הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60440

⸱

12 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מציגה פרוטוקול להניב התרבויות תאים הומוגנית של מנוע התנועה הראשוני, trochlear, ומנועי השדרה נוירונים. תרבויות אלה ניתן להשתמש לניתוחים השוואתיים של מורפולוגית, תאית, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של נוירונים מנוע העינית השדרה.

תקציר

מניע הנוירונים (CN3s) ו עצב סליל נוירונים (CN4s) התערוכה התנגדות יוצאת דופן למחלות ניווניות מוטוריים מנוע כגון טרשת נפוצה amyotrophic (ALS) כאשר לעומת נוירונים מנוע השדרה (smns). היכולת לבודד את העכבר הראשי CN3s, CN4s ו-SMNs יספק גישה למנגנוני לימוד המשמשים את הפגיעות הסלקטיבית. עד היום, רוב הפרוטוקולים משתמשים בתרביות תאים הטרוגנית, שיכולות לבלבל את הפרשנות של תוצאות נסיוניות. כדי למזער את הבעיות הקשורות לאוכלוסיות מעורבות של תאים, תרבויות טהורות הן חיוניות. כאן, הפרוטוקול הראשון מתאר בפרוטרוט כיצד לטהר ביעילות ולטפח CN3s/CN4s לצד SMNs מקבילים מאותם עוברים באמצעות היום העובריים 11.5 (E 18.5) איי: העוברים העכבר הטרנסגניים gfp . הפרוטוקול מספק פרטים על ניתוח והדיסוציאציה של רקמות, בידוד התא מבוסס FACS, ובטיפוח מחוץ גופית של תאים מ CN3/CN4 ו-SMN גרעיני. פרוטוקול זה מוסיף רומן במערכת התרבות CN3/CN4 מתורבת לפרוטוקולים קיימים ובמקביל מספק תרבות SMN טהורה של מינים וגילאים בהתאמה להשוואה. ניתוח התמקדות במאפיינים מורפולוגיים, סלולר, מולקולריים ואלקטרופיסיולוגיים של נוירונים מוטוריים הם אפשריים במערכת זו תרבות. פרוטוקול זה יאפשר מחקר לתוך המנגנונים המגדירים את פיתוח תא העצב המוטורי, פגיעות סלקטיבית ומחלות.

מבוא

התרבות של הנוירונים המוטוריים העיקרי הוא כלי רב עוצמה אשר מאפשר את המחקר של התפתחות עצבית, תפקוד, ורגישות לטרדוגני. תרביות נוירונים מוטוריים שימושיים במיוחד לחקר מחלות ניווניות כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS)1,2, אשר מנגנוני המחלות שלהם מובנים לחלוטין. מעניין, למרות מוות משמעותי התא של נוירונים מנוע השדרה (smns) בשני als חולים ו als מודל עכברים, מוות תאים בנוירונים (CN3s) ו עצב סליל נוירונים (CN4s) הם נדירים יחסית1,3,4,5,6,7,8,9. לפיכך, ניתוח השוואתי של תרבויות טהורות של CN3s/CN4s ו-SMNs יכול לספק רמזים חשובים לגבי מנגנונים בעלי פגיעות יחסית. למרבה הצער, מכשול גדול לניתוחים כאלה כבר חוסר יכולת לצמוח תרבויות מטוהרים של אלה נוירונים מוטוריים.

פרוטוקולים רבים תוארו לטיהור של SMNs מדגמי בעלי חיים. רוב הפרוטוקולים הללו משתמשים בדחיסות מעבר הצבע צנטריפוגה10,11,12 ו/או p75ntr-נוגדנים מבוססי-מיון-הנוגדן טכניקות13,14,15,16. צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה לנצל את הגודל הגדול של SMNs יחסית לתאי השדרה האחרים, בעוד p75Ntr הוא חלבון מתוך מסחטות מבוטא בלעדית על ידי smns בחוט השדרה. כמעט 100% התרביות smn טהור נוצרו על ידי אחד או שניהם פרוטוקולים11,12,14. עם זאת, פרוטוקולים אלה לא הצליחו ביצירת CN3/CN4 בתרבויות משום שCN3s/CN4s אינם מבטאים p75Ntrוסמנים CN3/CN4 ספציפיים אחרים לא זוהו. הם גם קטנים יותר SMNs, ולכן, קשה יותר לבודד בהתבסס על גודל. במקום זאת, במחקרים חוץ גופית של CN3s או CN4s הסתמך על הנתק17,18,19,20,21, לחקור17,22,23,24,25,26, ו פרוסה27,28 התרבויות, אשר מורכב סוגי תאים הטרוגנית, ולא קיימים פרוטוקולים עבור ה בידוד ותרבות של CN3s ראשי או CN4s.

כאן, פרוטוקול מתואר עבור ההדמיה, בידוד, טיהור, וטיפוח של CN3s, CN4s, ו SMNs מאותו יום עובריים 11.5 (E 11.5) איי: העכברים gfp הטרנסגניים29 (איור 1, איור 2א). איי. איי. אם : gfp במיוחד לתוויות נוירונים מוטוריים עם gfp מקומי המונע את קרום התא. פרוטוקול זה מאפשר למינים-ולגיל השוואה בין סוגים מרובים של נוירונים מוטוריים כדי להבהיר מנגנונים פתולוגיים במחלת העצב המוטורי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים ניצול חיות מעבדה בוצעו בהתאם הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש של בית החולים לילדים בבוסטון.

1. הגדרת מעבר מתוזמן לפני החיתוך

  1. כדי ליצור עכברים עובריים לפני הלידה עבור הקציר המנוע, שוקל כל עכבר נקבה ולהגדיר ההזדווגות מתוזמן בין איי למבוגרים מבוגרים: עכברים הטרנסגניים gfp 11.5 ימים לפני יום של בידוד תא העצב. לצורך פיתוח הפרוטוקול הזה, 129S1/C57BL/6J איי : כגון עכברים gfp, בגילאי 2-9 חודשים, שימשו וההזדווגות הוגדרה בערב.
  2. לבחון עכברים נקבה עבור אטמי הנרתיק למחרת בבוקר. שקול את התאריך שבו התקע מזוהה כיום עובריים (E) 0.5.
  3. שוקלים עכברים נשיים ובדקו לגורים באמצעות אולטרסאונד (ראו טבלת חומרים) בין e 8.5-11. . תבדקי את הסימנים להזדווגות מוצלחת
    1. לאשר את ההזדווגות מוצלחת על ידי זיהוי עלייה במשקל בעכברים נקבה (בדרך כלל > 1.5 g על E 9.5 אם יש יותר מ 5-6 עוברים).
    2. לאשר באופן חזותי עוברים תחת אולטרסאונד. עוברים ניתן לאתר בקלות על ידי אולטרסאונד לאחר E 9.5. Ultrasounds מתנהלים רק על נקבות שזכו במשקל כי הם לעיתים קרובות יותר בהריון מאשר אלה שלא.
      הערה: עכברים נקבה יכולים לעלות במשקל מסיבות אחרות מאשר הריון, אז להרוויח במשקל לבד הוא לא מחוון אמין של ההריון. אישור אולטרסאונד מונע הקרבה מיותרת של נקבות שאינן בהריון, אבל לא קריטי אם אינו זמין.

2. מצבי חיתוך והכנת כלים

  1. לבצע את כל ציפוי (למעט חומצה ניקוי של שמיכות), הכנה למדיה, רקמת הדיסוציאציה (למעט צנטריפוגה ו דגירה), ועבודת התרבות בתוך כיפה זרם למינארי כדי להבטיח את עקרות התקשורת ונוירונים מוטוריים עובריים.
  2. בעזרת תשומת לב מדוקדקת לטכניקה סטרילית, לבצע ניתוח רקמות מחוץ למכסה כיסוי של הזרם למינארי עם סיכון מינימלי של זיהום.
  3. לעקר צלחת חיתוך אחד, זוג אחד של מיקרוסקופ מספריים, זוג אחד של מלקחיים חבישה האגודל, שני זוגות של דומונט #5 מלקחיים, סכין אחת מיקרובתר, ומיני כפית אחת של מוריה מחורר על ידי האישר ב 70% אתנול לפני השימוש.

3. PDL/למינציה של כיסוי מנות/כיסויים

הערה: תרבות המונתק נוירונים מוטוריים הראשי ב 96 היטב או 24 לוחות טוב, בהתאם למספר התאים הדרושים עבור היישום. תאים יכולים להיות מאופטים ישירות בלוח התרבות של הרקמה, ללא שימוש בכיסויים, אם הבארות שקופות והעוביים תואמים להדמיה.

  1. עבור יישומים הדורשים coverslips, להכין חומצה ניקוי, מעוקר, ואוויר מיובשים שמיכות לפחות 2 ימים לפני בידוד תא העצב כפי שתוארה בעבר30. אצוות של כיסוי יכול להיות מוכן בצורה זו גם מראש של ניסויים ניתן לאחסן עד 6 חודשים ללא השפעה על איכות ניסיוני.
  2. הכנת פתרון עבודה של 20 μg/mL פולי D-ליזין (PDL) ב מלוחים פוספט מאגור (PBS) 2 ימים לפני בידוד תא העצב.
    1. הורדה PDL (1 מ"ג/mL) מראש ולאחסן ב-20 ° c כפתרון מניות.
  3. לכסות את פני השטח של כל שמיכות או את הבאר של הצלחת תרבות רקמות עם פתרון PDL מספיק פתרון עובד (למשל, 100 μL לכל טוב על 96 היטב צלחות או 500 μL לכל טוב על 24 צלחות טוב עם או בלי coverslip). המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
  4. למחרת לשטוף את 3x עם מים מעוקר.
    1. לאטום את הצלחות עם הסרט פרפין ולאחסן את הצלחות מצופה PDL ב 4 ° צ' עבור עד 1 חודש אם הם יבשים לחלוטין לאחר השטיפה הסופית.
  5. הכנת פתרון עבודה עם 10 μL של מלמינציה (1.1-1.2 מ"ג/mL) ב 1.2 mL של PBS.
    1. ממלאי מקום במניות (1.1-1.2 מ"ג/mL) מראש ובחנות ב-80 ° c.
  6. מכסים את פני השטח של כל שמיכות או גם עם מספיק למינציה בתמיסה כדי לכסות את המשטח באופן שווה. דגירה לפחות 2 h ב 37 ° צ' לפני השימוש.
    הערה: לוחות מצופים PDL/למינציה ושמיכות ניתן לאחסן עד 1 שבוע ב 37 ° c, אבל מצופה למינציה טרי הוא המועדף. הסרת מלמינציה ישירות לפני ציפוי30. אין לאפשר ללמינציה להתייבש. אם יש לאחסן את הלוחות במשך יותר מכמה שעות, הם צריכים להיות עטוף בסרט פרפין.

4. הכנת מדיה לחיתוך, תא עצב מוטורי ופתרונות דיסוציאציה

הערה: ריכוזים בסוגריים מציינים את הריכוזים הסופיים של כל מגיב.

  1. . הכן את מדיום החיתוך
    1. הפשרת סרום הסוס התרמי למשך הלילה ב -4 ° c, הכינו 1 מעלות-mL, והחנות ב-20 ° c. הפשרת הלישוב ב-RT ישירות לפני השימוש.
    2. חנות B27-מוסף (50x) ב 1 mL בשנת-20 ° c. הפשרת הלימטים ב-RT מיד לפני השימוש. הימנע מחזורי הקפאה/הפשרה.
    3. לאחסן תוספת גלוטמין (100x) ב -4 ° c או-20 ° c. התחלק ל-0.5 mL במידה והוא מאחסן ב-20 ° c.
    4. חנות פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) ב 1 מ"ל מתחת ל-20 ° c. הפשרת הלימטים ב-RT מיד לפני השימוש.
    5. כדי להפוך את בינונית לחיתוך, לערבב 9.4 mL של E שינה עם 200 μL של סרום סוסים (2%), 200 μL של 50x B27 תוספת (1x), 100 μL של תוספת גלוטמין 100x (1x) (למשל, GlutaMAX), ו-100 μL של 10,000 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL השתמש במדיום זה לאיסוף רקמות גזור ולעשות את ההשעיה הסופית של תאים מושעה.
    6. הוסף 500 μL של בינוני החיתוך לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים משנת 1.7 mL לאיסוף רקמות יום לפני בידוד תא העצב. הכינו צינור אחד לכל סוג של רקמה שייאספו (למשל, בקרה חיובית, שליטה שלילית, CN3/CN4, SMN) והחנות ב -4 ° צ' לפני השימוש.
    7. שילוב 49 mL של E שינה מדיה נמוכה זריחה עם 1 mL של תוסף B27 (1x) ולמלא את הצלחת 24 טוב עם זה בינוני (2 מ ל/טוב) יום לפני בידוד תא העצב. השתמש במנה זו עבור איסוף עוברי עכבר. החנות ב -4 ° c לפני השימוש.
  2. הכינו את מדיום התרבות. של מנוע העצב
    1. הכינו 250 μL של 25 מ"מ 2-mercaptoethanol במדיום L15 של ליבוביץ '. חנות ב-20 ° c.
    2. צור 5 μL האליבטים של 100 μg/mL פתרונות של BDNF, CNTF, ו GDNF מדולל במים מעוקרים. חנות ב-80 ° צ' והפשרה ב-RT מיד לפני השימוש.
    3. הכנת 10 מ"מ פתרון forskolin על ידי הוספת 64 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי 5 מ"ג (1.0670 μM) של forskolin ומערבולת היטב כדי לפזר לחלוטין. ואז להוסיף מים מעוקר (1.003 mL) לפתרון DMSO ומערבולת היטב. חנות 12 μL של 10 מילימטר forskolin ב-20 ° צ' והפשרה מיידית ב-RT מיד לפני השימוש.
    4. הכינו 12 Μl12$ של 100 מ"מ איזובוטילאקלילך (IBMX) מדולל ב DMSO. אחסן ב-20 ° c והפשרה מיידית ב-RT באופן מיידי לפני השימוש.
    5. כדי להפוך את מנוע התרבות תא העצב המנוע, לערבב 9.4 mL של מדיום neurobasal סיס עם 200 μL של סרום סוס (2%), 200 μL של תוספת 50x B27 (1x), 100 μL של תוספת גלוטמין 100x (1x), 100 μL של 10,000 U/m: פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL), ו 20 μL של 25 מ"מ 2-mercaptoethanol (50 μM), רצוי ישירות לפני השימוש. שלב זה יכול להתבצע עד יום אחד לפני בידוד הנוירונים.
    6. , ממש לפני השימוש להוסיף 1 μL כל אחד 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), ו-GDNF (10 ng/mL) ו-10 μL של 10 מילימטר forskolin (10 μM), ו 10 μL של 100 mM IBMX (100 μM) כדי מנוע התרבות תא חמם את המדיום עד 37 ° c.
  3. הכן את פתרונות הדיסוציאציה.
    1. להכין את הפתרון פפאין (20 U/mL פפאין ו 0.005% dnase) ו-אלבומין-ovomucoid פתרון מעכב (1 מ"ג/ml ovomucoid מעכב, 1mg/ml, ו 0.005% dnase) בעקבות הוראות היצרן.
    2. הכינו 500 μL האליבטים של כל אחד מהמעכב והפתרונות המעכבי של ovomucoid והחנות ב-80 ° c. הפשרת הלימטים ב 37 ° c מיד לפני השימוש.

5. המוח הגחוני ובחוט השדרה ניתוח

הערה: בצע את כל השלבים הבאים למעט שלבים 5.1.1-5.1.3 ו-5.1.5-5.1.6 מתחת לstereomicroscope ניתוח של קרינה פלואורסצנטית. זמן הניתוח הכולל לניסוי הוא בדרך כלל 3-5 h, בהתאם לקיאות בטכניקת החיתוך ומספר הנוירונים המוטוריים הדרושים לכל ניסוי.

  1. ניתוח מוחי בינוני
    1. המתת חסד עכבר בהריון כ 11.5 ימים postfertilization על ידי גז פחמן דו חמצני פריקה צוואר הרחם.
    2. לרסס את הבטן ביסודיות עם אתנול ולהסיר את הרחם באמצעות מספריים חיטוי מיקרובתר ומלקחיים הבוהן. לשטוף את הרחם בקצרה ב-PBS סטרילי, ולאחר מכן להעביר את לוחית הניתוח ממולא PBS מקורר.
    3. הסר את ה-איי. אס. או.- עוברים בזהירותמהרחם באמצעות מספריים מיקרודטרים סטריליים, מלקחיים לבגדי אגודל, ודומונט #5 מלקחיים ב-PBS מעוקר קר בקרח מתחת לאור הבהיר של המיקרוסקופ. באמצעות כפית סטרילית מיני מחורר מוריה, להעביר כל העובר לבאר נפרדת של 24 צלחת לוחית מלא מקורר שינה-E בינונית נמוכה זריחה בתוספת עם 1x B27. . שמור את הצלחת ה -24 על הקרח
    4. העבר עובר אחד לצלחת הניתוח סטרילי ולכסות אותו לחלוטין עם תמיסת מלח קר מאוזנת של האנק ההאנק (HBSS).
    5. ודא כי שלבי החיתוך מתבצעים תחת פלואורואסעין isothiocyanate (FITC) התאורה של המיקרוסקופ. שימוש בפינצטה, מסירים את הזנב ואת פני העובר מבלי לפגוע במוח האמצע (איור 2Ba). מניחים את העובר הנוטה בגפיים מתחת לזנב ומצביעים לעבר חזית המיקרוסקופ, לכיוון הבתר (המסומן בכוכבית, איור 2Bb).
    6. שימוש בפינצטה, חותך את גג החדר הרביעי כדי ליצור פתח קטן. השתמש בפתח זה כדי לחבר פינצטה לחלל שנוצר בין החדר הרביעי לגג. מנתחים לאורך המשטח הצדדי של העובר rostral לקליפת המוח ולרוחב לצלחת הרצפה ולטור המנוע (איור 2, ב). לפתוח את רקמת לגזור באופן פתוח הספר כדי לחשוף את GFP-חיוביות CN3 ו CN4 גרעינים.
      הערה: פיסת רקמה קטנה מהמוח הגחוני המכיל את מCN3, ו-CN4 תיחשף כעת.
    7. הפרידו בזהירות את המוח המורק מהעובר והסירו את רקמת המננגיאל באמצעות מלקחיים וסכין מיקרובתר. נתח את הגרעין הדו GFP-חיוביים CN3 ו CN4 מתוך צלחת הרצפה ו-GFP שליליים אחרים רקמות הסביבה באמצעות מלקחיים וסכין מיקרובתר (איור 2ד). למקסם את מספר הנוירונים GFP-חיוביים מוטוריים ברקמת החפירה, אך להימנע מנגיעה או להזיק להם.
    8. אם יש צורך באוסף של CN3 ו-CN4 גרעינים נפרדים, גזור לאורך קו האמצע של שני הגרעינים האלה (קו מנוקד צהוב באיור 2ד). באמצעות P1000 פיפטה, לאסוף את רקמת המוח ביניים בחיתוך בראש עם HBSS מינימלי ומניחים אותו בתוך התווית 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה מלאה בינוני לנתיחה (ראה שלב 4.1.5). אחסן על הקרח עד לדיסוציאציה.
    9. המשך לאחד משני המוחות הגהים מעוברים נוספים באותה צינורית עד שהמספר הכולל עומד בדרישות הנסיוניות (עיין בשלב 8 עבור מספרי תאים אידיאליים).
      הערה: אוסף במאגר של לפחות 10 מוחות מיניים הגוניים מניב כ 1 x 104 CN3/CN4 נוירונים מוטוריים מומלץ כי הרקמות כפופות ללחץ במהלך הדיסוציאציה ומיון.
  2. קרע בחוט השדרה
    1. שמור על העובר נוטה עם הראש מול המיקרוסקופ, לכיוון הבתר. החזיקו את העובר עם זוג מלקחיים אחד והכניסו את קצה זוג הפינצטה השני לחלק האחר של החדר הרביעי.
    2. פתח את שאר המוח לאחר השידרה ואת חוט השדרה דורסלי מעל היקף rostrocaudal כולו של העובר. פתח על ידי חיתוך רקמה על גבי, החל החדר הרביעי ועובד לכיוון התעלה המרכזית של החוט השדרה caudal באמצעות מלקחיים כמו מספריים (איור 2Ca, ב). לדאוג להימנע מנגיעה או פגיעה בחוט השדרה הגחוני במהלך הליך זה.
    3. להחזיק את העובר עם זוג מלקחיים אחד ולצבוט את הכנף של הרקמה הצדדית בכל צד עם זוג מלקחיים אחרים (איור 2Ea, b).
      הערה: הרקמות הקדמיות מכילות את העור, המסנכילי, השורש העצמי, וחוט השדרה. הסר מרקמות אלה ככל האפשר מבלי להזיק לגרעיני SMN, משום שהם דבקים ויכולים ללכוד Smn במהלך הסינון או לגרום לסתימת במהלך מיון FACS.
    4. הסר את חוט השדרה הגחוני באמצעות סכין מיקרוחיתוך לחדור ישירות מתחת GFP-חיוביים SMN. הרימו את חוט השדרה הגחוני עם תנועות מראה-כמו בשני הצדדים (איור 2פא, ב). חותכים את חוט השדרה הגחוני הצף באופן ישיר מעל C1, שם הראשון GFP-חיובי הקרן הקדמית פרויקטים (איור 2G). כמו כן, לחתוך בצורה הפוך בגבול העליון של הגפיים התחתונות (איור 2G). הסר את החלק הצווארי (C1)-המותני (L2-L3) של חוט השדרה הגחוני לאחר הליך זה.
    5. מניחים את חוט השדרה הגחוני ומעלה על ידי לחיצה על הרקמה GFP-שלילית בין העמודות GFP-חיוביים-SMN עם זוג אחד של מלקחיים. הסר את השאר mesenchyme, DRGs, ואת חוט השדרה על ידי גזיזת שני הצדדים של הטור GFP-חיוביים של המיקרו עם סכין החיתוך (איור 2H). לטפל למקסם את הנוירונים מנוע GFP-חיוביים מבלי להזיק להם.
    6. באמצעות P1000, לאסוף את הרקמה בחוט השדרה בגזור עם HBSS מינימלי ומקום ב-SMN שכותרתו 1.7 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ממולא מדיום לנתיחה. אחסן על הקרח עד לדיסוציאציה. המשך לאחד את מיתרי עמוד השדרה מעוברים נוספים באותה צינורית עד שהמספר הכולל עומד בדרישות הנסיוניות.
      הערה: איסוף לפחות שלושה מיתרי עמוד השדרה מניב כ 2.1 x 104 smn מומלץ כי הרקמות הם כפופים לחץ במהלך הדיסוציאציה ומיון.
    7. לאסוף נוירונים מנועי הפנים והגפיים של האיי אן: העוברים העכבר gfp כמו gfp-חיובי ו-gfp-שלילי בקרת מיון תאים פלואורסצנטית (facs), בהתאמה. הגפיים הם GFP-שלילי, כי האקסונים של GFP-חיוביים של SMNs עדיין לא האריכו את הגפיים בגיל הזה מעובריים.

6. רקמת דיסוציאציה

הערה: סה כ זמן דיסוציאציה הוא בדרך כלל 1.5 h לכל ניסוי.

  1. הפתרון המדכא החמים ו אלבומין-ovomucoid מעכב עד 37 ° c לפני הדיסוציאציה.
  2. בקצרה לסובב את הרקמות מיקרוגזור במהירות נמוכה.
  3. באמצעות P100 הצינורות, להסיר בזהירות ככל שינה E הרבה ככל האפשר מבלי למחוק רקמות.
    הערה: הקפד להסיר את כל שאריות שינה E לאחר שלב זה כדי למנוע הפחתת היעילות של שארית הדיסוציאציה בשלב הבא.
  4. הוסף את הנפח המתאים של הפתרון פפאין (טבלה 1) לכל אחד הצינורות 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה המכיל דגימות רקמות מיקרו.
    הערה: הנפח המתאים של הפאפיין לדיסוציאציה נקבע על מנת למקסם את הדיסוציאציה האפקטיבית תוך צמצום הלחץ על התאים.
  5. בעדינות קצוצות 8x עם פיפטה P200. בצע את כל השלבים נשחקו בעדינות כדי לשמר את הכדאיות המוטורית תא.
  6. דגירה את הצינורות המכילים את הרקמות עבור 30 דקות ב 37 ° צ', הגונות על ידי מצליף באצבע 10x כל 10 דקות. בעדינות קצוצות כל השעיה 8x עם פיפטה P200 לאחר הדגירה. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות.
  7. כדי להבטיח את היעילות של עיכוב ovomucoid בשלב הבא, להשתמש בP1000 הצינורות להסיר ולהשליך כמו supernatant הרבה ככל האפשר מבלי להוריד את הרקמות.
  8. השהה כדורי מחדש בנפח המתאים של הפתרון המדכא של אלבומין-ovomucoid (טבלה 1) על ידי triturating בעדינות 8x עם P200.
  9. המתן 2 דקות כדי לאפשר את כל החלקים הנותרים של רקמות שלא המונתק כדי להתיישב בתחתית הצינור.
  10. לאסוף כמו supernatant ככל האפשר ללא אספירין רקמות לא הP200 באמצעות פיפטה. העבר את הסופרנטאנט לטריות 1.7 mL בצינורות המיקרוצנטריפוגה.
  11. אם מספר נתחי רקמות יישארו ללא הנתק לאחר שלב 6.10, חזור על שלבים 6.8-6.10 עבור הרקמות הבלתי-מסווטות שנשארות בצינורות מיקרוצנטריפוגה מקוריים של 1.7 mL כדי למקסם את התשואה הסופית של תאים לא מסוטים תוך מזעור הלחץ על התאים המונתק בעבר, נכלל ב-supernatant של שלב 6.10.
  12. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. בזהירות להסיר ולמחוק את supernatant באמצעות מP1000.
  13. השהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של בינונית לחיתוך (שולחן 1) על-ידי ליטוף 8x באמצעות פיפטה P1000. הנפח המתאים של ההשעיה הסופית נקבע כך צפיפות התא אינו עולה על 107 תאים/mL, אשר יכול לחסום את הזרם של המכונה cy, הזרמת מכונה, אבל גם כך תאים אינם מדולל ביתר מוגזם, אשר התוצאות מהירות מיון האטה.
  14. לסנן את השעיות דרך מעבר 70 יקרומטר תאים כדי לחסל גושים גדולים או רקמה מעוסרת. העבר את השבולים לתוך 5 מ"ל בתחתית פוליסטירן מוקצף מבחן צינורות לחנות על הקרח עד הצורך.

7. מיון תאים פלואורסצנטית-פעיל (FACS)

הערה: פרוטוקול זה היה מיטבי באמצעות סדרן FACS מצויד עם 15 mw 405 ננומטר לייזר סגול, a 100 mw 488 nm לייזר כחול, a 75 mw 594 לייזר כתום nm, ו-40 mw 640 לייזר אדום nm. תאים ממוינים כנוזל נדן ב-PBS סטרילי תחת תנאים אספטי באמצעות זרבובית 100 יקרומטר. על מנת למזער את לחץ התאים, שיעור הזרימה נקבע ללחץ מדגם של 1-3, כך שנרכשו מקסימום 1000-4000 אירועים לשניה. סה כ זמן ה-FACS הוא בדרך כלל 1-2 h לכל ניסוי.

  1. הגדר מתח עבור פיזור קדמי וצדדי כך שאוכלוסיית התא יכולה להיות מדומה כהלכה. הגדרת מתח מתאים למיון תאים היא מורכבת ודורשת אופרטור FACS מנוסה.
  2. כדי להבחין בין אוכלוסיות תאים שונות, התווה תאים לפי גודל כפי שנקבע על-ידי אזור הפיזור הקדמי (FSC-A) לעומת המורכבות הפנימית כפי שנקבע על-ידי אזור הפיזור הצדדי (המטה-מאלהאס-א). צייר שער סביב התאים החיים כפי שצוין באיור 3Aa ואיור Ba לא לכלול פסולת ותאים מתים. קבץ את התאים באזור שגודר כאוכלוסיה 1 (P1).
  3. כדי לא לכלול את גושי התאים וכלי doublets, התווה תאים של P1 בהתאם לרוחב הפיזור הצדדי (התחנה לפני השטח) לעומת ה-האס. פי. שער את אוכלוסיית התאים היחידים כאוכלוסיה 2 (P2) (איור 3Ab ואיור Bb).
  4. העלילה P2 תאים מבוסס על רוחב פיזור הקדמי (FSC-W) לעומת FSC-A ולשער את האוכלוסייה של תאים בודדים כמו אוכלוסייה 3 (P3) (איור 3Ac ו איור Bc).
    הערה: השימוש בשני שערים רצופים ב-7.3 ו-7.4 כולל את גושי התאים ו-doublets (גבוה FSC-W וגבוה FSC-A).
  5. שער P3 תאים מבוסס על GFP לעומת allophycocyanin (APC). ערוץ APC מזהה פלואורסצנטית אוטומטי. הפעולה בערוץ זה נמנעת מלכידת תאי פלורסנט אוטומטיים. השתמש בתאים GFP-שליליים כדי לכוונן את המתח עבור ערוצי פלורסנט של FITC/GFP. באופן אידיאלי, שערים מיקום עבור אוכלוסיות תאים אלה סביב 102. בחר ספי שער עבור אוכלוסייה GFP-חיוביים 4 (P4) בנפרד עבור כל סוג של תא מנוע (איור 3לספירה ואיור Bd).
    הערה: הגדר את שער GFP הרבה יותר גבוה עבור SMNs מאשר עבור CN3s/CN4s על מנת לקבל תרבות טהורה (איור 3לספירה ואיור Bd). שער GFP נמוך יותר עבור תרבויות SMN מוביל לזיהום של התרבויות על ידי גליה ונוירונים שאינם מוטוריים. זה סביר כי יש ביטוי GFP ברמה נמוכה בכמה הנוירונים מוטוריים ושאינם בשל מקדם דולף. האחוז של תאים מבוססי GFP-חיוביים לעומת התאים הכולל הוא בדרך כלל 0.5-1.5% עבור CN3s/CN4s ו-1.5-2.5% עבור SMNs. אם הניתוח היה מוצלח, מספרים אלה יכולים לשמש ביצוע ביצועים כדי לקבוע את המיקום המתאים עבור השער GFP-חיוביים (איור 3Ae ודמות להיות).
  6. בצע את FACS בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאסוף תאים P4 לתוך טרי 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות מלאים 500 μL של מנוע התרבות תא עצב בינוני. . לשמור על קרח עד הציפוי
    הערה: למרות התאים ניתן למיין ישירות לתוך הבארות, התוצאה היא מספר אחיד של תאים לכל טוב. מיין את התאים לתוך הצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.75 mL ולאחר מכן צלחת ידנית כדי להשיג התפלגות ציפוי אפילו יותר.

8. תרבות מטוהרים הראשי מוטוריים נוירונים

  1. לדלל FACS-מבודדים CN3/CN4 ו SMN השעיות עם מנוע התרבות תא עצב מוטורית prewarmed עד 37 ° צ' לצפיפויות של 5 x 103 ו-1 x 104 תאים/mL, בהתאמה.
    הערה: אחד E 11.5 העובר תשואות בערך 1 x 103 CN3/CN4 ו 7 x 103 smn. עם זאת, תשואות אלה להסתמך בכבדות על הטוהר של בגזור רקמות, את היסודיות של דיסוציאציה תא, ואת הסף המתאים של שערי GFP במהלך FACS.
  2. העבר 96 לוחות היטב מצופה מראש עם PDL ו למינציה מתוך 37 בחממה לתרבות הרקמה ° c לתוך כיסוי הזרם למינארי ולאחר מכן לחות הלמינציה מכל באר. להשתמש בצלחות וכיסוי באופן מיידי ללא כביסה.
  3. הוסף 200 μL של מדולל CN3/CN4 ו-SMN השעיות לתוך כל באר של PDL/מצופה למינציה 96 היטב צלחות. צפיפות התא הסופית צריכה להיות 1 x 103 ו-2 x 103 תאים/גם עבור CN3/CN4 ו-smn, בהתאמה.
    הערה: צפיפות הציפוי הראשונית של SMNs ב 96 לוחות הבאר (2 x 103 תאים/גם) הוא כפול זה של CN3s/CN4s (1 x 103 תאים/גם) על מנת להשיג מספרים מוטוריים הסופי מנוע דומה ו צפיפויות ב 2 ו -9 ימים בחוץ (DIV) (4 על 6 x 102 ו 2 על 4 x 102 תאים
  4. תרבות נוירונים ב 37 ° c, 5% חממה2 .
  5. להאכיל את הנוירונים כל 5 ימים על ידי הסרת מחצית המדיה הישנה (100 μL) והחלפת עם אותו כמות של בינונית מנוע טרי עצב התרבות. ודא שתהליכים עצביים הופכים לגלויים ב-DIV 1 והופכים לעבים יותר ויותר ב-14 DIV (איור 4). גופי התאים העצביים הופכים להיות מוגדלים ונוטים לצבור בתרבויות ארוכות-טווח, במיוחד עבור SMNs (איור 4).
    הערה: בצע את כל השינויים המדיום והפתרון על-ידי השארת חצי מאמצעי האחסון הבינוני המקורי כדי להימנע מניתוק תאים מתורבתים. הדבר כולל שלבים של קיבוע ואימונוטוקוכימיה (ICC). אם כל המדיה תוסר, ללא קשר לאופן הזהירות, רוב התאים ייתנתקו ויישטף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת הפרוטוקול הזה היה לטהר ולתרבות הן העיקרי CN3s/CN4s ו-SMNs לטווח ארוך כדי לאפשר ניתוח השוואתי של המנגנונים בבסיס הפרעות נוירונים מוטוריים (ראה איור 1 ואיור 2 לסקירה).

פעם נוירונים היו מבודדים בהצלחה גדל בתרבות, כמעט טהור CN3/CN4 ותרבויות SMN התקבלו (איור 5A,B) ונשמר עבור לפחות 14 DIV (איור 4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היסטורית, במחקרים חוץ גופית של CN3 ו/או נוירונים מוטוריים CN4 הסתמך על תרבויות הטרוגנית כגון הנתק17,18,19,20,21, לחקור17,22,23,24,25,26, ו פרוסה2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

תודות

אנו מודים לבריז פטימן (ביוגן, קיימברידג ', MA, ארה ב) להוראה בשיטות הניתוח של SMN; דנה פרבר סרטן המכון זרימה Cy, מתקן לטיפול באימונולוגיה, מתקן המחקר של החטיבה לרפואה של הרווארד, מרכז הסוכרת של חוסה ליבה cy, ובריגהם ובית החולים לנשים הארגון cy, ובוסטון החולים לילדים זרימה cy, מחקר מתקן לבידוד FACS של נוירונים מוטוריים ראשי; א. א. נוג'נט, א. צ. טניי, א. י., א סמולר נגוין, M.F. רוז, מעבדה נוספת Engle, ו-Project ALS הקונסורציום חברים לסיוע טכני ודיון מתחשב. מחקר זה נתמך על ידי Project ALS. בנוסף, ממומן על ידי קרן לב יפן/באייר יאקוהין מחקר מענק בחו ל ומענק הכשרה NIH בגנטיקה T32 GM007748; ג'יג'י נתמכת על ידי תוכנית ההכשרה של NIH/ניי בבסיסים המולקולריים של מחלות עיניים (5T32EY007145-16) דרך מכון מחקר עין של שיעטים ועל ידי הכשרה נוירולוגיה התפתחותית תוכנית מלגת פוסט דוקטורט (5T32EY007145-19) דרך בית החולים לילדים של בוסטון; M. C. W היה נתמך על ידי בני (5K08EY027850) והילדים של בית החולים לרפואת עיניים (פרס דיסקברי הפקולטה); ו-E.C.E. הוא חוקר מכון רפואי הווארד יוז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 488-מצומד עז אנטי-עכבר IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-מצומד F(ab')2 עז אנטי-ארנב IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 תוסף (50x), ללא סרוםThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow CytometerBD Bioscience- יש לו 4 מערכות לייזר המצוידות בלייזרים 405, 488, 594 ו-640 ננומטר.
BD Falcon 70μ m מסנני תאי ניילוןCORNING352350לסינון התאים המתנתקים לפני FACS.
מבחנות תחתון עגול BD Falcon עם כובע הצמדCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 באר, PS, F-bottom (באר ארובה)Greiner Bio-One International655090ניסינו מספר מנות של 96 בארות וזה היה הטוב ביותר לתרבית וניתוחים לאחר
משקפי כיסוי עגולים ICC למיקרוסקופיהקארל הכט & מסייע1001/14השתמשנו בכיסוי זה מכיוון שהשטח היה גדול (קוטר: 14 מ"מ).
CNTF אנושיProSpec-Tany TechnoGene, בע"מCYT-272
חומצה ציקלופיאזונית מ- Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. אחד מגורמי הלחץ בחדר המיון.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
דימתיל סולפוקסידSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 מלקחיים גודל קצה אינוקס 0.05 מ"מ x 0.01 מ"מ טיפים ביולוגייםמכשיר כירורגי RobozRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany טכנוג'ין בע"מתוסף CYT-305
GlutaMAXתרמו פישר סיינטיפיק35050-061
הנקס' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E פלואורסצנטי נמוךBrainBitsHELFפלואורסצנטי המעכב תצפית על ביטויי ה-GFP של העובר צריך להיות נמוך.
סרום סוסים, מושבת בחום, ממוצא ניו זילנדיThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutylmethylxanthine
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 בינוניתרמו פישר 11415064
מדעי 2-מרקפטואתנולSigma-AldrichM6250
מספריים מיקרו ניתוחRoboz מכשיר כירורגיRS-5913
מיקרו סכין 4.75 אינץ' 1.7 מ"מ x 27 מ"מ להבRoboz מכשיר כירורגיRS-6272
מוריה מיני כף מחוררתכלי מדע עדינים10370-19
נוגדן חד שבטי של עכבר לסוג עצבי III β-tubulin (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים ותוכנת אלמנטיםתמונות ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות ותמונות אימונוציטוכימיה של תרביות התאים נלכדו עם ציוד זה
חומצה חנקתית 90%, אידום (ACS מוסמך)פישר ScientificA202-212לשטיפת כיסויים
אולימפוס 1.7 מ"ל מיקרו-צינורות, ClearGenesee Scientific22-281אלה הצינורות שתיארנו "צינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.7 מ"ל" בהקשר.
מערכת דיסוציאציה פפאיןWorthington Biochemical CorpLK003150תמיסת פפאין ותמיסת מעכב אלובומין-אובומוקואיד מוכנות מהערכה זו.
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lysin (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
נוגדן חד שבטי ארנב לאי 1Abcamab1095171:200
SMZ18 ו-SMZ1500 זום סטריאומיקרוסקופים עם DS-Ri1 המצלמהNikon-Dissectionבוצעה ותמונות של עוברים ורקמות מנותחים נלכדות תחת מיקרוסקופים פלואורסצנטיים אלה.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - ערכת A+B 0.9 ק"גDow Corning1696157אנו מכינים כלי חיתוך באמצעות ערכה זו.
כלים שטופלו ב- TC, 100 מ"מ x 20 מ"מGenesee Scientific25-202אנו מכינים כלי חיתוך באמצעות מנה זו.
מלקחיים חבישה Thum 4.5 "משוננים 2.2 מ"מ קצהרוחב Roboz מכשיר כירורגיRS-8100
מתמר עבור LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSלאולטרסאונד על עכברים נקבות
מכונת אולטרסאונד וטרינריתGE HealthcareLOGOQ e VETלאולטרסאונד על עכברים נקבות
Zeiss LSM 700 סדרת לייזר סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי ותוכנת זןקארל זייס-תמונה קונפוקלית של העובר צולמה עם ציוד זה

מקורות

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
  3. Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  6. Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
  7. Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
  8. Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
  9. Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
  10. Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
  11. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  12. Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763(2015).
  13. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  14. Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  17. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  18. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  19. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  20. Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
  21. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
  22. Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
  23. Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  24. Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
  25. Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
  26. Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
  27. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  28. Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911(2019).
  29. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
  30. Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
  31. An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423(2019).
  32. Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
  33. Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
  34. Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
  35. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  36. Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  37. Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
  38. Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
  39. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Isl1 GFPFACS11 5GFP
בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.