9 לשון העכבר תאים אפיתל כדי לאפשר עריכת הגנום באמצעות וירוס הקשורים adeno (AAV) ב מבחנה. באופן ספציפי, על ידי שינוי קראס, p53, ו APC בתאי האפיתל הלשון נורמלי, הצלחנו הראש מורנין סרטן הצוואר (HNC) קו מחוץ לתחום, אשר הוא הטמורגניים בעכברים syngeneic. השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד ליצור קווי התאים HNC עם שינויים גנומית ספציפיים ומסביר התאמה שלהם לחיזוי התקדמות הגידול בעכברים syngeneic. אנו לדמיין כי זו שיטה מבטיחה יהיה אינפורמטיבי ושימושי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול וטיפול של HNC.

מבוא

HNC הוא ממאירות נפוצה ברחבי העולם1. מידול בראשית של HNC neoplasia נמצא כעת נקודת מפנה מדעית2. בעוד מוטציות גנטיות רבות זוהו hnc2,3,4 (למשל, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, ו RAS) שילובים ספציפיים של שינויים גנותיים נדרש בקונצרט כדי לגרום hnc להישאר ברור.

השימוש הנוכחי בקווי התאים האנושיים HNC עזר באופן משמעותי כדי להבהיר את המנגנונים הקשורים בפתוגנזה וטיפול3. עם זאת, המחקר של קווי התאים האנושיים במערכות murine החיסונית יש המגבלות שלה, כי מערכות אלה אינם מטפלים בתהליך vivo נאופלסטי, התפקיד של מוטציות גנים ספציפיים, ותגובות טיפול במיקרו הסביבה החיסונית. מכאן, הפיתוח והקמתה של קווי תא מורטין עם שינויים גנטיים ספציפיים הם בעלי חשיבות עיקרית ללמוד כיצד גנים שונים תורמים לתהליך הטרנספורמציה ולבדוק טיפולים מבוססי מולקולה הרומן עכברים המוסמכת.

לימודי התפקוד הגנטי במחקרים ביו-רפואיים הושפעו באופן משמעותי מהתקדמות בטכנולוגיות לעריכת דנ א, על ידי החדרת הפסקות כפולות (DSBs), לדוגמה5. טכנולוגיות אלה, כולל שימוש בנוקלאוסים של אצבעות אבץ, שעתוק activator-כמו אפקטור נוקלאוסיס, ומקובצים באשכולות במרווחים של הרגולציה הבין-מפרידים (CRISPR/Cas9), מאפשרים מניפולציה של כל גן התעניינות בלוקוס. מערכות crispr האחרונה/Cas9 מורכב מדריך RNA (grna) המכוון את Cas9 נוקלאז כדי ליצור dsb באתר ספציפי בגנום. מערכת זו צברה הכרה נרחבת בשינוי גנים אנדוגני בתוך כל תא או רקמות היעד, אפילו באופן מסורתי קשה לטפל באורגניזמים5. יש לו יתרונות רבים על מערכות אחרות בשל פשטותו, מהירות, ויעילות.

באונקולוגיה, CRISPR/CAS9 הטכנולוגיה מילא את הצורך לחקות ביעילות תאים סרטניים. כדי להקים מערכת זו ב HNC, אנו מניפולציות קראס אואונגן חזק ושני גנים מדכא הגידול חשוב, APC ו p536. על פי מסד הנתונים של ג ' יני7, שילוב זה נדיר ב hnc. מוטציות RAS (HRAS, NRAS, ו קראס) קיימים רק ~ 7% של כל אוכלוסיית HNC. גידולים אלה נוטים להיות עמידים לטיפול8,9.

משלוח של Cas9 ו gRNA שלה מושגת באמצעות התמרה ויראלית באמצעות AAVs או לנטיאוירוסים. רקומביננטי AAV הוא לעתים קרובות את השיטה המועדפת לאספקת גנים כדי למקד את התאים בשל titer גבוה שלה, התגובה החיסונית מתון, היכולת לשנות מגוון רחב של תאים, ובטיחות כוללת. באמצעות מערכת AAV, שונים מסוימים רקמות תא העכבר נוצרו, וקווי תא חדש עדיין מפותחים10,11,12. עם זאת, מערכת יעילה של עריכת גנומית שיכולה ליצור קו התאים של murine HNC הדגמים שרידים להתפתח. במחקר זה, אנו ביקשו לפתח במערכת מבוססת על מבחנה AAV-Cas9 להפיכת תאי הלשון הראשוניים של מורלין למצב הטומורגניים. זה ייחודי CRISPR/Cas9 פרוטוקול הטרנספורמציה ואת קו הגידול הוקם התא ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של HNC הנגרמת על ידי מגוון של שינויים גנומית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי אוניברסיטת בן גוריון במועצה לטיפול בבעלי חיים בנגב ושימוש. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי IACUC (IL. 80-12-2015 ו-IL. 29-05-2018 (E)). כל ההיבטים של בדיקות בעלי חיים, דיור, ותנאים סביבתיים המשמשים במחקר זה היו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13.

1. אדנו-הפקת וירוס משויך

  1. יום 1: תרבית תאים
    1. זרע 4 x 106 HEK293T תאים לצלחת 14.5 ס מ ב 15 מ ל של DMEM זיכרון. הכינו 10 צלחות לגלגול עם פוליאתילן (1 μg/μL).
  2. יום 2: העברה של תאים HEK293T באמצעות פיי.
    1. הסר מדיה והזנה מחדש באמצעות הכלי _ זיכרון חם 1 לפני ההעברה.
    2. ריאגנטים לחימום והגברת לפני החלקה.
    3. השתמש 10 μg של הפלמיד של עניין המכיל AAV ITR (AAV pCM109 EFS היצור sg APC ס ג קראס sg P53-קראס HDR), 10 μg של AAV 2/9n capsid באמצע (עם הגן הנציג של AAV2 ואת הגן כובע של AAV9, ו 10 μg של העוזר פלמיד (מסייע פאדדלתא F5) לכל צלחת (ראה טבלת חומרים).
      הערה: דור חדש של מסייע פלאבין pAdDeltaF614,15,16 כי ניתן להשתמש גם עבור ייצור aav זמין.
    4. ערבב את הפלמידים ב 1 מ ל של DMEM רגיל לכל צלחת. לאחר מכן להוסיף 90 μL של פוליאתילן (הכולל הפלסטיות: פיי הריכוז = 1:3) לערבב באמצע ומערבולת בקצרה.
    5. מרכז את ה-DNA הפיי-פלמיד עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. הוסף את מיקס התערובת על גבי התאים הHEK293T והעבר את הלוחות לחממה לתרבות התא ב-37 ° c עם 5% CO2 עבור 24 שעות.
  3. יום 3: שינוי בינוני לאחר החצייה
    1. הסר את המדיום לחלוטין והוסף 15 מ ל של DMEM טרי.
  4. יום 5: קצירת הנגיף
    1. הכינו אמבטיית קרח יבשה/אתנול.
    2. לאסוף את התאים עם מגרד התא ולהעביר אותם לצינורות 50 mL (2 לוחות לכל 50 mL שפופרת).
    3. שפופרות ספין ב 800 x g עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. למחוק את הסופרנטאנט מכל הצינורות. הוסף 0.5 mL של מאגר הליזה (150 מ"מ מילימטר, 50 mM Tris-HCl, pH = 8.5) לכל צלחת (כלומר, 5 מ ל 10 צלחות) לצינור הראשון בלבד. השהה את התאים מחדש והעבר את הנפח הכולל לשפופרת הבאה והמשך עד לשפופרת האחרונה.
    5. העבר את ההשעיה התא לצינור 50 mL טרייה. רוחצים את הצינורות בנפח זהה של מאגר הליזה (0.5 mL לצלחת) תוך שימוש באותה שיטת העברה כמתואר בשלב 1.4.4.
    6. בנושא ההשעיה התא כדי שלושה סיבובים של ~ 10 דקות להקפיא/הפשרה בין אמבט קרח יבש/אתנול ו-37 אמבט מים ° c. מערבולת לזמן קצר לאחר כל החלקה.
    7. אם הטיהור מתבצע באותו יום, הגדר את השפה ואת מאגר הלייווציה (ראה טבלה 1 למתכון) ב-RT.
    8. הוסף 50 יחידות של בנזיל לוחית ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 1.5 h.
      הערה: בנזיל משמש כדי לעכל חומצות גרעין שיורית מתאי המפיק המארחים ואת ה-DNA פלמיד הנוכחי ההשעיה התא.
    9. לסובב את הצינורות ב 3,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
    10. לאסוף את supernatant במזרק באמצעות המחט 18 G פלדה ולדחוף את הפתרון באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר לתוך שפופרת 15 mL כדי להשיג את הליפוסט הגס.
    11. אחסן את הליפוסט הגולמי ב -4 ° c במשך כמה שבועות עד לטיהור או להמשיך בטיהור.

2. טיהור AAV

  1. . היום ה -5 ואילך
    1. מניחים את השפה ואת מאגר הלייוציה ב-RT.
    2. שוטפים עמודי כרומטוגרפיה עם 10 מ ל של מאגר השפה.
    3. הוסיפו 0.5 mL לצלחת של הפארין-אגקם לטור17 ולאחר מכן הוסיפו את מאגר האקליציה (4x הנפח של הפארין-agarose). ערבב את הפתרונות על ידי היפוך העמודה ולתת את המשקע.
    4. מאגר המשקל המפוקפק. מהעמודה על ידי כוח הכבידה
      הערה: השאר מאגר שיווציה כדי למנוע את התייבשות הצמח.
    5. טען את הליספוסט הגולמי על הטור ואת הדגירה עבור 2 h ב 4 ° c עם עצבנות מתמדת. הביאו את הטור לתנוחה זקופה והניחו לצמח להיות משקעים.
    6. . לאלט הגולמי של כוח הכבידה
    7. שטוף את הטור בעזרת מאגר אקליציה (4x הנפח של הפארין-agarose).
    8. מניחים מסנן חלבון צנטריפוגלי 100 kDa מתחת לטור והווירוס באמצעות מאגר הימנעות (3x הנפח של הפארין-agarose) לתוך המסנן.
      הערה: לא יעלה על 15 מ"ל מאגר הימנעות.
    9. צנטריפוגה את המסנן ב-3,000 x g עבור ~ 30 דקות עד שפחות מ-1 mL נשאר במסנן.
    10. למלא את המסנן עם PBS ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור ~ 30 דקות עד פחות מ 1 mL נשאר במסנן. חזור על שלב 2x זה כדי להסיר את כל המלחים.
    11. לרכז את פתרון וירוס במסנן ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g כדי להגיע באמצעי אחסון קטן ככל האפשר (פחות מ 200 μl).
    12. מחדירים את פתרון הווירוס עם מחט ומזרק ולדחוף את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך צינור.
    13. הפוך את מאגרי החלקיקים המרוכזים לאחסון.
      הערה: האליבטים צריכים להיות ~ 20 μL לאחסון לטווח קצר ב -4 ° צ' ו ~ 5 μL לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c.
    14. לקבוע את היעילות של סיכוייו והתמרה ויראלית כפי שמתואר בעבר14,18,19,20.

3. בידוד ותרבות של תאים ראשוניים

  1. היום הראשון
    1. המתת חסד של גבר בן 6 שבועות או נשים B6; 129-Gt (רוזה) 26Sortm1 (הקאג-cas9 *,-EGFP) Fezh/J על ידי שיתוף2 חנק או כל פרוטוקול iacuc אחרים שאושרו.
      הערה: אלה CRISPR/Cas9 בעכברים יש recombinase ביטוי תלוי של Cas9 endonuclease ו-egfp בבימויו של מקדם הקאג. את הרצף הנמצא במעלה לקס-Stop-לקס (LSL) בגנום של עכברים אלה למנוע את הביטוי של Cas9 ו-EGFP בהעדר recombinase היצורים. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם RNAs מדריך יחיד (sgRNAs) ומקור היצור, הם מאפשרים עריכה של גנים בודדים או מרובים של העכבר vivo או ex vivo14.
    2. מנתחים את הלשון מפני עכברים מורדמים באמצעות מספריים כירורגיים.
    3. באופן ידני לנתק את רקמת ידי משתמש רקמת הלשון לתוך שברים קטנים מאוד באמצעות אזמל. לאסוף את שברי הרקמה בצינור 15 מ ל המכיל 4.5 מ ל של RPMI רגיל (עם החוצה סרום).
    4. הוסף את שילוב האנזים המשולש (200 μl) (ראה טבלה 1 למתכון) לשברי הרקמה.
    5. דגירה את הרקמה-אנזים ערבוב ב 37 ° c עבור 30 דקות ולהקיש על הצינור כל 10 דקות כדי לשפר את הדיסוציאציה אנזימטית של הרקמה.
    6. להוסיף 5% סרום בפרה העובר (FBS) המכיל HBSS/PBS כדי לערבב את הרקמה-אנזים להפסיק את פעולת האנזים.
    7. לסנן את השעיית התא לעיל דרך רשת הניילון סטרילי 70 יקרומטר להפריד את התאים מפוזרים שברי רקמות גדול.
    8. לשטוף את ההשעיה התא מסוננים על ידי צנטריפוגה עבור 300 x g עבור 5 דקות ב HBSS/PBS ב RT.
    9. השהה מחדש את הגלולה בתווך התרבות (10% FBS ב RPMI/Dמאמ) ולצמוח ב 60 מנות תרבות מילימטר עד הקימו מושבות תאים נפרדות.
      1. מצרפים של תאים לתרבות שנשמרו על גבי המסנן בצלחת תרבות 60 מ"מ המכילה 3 מ ל של מדיה מלאה (10% FBS ב-RPMI/DMEM) עד שנוצרו מושבות תאים.
    10. לבחון את התאים העיקריים לנוכחות של זיהום פיברובלסט אחרי שבוע של תרבות. התייחס לתאים העיקריים שפותחו מאגרגטים ומשעיות תא עם 0.25 טריפסין 0.02% EDTA פתרון ב 37 ° c עבור 1 דקות כדי להסיר פיברוהולים.
      הערה: בדרך כלל, התרבות הראשית מאגרגטים של תאים יוצרת מושבות נוספות לעומת השעיות בתאים בודדים. התאים ממושבות אלה מספקים יעילות התמרה טובה יותר עם התמרה AAV.

4. התמרה חושית של תאים ראשוניים

  1. היום העשירי
    1. זרעים 2 x 105 תאים ראשוניים לכל טוב ב 6 לוחות היטב ב 2 מ ל של מדיה מלאה (10% FBS ב RPMI/dmem).
    2. למחרת, העברת התאים עם 1012 הגנום הנגיפי/mL (1010 התמרה יחידות/ml) ו מודקת את התאים במדיה ויראלי חלקיקים המכילים עבור 48 h ב 37 ° c.
    3. הסירו את המדיה האנטי-חלקיק הנגיפית והאכילו את תאי ה-AAV עם המדיה המלאה.
      הערה: רק תאים שעברו התמרה מבטאים את GFP ומתחילים להתרבות. תאים שלא עברו התמרה לבסוף ימותו בתוך שבועיים.
    4. לאחר 2 שבועות של התרחבות התרבות, זרע את התאים עבור אימות ו בניסויים vivo tuמגניים.
      הערה: דנ א גנומית מהתמרה תאים ותאים ראשוניים נורמליים מעכברים Cas9 חולצו לאימות עריכת הגנום ספציפיים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. רצף של ה-DNA שחולצו וניתוח של נתונים רצף (שולחן 2) בוצעו באמצעות הכלאה מבוסס לכידת הדור הבא בקביעת רצף (למשל, msk-השפעה פלטפורמה) כמתואר בעבר21.

5. מאמת את הטרנספורמציה של תאים נורמליים לתאים הטוריגניים באמצעות immunofluorescence ומערב מערבי

  1. אימונולווקורנציה
    1. זרע 2 x 105 תאים על 12 מ"מ שמיכות זכוכית ומניחים אותם בחממה לילה.
    2. תקן את התאים ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS (pH = 7.4) והתהליך עבור תיוג מimmunofluorescence.
    3. מודדת את התאים הקבועים עם הנוגדן העיקרי הראשון ב 1% BSA או 1% סרום ב PBST בחדר מחולל לחות עבור 1 h ב RT או לילה ב 4 ° c. הנוגדנים העיקריים המשמשים הם הארנב מונושבטיים anti-KRT 14, ארנב מונושבטיים אנטי-Cas9 נוגדן, ואת העכבר mAb.
    4. הסר את פתרון הנוגדן העיקרי מתוך שמיכות ידי שטיפת התאים 3x עבור 5 דקות עם 1x PBS.
    5. דגירה את התאים עם Cy3 החמור אנטי ארנב IgG ו/או Cy3 עז אנטי עכבר משנית הigg נוגדנים ב 5% BSA ב PBST עבור 1 h ב RT בחושך.
    6. להסיר את הפתרון נוגדן משני מתוך שמיכות ולשטוף את התאים 3x כפי שמתואר בשלב 5.1.4.
    7. הר את הכיסויים עם טיפה של בינוני גובר המכיל DAPI (DAPI Fluoromount).
    8. אחסן בחשכה ב-4 ° צ' עד שהשקופיות ממבחנות באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
  2. בלוק מערבי
    1. זרע 1 x 106 תאים השתנה בצלחת תרבות 100 מ"מ ולמקם אותם בחממה לילה.
    2. לשטוף ולגרד את התאים הופכים לתוך 200 μl קרח קר PBS.
    3. צנטריפוגה את הצינור המכיל את ההשעיה התא עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב 4 ° c כדי לצנפה את התאים.
    4. מנושף את הסופרנטאנט ולאחר מכן את התאים באמצעות מאגר הליזה (ראו לוח 1) המכיל קוקטיילים מעכבי פוספספטאז ומעכבי פרוטאז למשך 10 דקות ב -4 ° c. צנטריפוגה את lysates עבור 10 דקות ב 10,000 x g ו 4 ° צ' ולאסוף את lysates נקי.
    5. השתמש בערכת שיטת ברדפורד זמינה מסחרית כדי לקבוע את ריכוז החלבון בעקבות פרוטוקול היצרן. השתמש 4x מאגר לדוגמה (500 mM Tris pH = 6.8, 40% גליצרול, 8% SDS, 20% H2O, 0.02% ברומאופנול כחול) כדי לכוונן את דגימות חלבון ל 0.5 או 1 μg/μl. מרתיחים ב 96 ° c עבור 5 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 ° צ' או עד לביצוע ניתוח כתמי אבן מערבי.
    6. הפרדה כמויות שוות של סה כ ליפוסט (30 μg) ב-10% נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל (SDS-עמוד). ודא שצבען מגיע לתחתית הג. להעביר את החלבון קרום ניילון על ידי חצי יבש לחסום ב 25 V עבור 30 דקות.
    7. יוצקים 5% BSA ב טריס-מלוחים באגירה (TBS)-0.1% רצף (TBST) על הקרום כדי לכסות אותו לחלוטין. לחסום את הקרום עבור 1 h ב RT. דגירה הmebrane עם נוגדנים העיקרי (אנטי-היצורים, anti-Cas9, אנטי-gfp, אנטי β catenin, אנטי p53, anti-פוספהו-טיפשה, ו אנטי β אקטין מדולל ב 5% bsa tbst) ב 4 ° c לילה.
    8. לאחר הדגירה, לשטוף את הקרומים עבור 10 דקות עם 1 x TBST לוודא כי הפתרון מכסה את הקרום לחלוטין. לבצע זה לשטוף את 3x, ולאחר מכן להוסיף חזרת peroxidase (HRP)-מצותת נוגדן משני (מדולל 1:10000 ב 5% BSA TBST) לקרום. . מודטה בשביל 1 h ב-RT
    9. לאחר הדגירה, לשטוף את הקרומים עבור 10 דקות עם 1 x TBST לוודא כי הפתרון מכסה את הקרום לחלוטין. בצעו את הדימות הכימי (ראו טבלת חומרים) כדי לחשוף את הלהקות ולוכדים תמונות בהתאם.
  3. אימות הפוטנציאל הטוריגני של תאים שעברו שינוי בעכברים חיסוניים
    הערה: בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת בן-גוריון בנגב, שמרו וטופלו על-ידי עכברים. תהנהן. CB17-Prkdc-scid/סי אר אס (נוד. SCID) ו C57BL/6 עכברים שימשו למחקרים vivo. עכברים היו שוכנו באוויר מסוננים ארונות זרימה עם מחזור 12 שעות אור/כהה האכילו מזון מים libitum המודעה.
    1. שימוש 6-8 נקבה בת הנוד הנשי. CB17-Prkdc-scid/סי אר אס (נוד. SCID) ו C57BL/6 עכברים עבור המחקר.
    2. טריזיסיזציה של התאים הCas9 ל-AAV. הפסיקו את הטריסיזציה באמצעות DMEM ראש בשעה 37 ° צ' ואספו בשפופרת של 50 mL.
    3. צנטריפוגה את הצינור ב 800 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית במדיום DMEM ללא FBS. לבצע את צנטריפוגה שוב ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב-1x PBS.
      הערה: אל תשאיר את התאים ב-1x PBS במשך זמן רב מדי. תמיד לשמור על השעיה התא על הקרח כדי למנוע החוצה התאים.
    4. השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים ולדלל את התאים לריכוז הרצוי (2.5 x 107 תאים/mL) באמצעות 1X PBS. ליצור גידולים באמצעות הזרקה תת עורית של AAV-Cas9 השעיית התא השתנה באגף הימני של כל נוד. CB17-Prkdc-scid/סי אר אס (נוד. SCID) העכבר (2 x 106 תאים/עכבר). כדי ליצור מודל אורתוטרופי בעכברים syngeneic, להזריק 0.5 × 106 תאים ראשוניים או aav-Cas9 התאים הפכו לתוך הלשון של C57BL/6 עכברים המוסמכים החיסונית.
    5. המתת חסד בעלי חיים 2 שבועות הזרקה על ידי CO2 חנק, ולנתח את הגידולים מן העכברים מורדמים עבור ניתוח אימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שימוש במערכת AAV לשינוי תאי Cas9 רגילים
איור 1 מספק מפה וקטורית מפורטת של הפלג ' ה-aav המשמש במחקר זה. איור 2 מתווה את העיצוב והעבודה של המערכת המבוססת על Aav-Cas9. כדי לייצר חלקיקים ויראליים, התאים HEK293T היו מזוהמים עם וקטור הטרנסגנטי AAV ו אחרים וקטורי אריזה ויראליות באמצעות שיטת החצייה של פיי. לאחר הטיהור, התאים המכילים וירוס נאספו ולאחר מכן באמצעות תהליך החיטוי הפארין-agarose, החלקיקים הנגיפי היו מטוהרים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר שיטות שימשו בעבר כדי לשנות את התאים הראשוניים בתרבות עם דרגות משתנה של הצלחה25,26,27,28. רוב השיטות האלה להשתמש העכבר פיברוההדף תאים עבור שינוי14,17,18,19 או להשתמש קרצינוגנים כגון 4-ניטרוגליצרין quin, 1-תחמוצת (4-nqo)21,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

טרשת נפוצה היא על הוועד המייעצת של המכון הביומדע, ומנליני ריצרצ'ה קיבל כספים מחקר של פומה ביוטכנולוגיה, Daiichi-Sankio Targimmune, אימונומתודולוגיה, ו מנארני Ricerche. טרשת נפוצה היא גם מייסדת משותפת של Medendi מסעות רפואיות, ו ב 2 השנים האחרונות, קיבל את התואר אריה מ Menarini Ricerche ו-ADC פרמה. לכל הסופרים האחרים. אין מה לגלות

תודות

אנו מבקשים להודות לד ר דניאל גידלר על שסיפק לנו את הפלביניים של הדלתא 5. עבודה זו ממומנת ע י הקרן הישראלית למדע, 700/16) (ME), הקרן הלאומית למדעי המדינה-ישראל (BSF, 2017323) (לי ו-MS), האגודה הישראלית לסרטן (ICA, 20170024) (לי), הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), והקרן הדאגה (#7895) (לי). מלגת מלגות: מלגת אלון בשבילי ובאוניברסיטת בן גוריון במלגות ל-SJ ו-MP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>נוגדנים
אנטי עכבר HRPג'קסון ImmunoResearch115-035-146
אנטי ארנב HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 עכבר mAbטכנולוגיית איתות תאים14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure עז נגד עכבר IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)טכנולוגיית איתות תאים4370
ארנב חד שבטי אנטי E cadherinטכנולוגייתאיתות תאים3195S
ארנב חד שבטי אנטי-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
& cateninCell Signaling Technology9582S
Cell Lines
HEK93TATCCCRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMתעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ01-055-1A
ECL (Westar Supernova ו-Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 ו-XLS071.0250
FBSתעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ04-127-1A
HBSSSigmaH6648
הפרין - AgaroseSigmaH6508
Isolate II ערכת DNA גנומיBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSתעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Pen Strep Solutionתעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ03-031-1B
PFAסנטה קרוז ביוטכנולוגיה30525-89-4
קוקטייל מעכב פוספטאזBiotoolB15001A/B
קוקטייל מעכב פרוטאזMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris bufferMERCK Millipore648311-1KG
<חזק>אנזימים
BenzonaseSigmaE1014
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel בית העמק בע"מ03-050-1B
<חזק>מוצרי זכוכית
כיסוי תלושיבר נאורBNCB00130RA1
שקופיותבר נאורBN9308C
<חזק>זני עכבר
C57BL/6Envigo
B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/Jמעבדות ג'קסון24857
NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITמתנה חביבה מד"ר רנדל ג'יי פלאט וד"ר ג'וזף רוזנבלו, מכון ברוד של MIT והרווארד, קיימברידג', MA 02142, ארה"ב
AAV 2/9 וקטור קפסידAddgene112865
pAD Delta F5 helperאוניברסיטת בן גוריון בנגבניתן על ידי ד"ר דניאל גיטלר, המחלקה לפיזיולוגיה וביולוגיה של התא, הפקולטה למדעי הבריאות, ומרכז זלוטובסקי למדעי המוח, אוניברסיטת בן-גוריון בנגב, באר-שבע 84105, ישראל.
<חזק>מוצרי פלסטיק
Amicon-ULTRA מסנן 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 ומיקרו; מסננים סטריליים מ ', 4 מ"מMillexSLGV004SL
0.45 ומיקרו; m מסננים סטריליים, 13 מ"מMillexSLHV013SL
לוחות תרביתגריינר ביו-וואן
שפופרות פלקוןגריינר ביו-וואן

מקורות

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75(2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018(2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273(2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854(2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464(2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341(2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281(2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495(2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR Cas9AAVWestern Blotting
בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.