פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השימוש בתאי אפיתל הראשוני נורמלי מאפשר ליצור לגרום לשינויים גנומית נדרש עבור שינוי הסלולר על ידי החדרת מוטציות ספציפיות אונגנים וגנים מדכא הגידול, באמצעות במרווחים רגולציה באשכולות לחזור קצר palindromic (CRISPR)-מבוססי הגנום עריכת טכנולוגיה בעכברים. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקות במדויק את השינויים הגנטיים המתרחשים בסרטן האנושי באמצעות עכברים. על ידי שינוי גנטי מהפך תאים ראשוניים, אנחנו יכולים ללמוד טוב יותר התפתחות סרטן, התקדמות, טיפול, ואבחון. במחקר זה, השתמשנו inducible Cas9 לשון העכבר תאים אפיתל כדי לאפשר עריכת הגנום באמצעות וירוס הקשורים adeno (AAV) ב מבחנה. באופן ספציפי, על ידי שינוי קראס, p53, ו APC בתאי האפיתל הלשון נורמלי, הצלחנו הראש מורנין סרטן הצוואר (HNC) קו מחוץ לתחום, אשר הוא הטמורגניים בעכברים syngeneic. השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד ליצור קווי התאים HNC עם שינויים גנומית ספציפיים ומסביר התאמה שלהם לחיזוי התקדמות הגידול בעכברים syngeneic. אנו לדמיין כי זו שיטה מבטיחה יהיה אינפורמטיבי ושימושי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול וטיפול של HNC.
מבוא
HNC הוא ממאירות נפוצה ברחבי העולם1. מידול בראשית של HNC neoplasia נמצא כעת נקודת מפנה מדעית2. בעוד מוטציות גנטיות רבות זוהו hnc2,3,4 (למשל, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, ו RAS) שילובים ספציפיים של שינויים גנותיים נדרש בקונצרט כדי לגרום hnc להישאר ברור.
השימוש הנוכחי בקווי התאים האנושיים HNC עזר באופן משמעותי כדי להבהיר את המנגנונים הקשורים בפתוגנזה וטיפול3. עם זאת, המחקר של קווי התאים האנושיים במערכות murine החיסונית יש המגבלות שלה, כי מערכות אלה אינם מטפלים בתהליך vivo נאופלסטי,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי אוניברסיטת בן גוריון במועצה לטיפול בבעלי חיים בנגב ושימוש. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי IACUC (IL. 80-12-2015 ו-IL. 29-05-2018 (E)). כל ההיבטים של בדיקות בעלי חיים, דיור, ותנאים סביבתיים המשמשים במחקר זה היו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13.
1. אדנו-הפקת וירוס משויך
- יום 1: תרבית תאים
- זרע 4 x 106 HEK293T תאים לצלחת 14.5 ס מ ב 15 מ ל של DMEM זיכרון. הכינו 10 צלחות לגלגול עם פוליאתילן (1 μg/μL).
- יום 2: העברה של תאים HEK293T באמצעות פיי.
- הסר מדיה והזנה מחדש באמצעות הכלי _ זיכרון חם 1 לפני ההעברה.
- ריאגנטים לחימום והגברת ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש במערכת AAV לשינוי תאי Cas9 רגילים
איור 1 מספק מפה וקטורית מפורטת של הפלג ' ה-aav המשמש במחקר זה. איור 2 מתווה את העיצוב והעבודה של המערכת המבוססת על Aav-Cas9. כדי לייצר חלקיקים ויראליים, התאים HEK293T היו מזוהמים עם וקטור הטרנסגנטי AAV ו אחרים וקטורי אריזה ויראליות באמצעות שיטת החצייה של פיי. לאחר הטיהור, התאים המכילים וירוס נאספו ולאחר מכן באמצעות תהליך החיטוי הפארין-agarose, החלקיקים הנגיפי היו מטוהרים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מספר שיטות שימשו בעבר כדי לשנות את התאים הראשוניים בתרבות עם דרגות משתנה של הצלחה25,26,27,28. רוב השיטות האלה להשתמש העכבר פיברוההדף תאים עבור שינוי14,17,18,19 או להשתמש קרצינוגנים כגון 4-ניטרוגליצרין quin, 1-תחמוצת (4-nqo)21,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
טרשת נפוצה היא על הוועד המייעצת של המכון הביומדע, ומנליני ריצרצ'ה קיבל כספים מחקר של פומה ביוטכנולוגיה, Daiichi-Sankio Targimmune, אימונומתודולוגיה, ו מנארני Ricerche. טרשת נפוצה היא גם מייסדת משותפת של Medendi מסעות רפואיות, ו ב 2 השנים האחרונות, קיבל את התואר אריה מ Menarini Ricerche ו-ADC פרמה. לכל הסופרים האחרים. אין מה לגלות
תודות
אנו מבקשים להודות לד ר דניאל גידלר על שסיפק לנו את הפלביניים של הדלתא 5. עבודה זו ממומנת ע י הקרן הישראלית למדע, 700/16) (ME), הקרן הלאומית למדעי המדינה-ישראל (BSF, 2017323) (לי ו-MS), האגודה הישראלית לסרטן (ICA, 20170024) (לי), הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), והקרן הדאגה (#7895) (לי). מלגת מלגות: מלגת אלון בשבילי ובאוניברסיטת בן גוריון במלגות ל-SJ ו-MP.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>נוגדנים | |||
| אנטי עכבר HRP | ג'קסון ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| אנטי ארנב HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 עכבר mAb | טכנולוגיית איתות תאים | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure עז נגד עכבר IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | טכנולוגיית איתות תאים | 4370 | |
| ארנב חד שבטי אנטי E cadherin | טכנולוגיית | איתות תאים3195S | |
| ארנב חד שבטי אנטי-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| & catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell Lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova ו-Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 ו-XLS071.0250 | |
| FBS | תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| הפרין - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II ערכת DNA גנומי | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | תעשיות ביולוגיות ישראל בית העמק בע"מ | 03-031-1B | |
| PFA | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | 30525-89-4 | |
| קוקטייל מעכב פוספטאז | Biotool | B15001A/B | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| <חזק>אנזימים | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel בית העמק בע"מ | 03-050-1B | |
| <חזק>מוצרי זכוכית | |||
| כיסוי תלושי | בר נאור | BNCB00130RA1 | |
| שקופיות | בר נאור | BN9308C | |
| <חזק>זני עכבר | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | מעבדות ג'קסון | 24857 | |
| NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | מתנה חביבה מד"ר רנדל ג'יי פלאט וד"ר ג'וזף רוזנבלו, מכון ברוד של MIT והרווארד, קיימברידג', MA 02142, ארה"ב | |
| AAV 2/9 וקטור קפסיד | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | אוניברסיטת בן גוריון בנגב | ניתן על ידי ד"ר דניאל גיטלר, המחלקה לפיזיולוגיה וביולוגיה של התא, הפקולטה למדעי הבריאות, ומרכז זלוטובסקי למדעי המוח, אוניברסיטת בן-גוריון בנגב, באר-שבע 84105, ישראל. | |
| <חזק>מוצרי פלסטיק | |||
| Amicon-ULTRA מסנן 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 ומיקרו; מסננים סטריליים מ ', 4 מ"מ | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 ומיקרו; m מסננים סטריליים, 13 מ"מ | Millex | SLHV013SL | |
| לוחות תרבית | גריינר ביו-וואן | ||
| שפופרות פלקון | גריינר ביו-וואן |
מקורות
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
