מאמר שיטה

הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית

DOI:

10.3791/60443

⸱

3 ביוני 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית תאי היפוקמפוס מנותקת היא כלי ניסויי מרכזי במדעי המוח. הישרדות התאים העצביים ותפקודם בתרבית משופרים כאשר שלדי אלמוגים משמשים כמטריצות, בשל תפקידיהם הנוירו-פרוטקטיביים והנוירומודולטיביים. לפיכך, תאים עצביים הגדלים על מטריצת אלמוגים מראים עמידות גבוהה יותר, ולכן הם מתאימים יותר לתרבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרביות של תאי עצב וגליה מנותקים בהיפוקמפוס הן מודל ניסיוני רב ערך לחקר גדילה ותפקוד עצביים על ידי מתן בידוד תאים גבוה וסביבה מבוקרת. עם זאת, הישרדותם של תאי היפוקמפוס במבחנה נפגעת: רוב התאים מתים במהלך השבוע הראשון של התרבית. לכן יש חשיבות רבה לזהות דרכים להגביר את עמידות התאים העצביים בתרבית.

סידן פחמתי בצורת אראגוניט גבישי המופק משלד של אלמוגים יכול לשמש כמטריצה מעולה ופעילה עבור תרביות עצביות. על-ידי טיפוח, הגנה והפעלה של תאי גלייה, שלד האלמוגים משפר את ההישרדות והגדילה של תאים אלה במבחנה טוב יותר מאשר מטריצות אחרות.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיפוח תאי היפוקמפוס על מטריצת אלמוגים. מטריצה זו נוצרת על ידי הצמדת גרגרי שלדי אלמוגים לצלחות תרבית, צלוחיות וכיסויי זכוכית. הגרגרים מסייעים בשיפור הסביבה של התאים על ידי הצגתם לסביבה תלת ממדית עדינה (3D) לגדול עליה וליצור מבנים דמויי רקמות. הסביבה התלת-ממדית שמציג שלד האלמוגים ניתנת לאופטימיזציה עבור התאים על ידי טחינה, המאפשרת שליטה על גודל וצפיפות הגרגרים (כלומר, חספוס המטריצה), תכונה שנמצאה כמשפיעה על פעילות תאי גלייה. יתר על כן, השימוש בדגנים מקל על התצפית והניתוח של התרביות, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופ אור. לפיכך, הפרוטוקול כולל נהלים ליצירה ואופטימיזציה של מטריצת האלמוגים ככלי לשיפור התחזוקה והפונקציונליות של תאים עצביים במבחנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרביות של תאים עצביים מנותקים, במקרה זה תאי היפוקמפוס, הן מודל ניסויי רב ערך לחקר צמיחה ותפקוד עצביים על ידי מתן בידוד תאים גבוה ונגישות 1,2,3. סוג זה של תרבית משמש לעתים קרובות במדעי המוח, פיתוח תרופות והנדסת רקמות בשל כמות המידע הגדולה שניתן לאסוף, כגון שיעורי גדילה וכדאיות, רעילות עצבית, צמיחת עצבים ורשתות, קישוריות סינפטית ופלסטיות, שינויים מורפולוגיים, ארגון וחיווט של נוירוטים וכו '.1,4,5,6,7.

למרות חשיבותן של התרביות, התאים המתורבתים נאלצים בדרך כלל לגדול על כיסויי זכוכית בחד-שכבה דו-ממדית. שינויים סביבתיים מחמירים אלה מפחיתים באופן משמעותי את יכולתם של תאים עצביים לשרוד לאורך זמן, מכיוון שכיסויי זכוכית הם מצעים שאינם מזינים עם חוזק הדבקה נמוך, ומציגים יכולת נמוכה יותר לתמוך בצמיחת תאים 8,9,10,11.

מכיוון שתאים עצביים מתורבתים נאלצים לגדול בתנאים מאתגרים, גישה חיונית לשיפור הישרדותם תהיה לחקות את סביבתם הטבעית ככל האפשר12,13. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בביו-חומרים שישמשו כמטריצות ויחקו את המטריצה החוץ-תאית של התאים, מה שיאפשר להם ליצור מבנה דמוי רקמה ולסייע בהזנתם14.

השימוש בביו-חומרים הוא גישה מבטיחה לשיפור תרביות תאים, מכיוון שהם פועלים כפיגומים תואמים ביולוגית, מספקים יציבות מכנית ומשפרים מגוון תכונות תאים, כולל הידבקות, הישרדות, התפשטות, נדידה, מורפוגנזה והתמיינות15,16,17. מספר סוגים של ביו-חומרים משמשים לשיפור התנאים של התאים במבחנה. ביניהם ביופולימרים, או רכיבים ביולוגיים שהם בדרך כלל חלק מהמטריצה החוץ תאית של התאים. ביו-חומרים אלה משמשים בעיקר כצורה של חומרי ציפוי פולימריים או הידרוג'לים18,19,20. מצד אחד, המטריצות שהוזכרו לעיל מעניקות לתאים סביבה תלת-ממדית מוכרת לגדול בה, מעודדות את היצמידותם לצלחת, ונותנות להם תמיכה מכנית21,22. מצד שני, צורתם הפולימרית וכליאת התאים בתוך הידרוג'לים מפריעה לגישה של התאים לרכיבים מזינים הקיימים במצע הגידול וגם מקשה על מעקב התאים בשיטות מיקרוסקופיות23 .

שלד חיצוני של אלמוגים הוא מטריצות ביולוגיות שמקורן בים. הם עשויים סידן פחמתי, יש יציבות מכנית, והם מתכלים. מחקרים קודמים שהשתמשו בשלד האלמוגים כמטריצה לגידול תאים עצביים בתרבית הראו הידבקות הרבה יותר גדולה, בהשוואה לכיסויי זכוכית24,25. בנוסף, תאים עצביים הגדלים על שלד אלמוגים הדגימו את יכולתם לצרוך את הסידן ממנו מורכב השלד, המגן על התאים העצביים בתנאים של מחסור בחומרי מזון26. יתר על כן, שלד האלמוגים הוא מטריצה תומכת ומטפחת המגבירה את הישרדות התאים העצביים, מעודדת היווצרות רשתות עצביות, מעלה את קצב הקישוריות הסינפטית, ומאפשרת היווצרות מבנים דמויי רקמה27,28. מחקרים אחרונים הראו גם כי טופוגרפיית פני השטח של מטריצת שלד האלמוגים ממלאת תפקיד מכריע בהפצה ובהפעלה של תאי גלייה 8,29. כמו כן, שלד האלמוגים יעיל כמטריצה לגידול סוגי תאים אחרים, כגון אוסטיאוציטים30,31, הפטוציטים וקרדיומיוציטים בתרבית (נתונים שלא פורסמו).

לפיכך, שלד אלמוגים הוא מטריצה מבטיחה לטיפוח תאים במבחנה. לפיכך, הפרוטוקול המפורט להלן מתאר את הטכניקה של טיפוח תאים עצביים על שלד אלמוגים לייצור תרביות עצביות יציבות ומשגשגות יותר מאלה שהושגו בשיטות קיימות. פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי גם לטיפוח קרדיומיוציטים, הפטוציטים וסוגי תאים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה הלאומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

הערה: יש להשתמש בשלדי אלמוגים עם סידן מוגז בצורה גבישית של ארגוניט. סוגי האלמוגים שנבדקו עד כה לתרביות עצביות הם Porites Lutea, Stylophora Pistillata ו-Trachyphyllia Geoffroyi. את השלדים ניתן לרכוש בשלמותם או בקרקע.

1. ניקוי חלקי שלד האלמוגים

אזהרה: יש לבצע את השלבים הבאים במכסה מנוע כימי בטמפרטורת החדר, מכיוון שהתמיסות המתוארות להלן מסוכנות ועלולות לגרום לכוויות וגירויים.

  1. השתמשו בפטיש כדי לשבור את שלד האלמוג ולחלק אותו לשברים של 0.5–2 ס"מ. על מנת להמיס שאריות אורגניות ולא אורגניות, השרו את שברי שלד האלמוגים בתמיסת נתרן היפוכלוריט 10% למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו פעם אחת במים מזוקקים כפול (DDW).
  2. כדי להסיר את השאריות האורגניות הנותרות, השרו את השברים בתמיסת NaOH בגודל 1M למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו פעם אחת עם DDW. המשך עם הסרת הפיקדונות האורגניים על ידי השריית השברים בתמיסת 30% H 2O2 למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף את השברים 3x עם DDW.
  3. הסר כמה שיותר DDW עודף ולהשאיר את שברי האלמוגים במכסה המנוע להתייבש (1-8 שעות).

2. ניקוי כיסויי הזכוכית

  1. מעבירים את כיסויי הזכוכית לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 100 מ"מ. מוסיפים 10 מ"ל אתנול 95% למשך 15 דקות.
  2. מוציאים את האתנול ושוטפים עם DDW 3x, ממתינים 10 דקות בין כל כביסה. מניחים את המנה על צלחת חימום שחוממה מראש בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד שה-DDW מתאדה. ערבבו בעדינות את הכיסויים בתוך הצלחת מספר פעמים תוך כדי ייבוש כדי למנוע מהם להידבק זה לזה.
  3. בצע אוטוקלאבל של הכיסויים.

3. הכנת גרגרי שלד אלמוגים

  1. טוחנים את שברי שלד האלמוגים באמצעות חומר מליטה ופשטה (השחזה ידנית) עד לפירוק מלא. התוצאה היא תערובת של גרגרים בגדלים הנעים בין 20 מיקרומטר ל-200 מיקרומטר.
  2. לחילופין, טוחנים את שברי שלד האלמוגים באמצעות מכונת השחזה חשמלית במהירות של 1,000 סל"ד למשך 30 שניות (אורך להב = 6 ס"מ; רוחב = 0.5 ס"מ – 1.0 ס"מ). גודל הגרגר המתקבל דומה לטווח הגדלים המיוצר על ידי הטחינה הידנית.

4. טיהור דגנים בטווח גודל מסוים

הערה: אם יש צורך בשליטה על גודל הגרגרים במטריצה, השתמש בהליך טיהור הדגנים מבוסס הסינון הבא.

  1. העבירו את הגרגרים למסננת רשת ידנית או חשמלית עם מסנן 40 מיקרומטר.
  2. חלקו את הגרגרים לשני טווחים ספציפיים על ידי סינון הגרגרים דרך המסננת (אם משתמשים במסננת חשמלית, מומלץ להשתמש בתנאים הבאים: ניעור = 600 אמפליטודות לדקה, הקפצה = 6/s). הליך זה מייצר שתי קבוצות של גדלי גרגרים, האחת <40 מיקרומטר, והשנייה >40 מיקרומטר.
    הערה: ניתן לקבוע את שני הגדלים באמצעות מסננות של רשתות משתנות. אם רוצים טווח מוגבל יותר, יש לסנן מחדש כל קבוצה משלב 4.2 באמצעות מסננות עם רשתות שונות.
  3. Autoclave את הגרגרים.

5. הכנת כלים מצופים גרגרי אלמוגים או כיסויים

  1. לציפוי צלוחיות, צלחות או צלחות פטרי
    הערה: יש לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים.
    1. הוסיפו את גרגרי שלד האלמוגים לתמיסת פולי-D-ליזין (PDL) של 20 מיקרוגרם/מ"ל המומסת בתמיסה של הנקס. הריכוז המומלץ הוא 5 מ"ג/10 מ"ג דגנים לכל 1 מ"ל תמיסת PDL.
    2. יוצקים את התמיסה לצלוחיות ולכלים (כ-2 מ"ל/25 ס"מ2) ודגרים למשך הלילה ב-4°C. הגרגרים שוקעים ומתחברים לתחתית.
    3. למחרת, שטפו את הצלוחיות והכלים פעם אחת עם DDW סטרילי. תנו לצלוחיות ולכלים להתייבש במכסה המנוע.
      הערה: עדיף להשתמש בצלוחיות וכלים מצופים טריים. ניתן להשתמש בצלוחיות ובכלים המצופים עד שבוע לאחר הציפוי אם נשמרים ב -4 מעלות צלזיוס. עם זאת, האפקטיביות של המטריצה עלולה להיפגע.
  2. ציפוי כיסויי זכוכית (קוטר 12 מ"מ, עובי 0.17 מ"מ)
    1. הוסיפו גרגרי שלד אלמוגים ל-DDW בכל ריכוז רצוי. הצפיפויות הנפוצות המשמשות לתאים עצביים הן 5 מ"ג/מ"ל ו-10 מ"ג/מ"ל. שפכו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגרגרים על מרכז הכיסוי (איור 4).
    2. הניחו את החלקות על פלטת חימום שחוממה מראש ל-80°C והמתינו לאידוי מלא (בדרך כלל 15 דקות). בתנאים אלה, הגרגרים נצמדים לכיסוי. Autoclave את הכיסויים המצופים. יש לאחסן בתנאים סטריליים.
    3. יום לפני התרבית, מניחים את הכיסויים על מכסה של צלחת סטרילית 24 בארות. הוסף 100 μL של תמיסת PDL של 20 מיקרוגרם/מ"ל לכל כיסוי. השתמש בקצה כדי להבטיח שהנוזל מכסה את כל אזור הגרגר ואת שאר משטח הכיסוי.
    4. מכסים את המכסה בתחתית הצלחת. עוטפים את דפנות הצלחות בסרט פרפין. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
    5. למחרת, יש לשטוף פעם אחת עם DDW ולייבש במכסה המנוע.
      הערה: עדיף להשתמש בכיסויים מצופים טריים.

6. טיפוח תאים מנותקים בהיפוקמפוס על כיסויי זכוכית מצופים גרגרי שלד אלמוגים

הערה: השיטה לתרבית תאים מנותקת בהיפוקמפוס שונתה מהליכיםשפורסמו בעבר 24,27. הכנת התרבית מתוארת עבור ארבעה גורי חולדות. התפוקה הצפויה מכל היפוקמפוס היא 1-1.5 x 106 תאים.

  1. ההתקנה
    1. מכינים צלחת פטרי ריקה בקוטר 60 מ"מ. יוצקים 2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי (MEM) לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ ולשים על קרח.
    2. יוצקים 2 מ"ל של MEM לתוך צלחת 35 מ"מ ולשים אותו באינקובטור ב 37 ° C, 5-10% CO2. יוצקים 2 מ"ל MEM לתוך צינור 15 מ"ל ולשמור אותו על 4 ° C.
    3. יוצקים 1 מ"ל של יום ראשון בינוני לתוך צינור 15 מ"ל ולשים אותו באינקובטור ב 37 ° C, 5-10% CO2.
      הערה: הרכב מדיום היום הראשון מתואר בטבלת החומרים.
    4. להפשיר 200 μL של תמיסת טריפסין 2.5% ולדגור ב 37 ° C.
    5. הכינו שלוש פיפטות פסטר מזכוכית עם ראשי פסטר בקוטר 0.5 מ"מ, 0.75 מ"מ ו-1.0 מ"מ באמצעות להבה.
    6. הכינו כלי ניתוח מתאימים: מספריים אחד גדול, שני מספריים קטנים, טוויטר אחד גדול, ארבע פינצטות קטנות ואזמל אחד.
    7. הכינו סטריאומיקרוסקופ במכסה המנוע.
  2. בעזרת מספריים גדולים, הקריבו גורי חולדות ספראג דולי בני 0-3 ימים על ידי הפרדת ראשיהם מגופם לצלחת פטרי ריקה בקוטר 60 מ"מ (שלב 6.1.1). השליכו את הגופות.
  3. הרימו את הראש על ידי החזקתו מהפה עם טוויטר גדול. חותכים את העור המכסה את הגולגולת עם מספריים קטנים.
  4. בעזרת מספריים נקיים נכנסים מתחת לגולגולת (בצד המוח הקטן) וחותכים את הגולגולת ימינה ושמאלה כדי לאפשר את הסרתה. בעזרת טוויטר קטן, מקלפים את הגולגולת מהמוח.
  5. בעזרת טוויטר נקי, הפרידו את המוח מהראש והכניסו אותו לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה 2 מ"ל MEM קר (ראו שלב 6.1.2).
  6. בעזרת שתי פינצטות קטנות, מנתחים את ההיפוקמפוס תחת סטריאומיקרוסקופ. מעבירים את ההיפוקמפוס לצלחת 35 מ"מ מוכנה (משלב 6.1.2) המכילה MEM.
    הערה: יש לחזור על שלבים 6.3-6.6 עבור כל גור.
  7. חותכים את ההיפוקמפוס לפרוסות של כ-1 מ"מ בעזרת האזמל. הוסף 200 μL של תמיסת טריפסין (מדולל לריכוז סופי של 0.25%). מערבבים בעדינות ודגרים בטמפרטורה של 37°C, 5-10% CO2 למשך 30 דקות.
  8. לאחר הדגירה, להוסיף 2 מ"ל של MEM קר (שלב 6.1.2) לצלחת כדי להשבית את טריפסין. מעבירים את רקמת הטריפסינזציה לצינור 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל יום ראשון בינוני שחומם מראש ל 37 ° C (שלב 6.1.3) באמצעות פיפטת פסטר זכוכית עם הקוטר הגדול ביותר (שלב 6.1.5).
    הערה: היחס הטוב ביותר בין בינוני לרקמה (v:v) לעיבוד נוסף של הרקמה הוא 1 מ"ל/8 היפוקמפי. הימנעו ככל האפשר מהעברת המדיום עם הרקמה.
  9. לשלש את הרקמה על ידי העברתה דרך פיפטת זכוכית בקוטר הגדול ביותר 10-15 פעמים. לאחר מכן, חזור על תהליך זה באמצעות פיפטה זכוכית עם קוטר בינוני. המשך triturating עם פיפטה בקוטר הקטן ביותר. הימנע מבעבוע כדי להפחית מוות תאי.
  10. תנו לחתיכות הרקמה הנותרות לשקוע במשך 2-5 דקות, ואז העבירו את הסופרנאטנט לצינור נוסף של 15 מ"ל. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    הערה: צפיפות התאים העדיפה היא 200,000-400,000 תאים/מ"ל. השתמש במדיום היום הראשון כדי לדלל או בצנטריפוגה ב 470 x גרם כדי לרכז את התאים.
  11. זרעו 100 מיקרוליטר של תאים על כל כיסוי זכוכית. בזמן הזריעה, הקפידו לכסות את כל הכיסוי בתאים. לדגור ב 37 ° C, 5-10% CO2.
  12. למחרת, להוסיף 500 μL של מדיום גידול עצבי לבארות.
    הערה: הרכב מדיום הגידול העצבי מתואר בטבלת החומרים.
  13. העבירו בעדינות כל מכסה לבאר המתאימה לו באמצעות פינצטה תוך הסרת מדיום היום הראשון על ידי הטיית הכיסוי. יש לשאוב את המדיה הנותרת מהמכסה.
  14. לדגור ב 37 ° C, 5-10% CO2. הימנעו מהחלפת המדיום במהלך הדגירה. ניתן לשמור על תרבויות בתנאים אלה עד חודש אחד. החשש העיקרי הוא לחות. לכן, הקפידו לשמור על לח מקסימלי של האינקובטור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להכין את מטריצת שלד האלמוגים, כל שלד האלמוגים (איור 1A) נשבר לשברים של 0.5-2 ס"מ באמצעות פטיש (איור 1B) ונוקה ביסודיות משאריות אורגניות באמצעות שלושה שלבים (שלב 1 בפרוטוקול) באמצעות תמיסת היפוכלוריט 10%, תמיסת NaOH 1M ותמיסת 30%H 2 O2 (איור 1C). שברי אלמוגים נוקו היטב כאשר צבע השלד השתנה מחום (איור 1D) ללבן (איור 1E). לאחר מכן, החתיכות שנוקו (איור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המוצגת כאן מתארת דרך לשפר את התחזוקה והפונקציונליות של תאים עצביים בתרבית. הדבר מושג על ידי היצמדות התאים למטריצה העשויה מגרגירי שלד אלמוגים המזינה את התאים ומקדמת את גדילתם ופעילותם. שימוש בטכניקה זו מגדיל את יכולתו של מודל התרבית העצבית לחקות את סביבת התאים במוח.

להכנסת המטריצה כמצע תרבית יש מספר יתרונות על פני מצעים אחרים המשמשים בשיטות קלאסיות של תרבית תאים עצביים. ראשית, הוא מגביר את היצמדות התאים. השילוב של שלד אלמוגים ו-PDL יוצר הדבקה חזקה יותר מאשר זכוכית ו-PDL (לא מוצג). עלייה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית KAMIN של משרד המסחר והעבודה הישראלי ועל ידי Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות 24 בארותגריינר#60-662160
B-27Gibco#17504-044
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמה#A4503
D – סיגמא גלוקוז#G8769
הנשר החיוני המינימלי של דולבקו (DMEM)סיגמא#D5796
מסננת חשמליתארי לוי#3700
בקר עוברי סרון (FBS)תעשיות ביולוגיות#04-007-1A
יום ראשון בינוני85.1% מינימום עיט חיוני מדיום (MEM), 11.5% סרום בקר עוברי מומת בחום, 1.2% L-גלוטמין ו-2.2% D-גלוקוז.
צלוחיותגריינר#60-69016025 ס"מ ^ 2, תרבית רקמות שטופלו בסיגמא
פלואורו-דאוקסי-אורידיןסיגמא#F0503
כיסויי זכוכיתמנזל-גלזר#BNCB00120RA1
H2O2Romical#007130-72-19
סיגמאתערובת החומרים המזינים F-12 של חזיר#N4888
סיגמא תמיסת HANK#H6648
סיגמא חומצה קינורנית#K3375
L - גלוטמיןסיגמא#G7513
מסננת ידנית (40&מיקרו; m)VWR#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)סיגמא#M2279
טיט ועלידה-גרוט4-P090
NaClO (נתרן היפוכלוריט)סיגמא#425044
סיגמא NaOH#S8045
מדיוםגידול עצבי מסוכן45% MEM, 40% מדיום נשר מעובד (DMEM) של Dulbecco, 10% תערובת חומרים מזינים F-12 חזיר, 0.25% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.75% D-גלוקוז, 0.25% L-גלוטמין, 0.5% תוסף B-27, 0.1% חומצה קינורנית, 0.01% 70% אורידין ו-30% פלואורו-דאוקסי-אורידין.
צלחת פטריגריינר# 60-628160, # 60-62716060 מ"מ, 35 מ"מ, בהתאמה.
פולי D – ליזיןסיגמה#P7280
מטחנת דנטין חכמהKometaBio#GR101
טריפסיןגיבקו#15-090-046
אורידיןסיגמא#U3750
מסוכן מסוכן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005(2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Coral Skeleton MatrixHippocampal Cell CultureNeural Cell DurabilityGrain Size OptimizationSterile Coating ProcedureTrypsin Dissociation MethodHemocytometer Cell CountingPhase Contrast MicroscopyGlial Fibrillary Acidic ProteinMicrotubule Associated Protein Two

מאמרים קשורים