מאמר שיטה

שליטה במהירויות זרימה של נוזלים פעילים תלת-ממדיים מבוססי מיקרוכדורית באמצעות טמפרטורה

DOI:

10.3791/60484

⸱

26 בנובמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בטמפרטורה כדי לשלוט על מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים תלת ממדיים. היתרון של שיטה זו לא רק מאפשר להסדיר מהירויות זרימה באתרו, אלא גם מאפשר בקרה דינמית, כגון מהירויות זרימה מעת לעת כוונון מעלה ומתחת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה לשימוש בטמפרטורה כדי לכוונן את מהירויות הזרימה של הנוזלים הפעילים, תלת-ממדיים המבוססים על מיקרו-מימדי (3D). שיטה זו מאפשרת כוונון המהירויות באתרו ללא צורך לייצר דגימות חדשות כדי להגיע למהירויות רצויות שונות. כמו-כן, שיטה זו מאפשרת שליטה דינמית במהירות. רכיבה על הטמפרטורה מובילה את הנוזלים לזרום מהר ואיטי, מדי פעם. הישור הזאת מבוססת על המאפיין ארניוס של התגובה המיקרוכימית, הממחיש טווח מהירות מבוקר של זרימה של 4 – 8 μm/s. השיטה המוצגת תפתח את הדלת לעיצוב של התקנים microflu, היכן שקצבי הזרימה בערוץ מסוגלים להיות מקומיים ללא צורך בשסתום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומר פעיל מובחנים מחומר פסיבי קונבנציונאלי בשל יכולתה להמיר אנרגיה כימית לעבודה מכנית. חומר שבעל יכולת כזו יכול להיות מורכב מגופים חיים או שאינם חיים, כגון חיידקים, חרקים, colloids, דגנים, וחוטי ציטולדים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. הישויות החומריות האלה. מאינטראקציה עם השכנים שלהם בקנה מידה גדול יותר, הם מסדרים את עצמם לתוך או מערבולות כמו הסוערת (מערבולת פעילה) או חומר זורם11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. הבנה של ארגון עצמי של חומר פעיל הובילה ליישומים שונים במעבורות מולקולריות, במכשירים אופטיים ובחישוב מקבילי21,22,23. כדי להביא את היישומים לרמה הבאה יש צורך בשליטה מעבר לארגון העצמי. לדוגמה, פאלאצ'י ואח ' פיתח קולואיד ממטיט שהיה ממונע עצמית רק כאשר הוא נחשף לאור כחול בשליטה ידנית, מה שהוביל להופעת קריסטלים חיים24. מורין ואח ' הקימה את השליטה בגלגול הcolloids של קוויק באמצעות שדה חשמלי חיצוני, והתוצאה היא שנוהרים לכאן בערוץ מסלול המרוצים, כמו25. עבודות קודמות אלה מדגימות את התפקיד של השליטה המקומית ביישומים ומקדמות את בסיס הידע של החומר הפעיל.

במאמר זה, אנו מתמקדים ישור של kinesin מונחה, מיקרוטוכדורית (MT) מבוססי נוזלים פעילים תלת-ממד. הנוזלים מורכבים משלושה מרכיבים עיקריים: MTs, מנועים מולקולריים ומתכלים. מרוקן לגרום כוח מחסור לצרור MTs, אשר מאוחר יותר מגשר על ידי אשכולות מנוע. המנועים האלה הולכים. לאורך הקצה החיובי כאשר זוג מגשר מ, המנועים המקבילים מסתובבים בכיוונים מנוגדים. עם זאת, המנועים מאוגדים באשכול ואינם יכולים להתפרק, ולכן הם בשיתוף זוגות בנפרד של MTs (הזזה בין פילמנט, איור 1א). אלה הדינמיקה הזזה להצטבר, גרימת צרורות של MTsto להאריך עד להגיע אי-יציבות הקריסה שלהם נקודה ושבור (extensile צרורות, איור 1B)26. הצרורות השבורים מופרים על ידי כוח המחסור, המשתרע לאחר מכן, והדינמיקה חוזרת. במהלך תהליך הדינמיקה החוזרת, תנועות הצרור מעוררות את הנוזל הסמוך, גורם לזרמים שניתן לדמיין באמצעות מטים מיקרון בקנה מידה (איור 1ג). סאנצ'ס ואח ' והנקין אל. אפיינו את מהירויות המשמעות של המשדרים, מציאת כי המהירויות היו שונות על ידי שינוי ריכוזי אדנוזין טריפוספט (ATP), מרוקן, אשכולות מנוע, ו MTs19,27. עם זאת, היכולת הזאת קיימת רק לפני סינתזה נוזל פעיל. לאחר הסינתזה, היכולת הייתה לאבד והנוזלים המאורגנים בדרכם. כדי לשלוט על פעילות הנוזל הפעיל לאחר סינתזה, Ross.et al. דיווחו על שיטה באמצעות הפעלת האור המופעל של חלבונים מוטוריים, המאפשר פעילות נוזלים להיות מכוון ולכבות באמצעות אור28. בעוד שבקרת האור נוחה במונחים של הפעלת הנוזלים באופן מקומי, השיטה מחייבת לעצב מראש את המבנים של החלבונים המוטוריים, יחד עם שינוי הנתיבים האופטיים במיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים שיטה קלה לשימוש עבור שליטה מקומית זורם נוזלים ללא שינוי מיקרוסקופ תוך שמירה על מבנה המנוע ללא פגע.

השיטה שלנו לכוונון מקומי זרימה נוזל פעיל מבוסס על חוק arrhenius כי התגובה kinesin-MT כבר דווח להגדיל עם טמפרטורה29,30,31,32. מחקרים קודמים שלנו הראו כי התלות בטמפרטורה של מהירות ממוצע של זרימת נוזל פעיל עקב משוואת Arrhenius: v = exp (-EA/RT), כאשר הוא גורם טרום מעריכי , R הוא קבוע הגז , Ea היא אנרגיית ההפעלה, ו T היא טמפרטורת המערכת33. לכן, פעילות הנוזלים רגישה לסביבת הטמפרטורה, וטמפרטורת המערכת צריכה להיות עקבית כדי לייצב את הביצועים המוטוריים, וכתוצאה מכך מהירות זרימת הנוזלים34. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בתלות הטמפרטורה של המנוע כדי לכוונן ברציפות את מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים על-ידי התאמת טמפרטורת המערכת. אנו גם להדגים את ההכנה של דגימת נוזל פעיל, ואחריו לעלות את המדגם על הבמה מיקרוסקופ אשר הטמפרטורה נשלטת באמצעות תוכנת מחשב. הגדלת הטמפרטורה מ -16 ° c עד 36 ° c מאיץ את מהירויות הזרימה הממוצע בין 4 ל-8 μm/s. בנוסף, יכולת התנועה הפיכה: הגדלה והקטנה של הטמפרטורה ברצף מאיצה ומאטה את הזרימה. השיטה שהוראתה מתאימה למגוון רחב של מערכות בהן התגובות העיקריות מצייתות לחוק ארניוס, כגון שיטת הר הדאייה29,30,31,32.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת MTs

התראה: בשלב זה אנו מטהרו את הטובולים מרקמת מוח של שור. המוח של שור עלול לגרום מחלה של הגרסה Creutzfeldt-יאקוב (vCJD)35. לכן יש לאסוף את החומרים הקשורים לפסולת המוח והפתרונות הנלווים, הבקבוקים והפיפטה בשקית biowaste ולהיפטר מפסולת ביולוגית בהתאם לכללי המוסד.

  1. לטהר טובולים ממוח של שור (השתנה מקאזולדי36ואח ').
    1. הובלה של כ 1.5 ק ג של מוחות מבית מטבחיים מקומי לחדר קר באוניברסיטה. במהלך התחבורה, לאחסן את המוח במאגר פוספט (20 מ"מ מילימטר2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.2) על הקרח.
      הערה: כדי למקסם את התשואה הסופית של טובולין, הכמות הראשונית של טובולין פונקציונלי ברקמת המוח הטרייה היא המפתח. מוחות טריים מכילים טובולין פונקציונלי יותר. כדי להשיג את המוחות הטריים ביותר מהמטבחיים, אנו ממליצים לבקש מהקצב לספק מוחות מהפרות האחרונות שנשחטו לאחרונה. המוח לא צריך להיות מבוגר יותר 3 h כאשר מתחילים את ההליך, כי הפחתת הזמן בין השחיטה וההליך להתחיל יפיק תשואות טובות יותר.
    2. הומוגון ובירור המוח.
      1. נקו את המוח באמצעות אזמלים כדי לגזור כלי דם ורקמת חיבור לחתיכות קטנות יותר ולהסיר אותם מהמוח ביד.
        הערה: המוח הנקי צריך להיות ורוד.
      2. לטבול את רקמת המוח ניקה 1 L של פלמור מאגר (DB: 50 mM 2-(N-שורגולינו) חומצה אתאנסולפונית, 1 מ"מ cacl2, pH 6.6) לכל קילוגרם של המוח.
      3. המגון המוח עם בלנדר מטבח.
      4. צנטריפוגה את הפתרון המוח הומוגניים ב 10,000 x g ו 4 ° צ' עבור 150 דקות.
    3. פולימור MTs (ראשון פלמור).
      1. לאסוף ולערבב את הסופרנטנט עם כמויות שוות של הפתרונות הבאים ב 37 ° c: גליצרול, מאגר צינורות גבוה מאוד (HMPB: 1 M צינורות, 10 מ"מ MgCl2, 20 מ"מ אתילן גליקול-bis (β-עמינח ehyl אתר)-n, N, n, n'-הטטראצטט חומצה [egta], pH 6.9)
      2. הוסף 1.5 mm ATP ו 0.5 mm guanosine טריפוספט (gtp) לתערובת.
      3. מודג את התערובת ב 37 ° c עבור 1 h.
    4. דפולימור MTs (הר הדפלזציה הראשון).
      1. גלולה MT על ידי תפרידו ב 151,000 x g ו 37 ° צ' עבור 30 דקות.
      2. מחיקת supernatant ולהשעות מחדש כל הגלולה MT ב 10 מ ל של 4 ° צ' DB.
      3. . מודקון על קרח במשך 30 דקות
      4. מתפרעים את התערובת כל 5 דקות עם טיפ פיפטה כדי למנוע משקעי MT.
        הערה: התערובת צריכה לפנות בעוד 30 דקות, ולציין את השלמת הר דפלוניזציה.
    5. פולימור MTs (MT השני).
      1. הבהרת הפתרון על-ידי תפרידו ב-70,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
      2. לאסוף ולערבב את סופרנטנט עם כרכים שווים של 37 ° צ' גליצרול ו HMPB.
      3. הוסף 1.5 mM ATP ו 0.5 mM GTP לתערובת.
      4. מודקון את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות.
    6. חזור על שלב 1.1.4, החלפת HMPB באמצעות מאגר הרכבה ברינקלי (BRB) 80 (80 מ"מ צינורות, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ Egta, pH 6.8), ואחריו הבהרת התערובת הנקיה על ידי תפרידו ב 79,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
    7. . תאסוף את הסופרנטאנט למדוד את הספיגה 280 ננומטר עם ספקטרומטר. לקבוע את הריכוז טובולין באמצעות חוק בירה-למברט (מקדם הכחדה של טובולין: 1.15 (mg/mL)-1ס"מ-1)37,38.
    8. אחסן את החלבון ב-80 ° c.
  2. מיחזור מחזור (השתנה מקאזולדי ואח '36).
    הערה: כדי לשפר את הטוהר הטובולין, הטובולין הטהורה הינה פולימנית ומדהרת שוב.
    1. פולימלזציה MTs על ידי ערבוב טובולין מטוהרים (שלב 1.1.7) עם 500 μM dithio, (DTT) ו 20 μM GTP, ואחריו 30 דקות של דגירה ב 37 ° c.
    2. לסדר את התחת של MTs.
      1. טען 1 מ ל של כרית גליצרול (80 מ"מ צינורות, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 60% v/v הגליצרול, pH 6.8) בחלק התחתון של צינורית צנטריפוגה.
      2. הניחו את ה-MTs הפולימריות על גבי הכרית.
      3. צנטריפוגה ב 172,000 x g עבור 90 דקות ב 37 ° c.
    3. . בסדר.
      1. . הסר את הסופרנטאנט ואת הכרית
      2. השהה מחדש כל גלולה MT ב-150 μL של 4 מאגר מעלות צלזיוס (M2B: 80 מ"מ צינורות, 2 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ Egta, pH 6.8).
      3. מודקון את התערובת על הקרח 30 דקות.
      4. מתפרעים את התערובת עם טיפ פיפטה כל 5 דקות. . התערובת אמורה לפנות
    4. הבהרת התערובת על-ידי תפרידו ב-172,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
    5. . תאסוף את הסופרנטאנט למדוד את ריכוז החלבון. חנות ב-80 ° c.
  3. סמן את הטובולין עם צבע פלורסנט39.
    1. לערבב את MTs. מערבבים את טובולין מטוהרים (צעד 1.1.7) עם 500 μM DTT ו 16.7 μM GTP, ו מודרט את התערובת ב 37 ° צ' עבור 30 דקות.
    2. לסדר את התחת של MTs.
      1. מקום 1 מ ל של 37 ° c כרית גבוה pH (0.1 M NaHEPES, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 60% v/v הגליצרול, pH 8.6) לתוך צינור צנטריפוגה.
      2. הניחו את ה-MTs הפילמור על הכרית.
      3. צנטריפוגה ב 327,000 x g עבור 50 דקות ב 37 ° c.
    3. . טובולין תווית
      1. השהה מחדש כל גלולה MT עם 700 μL של 37 מאגר תיוג ° c (0.1 M NaHEPES, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 40% v/v הגליצרול, pH 8.6).
      2. מערבבים את ההשעיה עם 10 – 20 העודפים טוחנת של צבע פלורסנט הרחוק-אדום מתפקד עם אסתר סוכות.
      3. מודאת התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות בחושך כדי לאפשר MTs להגיב עם אסתר של צבע פלורסנט.
      4. הפסיקו את תגובת התיוג על ידי השבת אסתר של הצבע השעיית עם 50 mM K-גלוטמט, המסטורסת עבור 5 דקות ב 37 ° c.
    4. גלולה MTs שכותרתו: חזור על השלב 1.3.2, החלפת כרית גבוהה pH עם כרית נמוכה pH (80 מ"מ צינורות, 2 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 60% v/v גליצרול, pH 6.8).
    5. . הוראות מסוימות
      1. השמט את הסופרנטאנט ואת הכרית.
      2. השהה מחדש את הגלולה ב-700 μL של 4 ° c M2B.
      3. . שמתי את ההשעיה על הקרח
      4. מתפרעים כל 5 דקות עם טיפ פיפטה עד הפתרון ברור.
    6. להבהיר את הפתרון הנקי על ידי תפרידו ב 184,000 x g ו 4 ° צ' עבור 35 min.
    7. שפר את הטוהר של פתרון טובולין שכותרתו באמצעות שלבים חוזרים 1.2.1 – 1.2.4.
    8. למדוד את הריכוז של חלבונים וצבען פלורסנט. השתמש במידות אלה כדי לקבוע את הריכוז הטובולין והשברים של טובולין המסומנות בתווית, המוגדרים כיחס של ריכוזים של צבע פלורסנט לטובולין.
    9. אחסן את הפתרון הטובולין בתווית ב-80 ° c.
  4. פולימל MTs (אומץ מתוך סאנצ'ס ואח '19):
    1. לערבב את טובולין ממוחזר (צעד 1.2.5) עם התווית טובולין (צעד 1.3.9) ביחס התשואות 3% התווית טובולין שבר.
    2. לערבב את 8 מ"ג/mL טובולין תערובת עם 1 מ"מ DTT ו 0.6 mM guanosine-5 ' [(α, β)-מתיונין] triphosphate (GMPCPP), ואחריו 30 דקות של דגירה ב 37 ° c.
    3. לאחר הדגירה, לספח את MTs בטמפרטורת החדר בחושך עבור 6 ה.
    4. מחלקים ומאחסנים ב80 ° c.

2. סנתז קיסין אשכולות

הערה: חיידקים קיימים אוביקווינביים ויכולים לצמוח בתקשורת ולזהם את תהליך ההכנה. כדי למנוע זיהום, פעולות הקשורות במגע עם תרביות תאים (למשל, ליטוף) חייב להתבצע ליד להבה. כלים כגון מבחנות, פיפטות, טיפים, מדיה, וצלחות חייב להיות באופן אוטומטי לפני השימוש.

  1. מנועי אקספרס מוטורס. באסאנכיה קולי40
    1. . הפוך את התאים
      1. פיפטה 1 μL של K401-BCCP-בH6 פלבאמצע לתוך 10 μL של תאים המוסמכים.
      2. מודקון על הקרח עבור 5 דקות.
      3. הלם חום ב 42.5 ° c עבור 45 s.
      4. דגירה את התאים על הקרח עבור 2 דקות כדי לאפשר התאוששות.
      5. מערבבים את התאים עם 300 μL של אנטיביוטיקה חינם 2XYT (5 g/L ' ליטר, 10 g/L לחלץ שמרים, 16 g/L טריטונה).
      6. מודג את התאים בשעה 37 ° צלזיוס בשביל 1 h.
        הערה: אם לא צוין, מעקב אחר צמיחת התאים אינו נדרש במהלך הדגירה.
    2. . מדיית לוחית רישוי
      1. הפיצו את תרבות התא על צלחת 2XYT (10 גרם/L, 5 g/L לחלץ שמרים, 10 גרם/L טריטונה, 15 g/L אגר, 100 μg/mL אמפיצילין, 25 μg/mL כלוראמננול).
      2. מודקת את הצלחת הפוך ב 37 ° c בלילה.
    3. . לחסן מדיה נוזלית
      1. מלוחית הלילה, בציר מושבה מבודדת אחת עם טיפ של פיפטה.
      2. הוצא את הקצה לתוך בקבוקון המכיל 50 mL של 2XYT.
      3. דגירה ולנער את התקשורת התרבותית ב 37 ° c ו 200 סל ד עבור 12 – 16 h.
    4. הרחיבו את התאים.
      1. מערבבים 2.5 mL של תרבות התא ב 500 מ ל 2XYT.
      2. דגירה ולנער את התרבות 500 mL ב 37 ° צ' ו 250 rpm עבור 3 – 6 h.
    5. . לגרום לביטוי חלבון
      1. במהלך הדגירה, לפקח על צמיחת התאים על ידי מדידת ספיגה ב 600 ננומטר, באמצעות 2XYT כהפניה. למדוד את ספיגת כל 60 דקות, עד שהוא מגיע OD600 = 0.3. ואז למדוד את ספיגת כל 30 דקות עד שהוא מגיע 0.5 – 0.6.
      2. הניחו לתאים לצמוח עד שהספיגה תגיע ל-OD600 = 0.5 – 0.6
      3. הוסף 24 μg/mL ביוטין ו 1 מ"מ איזופרופיל β-D-1-הביויוגלפיטוןסייד (iptg) לתרבות התא.
        הערה: iptg משמש כדי לגרום חלבון ביטוי של מנועי קינזין, אשר מתויגים עם ביוטין קרבוקסילי הנושא חלבון (bccp) ו שישה היסטיסיזה (H6). תג H6 משמש בתהליך הטיהור (שלב 2.2), בעוד BCCP ס נקשר למולקולות הביוטין שנוספו לbiotinylate שעה מנועים מבוטא.
      4. דגירה ולנער את תרבות התא ב 20 ° צ' ו 250 סל ד עבור 12 – 20 h.
    6. לקצור את התאים על ידי תפרידו ב 5,000 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. אחסן את כדורי התא ב-80 ° c.
  2. לטהר את החלבון המוטורי (השתנה מ-מספרינאסטסבאך ואח '41):
    1. להשעות את הגלולה תא (שלב 2.1.6) עם נפח שווה של מאגר הליזה (50 מ"מ צינורות, 4 מ"מ MgCl2, 50 ΜM ATP, 10 מ"מ 2-mercaptoethanol (βME), 20 מ"מ סרפידול, pH 7.2), ואחריו הוספת טבליה אחת של פרוטאז מעכבי, 2 מ ג של פנילמתיל פקסיל פלווריד (PMSF), ו 2 מ ג של lysozyme.
    2. Lyse את התאים על ידי הקפאת פלאש בחנקן נוזלי (LN) 3x ולהתאים את תערובת התא.
      הערה: לאחר הלישר, התערובת צריכה להיות צמיגה.
    3. הבהרת תערובת התאים התפרידו ב-230,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
    4. לאסוף את הסופרנטאנט ולהזרים אותו דרך עמוד הכבידה, ואחריו שטיפת הטור עם 10 מ ל של מאגר לפירוק.
      הערה: חלבונים בעלי תג H6, כגון קינזין K401-bccp-H6, צריכים להישאר בטור.
    5. להתחמק חלבון מתויג עם 5 מ ל של מאגר הימנעות (50 מ"מ צינורות, 4 מ"מ MgCl2, 50 ΜM ATP, 500 מ"מ ושנדוראזול, pH 7.2). לאסוף את הזרימה ברציפות בשברים 1 mL. כדי לקבוע את החלבון המכיל שברים, לערבב 3 μL של כל שבר עם 100 μL של צבע triphenylmethane. השברים המכילים חלבונים אמורים להפוך לכחולים. לשלב שברים אלה לדלל ידי 5x עם מאגר לפירוק.
    6. . רכזו את פתרון החלבון
      1. טען את הפתרון בשפופרת מסנן צנטריפוגלי.
      2. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
      3. טלטל את השפופרת בעדינות והצנטריפוגה שוב עד שנפח הפתרון הוא < 3 מ ל.
    7. למדוד את ריכוז החלבון עם ספקטרומטר (מקדם הכחדה: 0.549 (mg/mL)-1ס"מ-1)42,43. לדלל את החלבון 1 מ"ג/mL תוך הוספת 35% w/v סוכרוז.
    8. חנות ב-80 ° c.
  3. למדוד את הריכוזים של קינסין עם ג'ל אלקטרופורזה (שונה מטיילור ואח '.44).
    הערה: כדי למדוד את הריכוז של קינאסין עם ג'ל לאלקטרופורזה, טובולין הוא סולם ריכוז אידיאלי בשל הטוהר הגבוה שלה והריכוז המדידה שלה באמצעות ספקטרומטר (איור 2א)36.
    1. להכין דגימות טובולין עם ריכוזים של 0.25, 0.5, 0.75, 1.00, ו 1.25 mg/mL. מערבבים 15 μl של כל מדגם טובולין ו קינזין מדגם (שלב 2.2.8) בנפרד עם 5 μl של מאגר לדוגמה (200 mm טריס-HCl, 8% נתרן dodecyl סולפט (sds), 400 mm dtt, 0.2% ברומאופנול כחול, 40% גליצרול, pH 6.8) ו-דגירה ב 90 ° c עבור 3 דקות
    2. . הכן את האלקטרופורזה
      1. לנעול ג'ל אלקטרופורזה לתוך תיבת ג'ל.
      2. למלא את התיבה עם הפעלת מאגר (50 מ"מ מגבים, 50 mM בסיס טריס, 0.1% SDS, 1 מ"מ מילימטר החומצה (EDTA), pH 7.7).
        הערה: ודא שרמת המאגר מעל הפתיחה העליונה של הג.
    3. טען 10 μl של סולם סטנדרטי חלבון, דגימות טובולין, ו קינזין לדוגמה לתוך בארות נפרדות ולהחיל 200 V על פני ג'ל עבור 45 דקות.
    4. . מכתים ג'ל
      1. דגירה וסלע ג'ל עם מבושלים (כ 95 ° c) פתרון כתם A (0.5 g/L triphenylmethane לצבוע, 10% v/v חומצה אצטית, 25% איזופנול) עבור 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הג'ל עם מים מאוהים (DI).
      2. חזור עם פתרונות הכתם B (0.05 g/L triphenylmethane לצבוע, 10% v/v מתאן חומצה אצטית, 10% איזופנול), C (0.02 g/L triphenylmethane לצבוע, 10% v/v חומצה אצטית), ו D (10% v/v חומצה אצטית), ברצף. ומטלטל את הג. במים בלילה
    5. . תסרוק את הג המירו את תמונת הג לתמונה בגווני אפור, ואחריה היפוך שחור-לבן ושיפור ניגודיות לחשיפת להקות חלבון בהירות ברקע השחור.
    6. למדוד את הבהירות של כל רצועה על-ידי סיכום ערכי הפיקסלים. החל את ההתאמה הליניארית C = aB + b, כאשר b הוא הבהירות של להקה טובולין, C היא הריכוז המתאים, ו-b ו- ב' הם פרמטרים מתאימים . לקבוע את הריכוז של קינסין Ck באמצעות בהירות של קינזין להקה Bk כדי לחשב את המשוואה הלינארית: Ck = aBk + B.
  4. מקבץ את מנועי מנועים.
    1. מערבבים 1.5 μm קינזין (שלב 2.2.8) עם 120 μm dtt ו 120 ננומטר streptavidin. . מודקון על קרח במשך 30 דקות
    2. חנות ב-80 ° c.

3. הכנת מגלשות זכוכית מצופות פוליאקרילאמיד וכיסוי (השתנה מלאו ואח '45)

  1. טען שקופיות זכוכית חדשות ושמיכות זכוכית במיכלים המתאימים. יש לטבול את השקופיות והכיסויים בתכשיר ניקוי של 1% v/v במים די ולאחר מכן להרתיח את המים במיקרוגל.
  2. Sonicate את השקופיות ואת coverslips עבור 5 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים DI כדי להסיר כביסה.
  3. לטבול ולsonicate את השקופיות ואת coverslips באתנול עבור 5 דקות. לשטוף עם מים DI.
  4. לטבול ולsonicate את השקופיות ואת coverslips ב 100 מ"מ אשלגן הידרוקסיד (KOH) עבור 5 דקות. לשטוף עם מים DI.
  5. מארג השקופיות ואת coverslips פתרון silane (1% חומצה אצטית ו 0.5% 3-(trimethoxysilyl) פרופיל מתיונין ב אתנול) עבור 15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם די מים.
  6. מודדאת השקופיות והכיסויים בתמיסה אקרילאמיד (2% w/w אקרילאמיד, 0.7 mg/mL אמוניום פרסולפט, ו 0.0035% v/v הטטרמתילתיפילואמין ב די מים) עבור ≥ 3 h.
  7. אחסן את השקופיות והכיסויים בתמיסה האקרילמיד.

4. מכינים בעלי נוזלים פעילים מבוססי MT

  1. הכינו נוזלים פעילים (ששונו מ-סאנצ'ס et al.19).
    הערה: השלבים הבאים מדגימים את התהליך של הכנת 100 μL של נוזל פעיל באמצעות מניות לדוגמה. אמצעי האחסון הסופי מדרגי, והריכוזים של המניות לדוגמה ניתנים להתאמה כל עוד הריכוז הסופי של כל רכיב נשמר.
    1. מערבבים 16.7 μL של 8 מ"ג/mL MTs (שלב 1.4.4) עם 6.7 μL של 1.8 μM קיסין אשכולות מוטוריים (שלב 2.4.2), ו1.1 μL של 500 mM DTT ב-high-salt M2B (M2B + 3.9 mM MgCl2).
    2. צרור MTs על ידי הוספת 11.4 μL של 7% w/w פוליאתילן גליקול (פג).
    3. הפעל מנועי קינזין על ידי הוספת 2.8 μl של 50 mM ATP.
    4. שמור על ריכוזי ה-ATP על ידי הוספת 2.8 μL של פירובט במלאי קינאז/לקטט דהידרוגנאז (PK/LDH) ו 13.3 μL של 200 mM פוספנול פירובט (פפ).
    5. להפחית את האפקט photobleaching לבנת ידי הוספת 10 μL של 20 מ"מ טרולקס, 1.1 μL של 3.5 mg/mL קטלאז, 1.1 μL של 20 מ"ג/mL גלוקוז אוקסידאז, ו1.1 μL של 300 mg/mL גלוקוז.
    6. מעקב אחר התנועה של הנוזל על ידי הוספת 1.6 μL של 0.025% v/v חלקיקים מעקב.
    7. הוסף גבוהה-M2B מלח כדי להשיג נפח כולל של 100 μL.
      הערה: הזמנות ערבוב בשלבים 4.1.1 – 4.1.6 הם להחלפה. עם זאת, פעם ATP, MTs, ואת המנועים מעורבים, המנועים מתחילים לצרוך ATP תוך כדי צועד לאורך MTs. המדגם מופעל עם חיים סופיים בשל דלקים מוגבלים (ATP ו-פפ), כך הניסוי צריך להיות החל מיד. הנוזל הפעיל הסופי צריך להכיל 1.3 mg/mL MT, 120 ננומטר קינב אשכולות מוטוריים, 5.5 mM DTT, 0.8% w/w פג, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM פפ, 2 מ"מ טרולקס, 0.038 mg/mL, 0.22 mg/mL גלוקוז אוקסידאז, 3.3 mg/ml גלוקוז, ו 0.0004% v/v קולואיד ב גבוהה מלח M2B.
  2. הכינו דוגמא בערוץ זרימה (השתנה מצ'נדקאר ואח '46):
    1. לשטוף שקופית זכוכית פוליאקרילמיד-מצופה כיסוי (שלב 3.7) עם מים DI. . ייבש את המשקפיים באוויר מניחים על משטח נקי ושטוח.
    2. חותכים שתי רצועות של סרטי שעווה עם רוחב 3 מ"מ באותו אורך כמו שמיכות זכוכית (20 מ"מ). הכנס את הרצועות בין השקופית לבין הכיסויים כמרחב הערוצים.
    3. לדבוק את הזכוכית לסרט שעווה על ידי הצבת מתחם שעווה זכוכית על 80 ° c הצלחת חם כדי להמיס את השעווה. במהלך ההיתוך, לחץ על הcoverslip בעדינות עם קצה הפיפטה כדי לדבוק בצורה אחידה את סרט השעווה למשטח הזכוכית. לאחר הדבקה, מצננים את מתחם הזכוכית לטמפרטורת החדר.
    4. טען את הנוזלים הפעילים (שלב 4.1) לערוץ הזרימה. . אטום את הערוץ עם דבק אולטרא-סגול

5. שליטה בטמפרטורה לדוגמה

  1. לבנות התקנה בקרת טמפרטורה (שונה מעיצובים ב lowensohn ואח ' ו-Wu et al.47,48,49).
    1. הכן בלוק קירור מאלומיניום.
      1. מיל צלחת אלומיניום עם מימדים של כ 30 מ"מ × 30 מ"מ × 5 מ"מ.
      2. מקדחה ערוץ פנימי דרך הצלחת (איור 3A) ולהתקין אביזרי צינור בקצוות הערוץ.
      3. . התחברו כל התאמה לצינור מים
      4. חבר צינורית אחת למיכל דגים במיכל מים תוך הארכת הצינור השני אל המאגר.
        הערה: המשאבה להפיץ את המים במאגר דרך הצינורות הפנימיים אלומיניום כדי לשמור על טמפרטורת הבלוק בערך בטמפרטורת החדר.
    2. האזנה לצידנית תרמואלקטריים (TEC) וחיישן תרמואלקטרי לבקר טמפרטורה. חבר את הבקר למחשב באמצעות יציאת USB (איור 3ב).
    3. הגדר את בקר הטמפרטורה לספק כוח נוכחי (DC) ישיר. הפעל את הבקר על-ידי חיבור ספק הזרם לשקע חשמל.
    4. בצע את ההגדרה הראשונית של ה-TEC לאחר המדריך של יצרן הקונטרולר. בדוק את פלט ה-TEC. מומלץ לשלוט בבקר הטמפרטורה באמצעות תוכנה שסופקו על-ידי יצרן, המאפשר הקלטת נתונים תרמוחיישן ומניפולציה קלה יותר של בקר הטמפרטורה.
    5. זהה את צדי החימום והקירור של ה-TEC.
    6. חבר את צד הקירור של TEC אל בלוק הקירור (שלב 5.1.1) באמצעות הדבקה תרמית.
    7. הצמד דיסק ספיר לצד החימום של TEC באמצעות הדבקה תרמית.
    8. . הכיוונון הושלם משטח ספיר ו תרמוחיישן יכול ליצור קשר עם מדגם להתקרר ולחמם את המדגם בהתבסס על הטמפרטורה שלה ואת טמפרטורת היעד.
      הערה: מומלץ לחסום את ה-TEC והקירור באמצעות חור מרכזי מיושר לדימות הדגימות בעזרת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 3ג).
  2. השתמש בכיוונון בקרת הטמפרטורה כדי לשלוט בטמפרטורת המדגם33.
    1. הבהר את המדגם לכיוונון.
      1. מניחים את מדגם הנוזל הפעיל (שלב 4.2.4) על משטח הספיר עם צד השקופית פונה למשטח.
      2. אבטחו את מגלשת הזכוכית. עם נייר דבק
      3. הצמד את החיישן התרמותרמי למשטח הכיסויים באמצעות קלטת נחושת.
    2. הר הכיוונון על במת מיקרוסקופ עם צד שמיכות פונה לעבר היעדים. לדוגמה, על מיקרוסקופ הפוך, הצד שמיכות צריך להתמודד כלפי מטה. אבטח את ההתקנה בנייר דבק ומהדק מיקרוסקופ בשלב המחט אם ישים.
      הערה: שלב הטמפרטורה המוצגת אמור לעבוד עם מיקרוסקופים נפוצים הפוכים או ישרים. כדי להבטיח ששלב הטמפרטורה לא יועבר במהלך הניסוי, מוטב לאבטח את שלב הטמפרטורה לשלב המיקרוסקופ עם הקלטת.
    3. שלוט בטמפרטורת המדגם.
      1. הפעל את בקר הטמפרטורה ואת משאבת טנק הדגים.
      2. בצע את המדריך של היצרן כדי להגדיר את טמפרטורת היעד ולאפשר בקרת טמפרטורה. הבקר יתאים את כוח החימום או קירור המבוסס על טמפרטורת היעד והטמפרטורה לדוגמה, כפי שמוערך על ידי החיישן התרמותרמי.
    4. הקלט טמפרטורות לדוגמה.
      1. בצע את המדריך של היצרן כדי להקליט נתוני טמפרטורה תרמית במהלך הניסוי.
        הערה: הטמפרטורה המדגם צריכה להיות נשלטת על ידי הבקר ונרשם על ידי המחשב (איור 3ד).

6. אפיון פעילות הנוזלים הפעילה (השונה מהשיטות של חנקין ואח ' ו-וו et al.20,27)

הערה: הסעיפים הקודמים משמשים להכנת דגימות נוזל פעילות (סעיפים 1 – 4) ושליטה בטמפרטורה שלהם (סעיף 5). כדי להדגים את השימוש בטמפרטורה כדי לשלוט בפעילות הנוזלית הפעילה, להתבונן בהתנהגויות הנוזלים, לנתח את פעילותם ולאפיין את התגובה שלהם לטמפרטורה.

  1. . מפקחים על המעקב
    1. תמונה המדגם עם מרווח קבוע Δt באמצעות חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ניאון כדי ללכוד את התנועה של חלקיקי מעקב.
      הערה: Δt יש לבחור כדי לאפשר מעקב אחר תנועת המעקב. ערכי Δt גדולים, כגון 100 s, מאבדים את מסלולי המעקב, ואילו ערכי Δt קצרים, כגון 0.1 s, מונעים מאלגוריתם המעקב לזהות את תנועת המעקב בין מסגרות. Δt עובד צריך לאפשר הזחה מעקב בין מסגרות להיות בתוך ~ 9 פיקסלים. עבור מנותבים הדמיה נע ב 10 μm/s באמצעות מטרה 4x, Δt מומלץ להיות 1 – 5 s.
    2. שמרו את התמונות כקובצי TIFF, קראו לקבצים המבוססים על מספר המסגרת ואחסנו אותם בתיקייה נפרדת. תהליכים אלה נחוצים כדי להבטיח כי התמונות שנרכשו ינותחו כראוי עם הסקריפט MATLAB שסופקו (שלב 6.2.2).
  2. מעקב אחר עוקבים אחר תוכנות המעקב שפותחו על ידי ouellette ואח '50,51):
    1. הורד את תוכנת המעקב של המעבדה למורכבות סביבתית, אוניברסיטת סטנפורד (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). ודא שכל קובץ MATLAB נמצא באותה תיקיה.
    2. עקוב אחר מעוקבים באמצעות קובץ script MATLAB מותאם אישית: particle_tracking. m. הסקריפט קורא תמונות מעקב (שלב 6.1) ועוקבת אחר תנועת המעקב באמצעות התוכנה של ouellette ואח '50,51. היא מפלטי שני קבצים: 1) רקע. tif, המייצג את רקע התמונה ו-2. מעקב. mat, המכיל את מסלולי החלקיקים והמהירויות בכל מסגרת (איור 4א).
  3. ניתוח מהירויות מעקב אחר המעקב באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית: ניתוח. m. ה-script קורא את קובץ המעקב (מעקב. mat) ומפיק הפלט של המהירות הממוצע של מאתר המשדרים לעומת הזמן, יחד עם מהירות ממוצע של זמן בממוצע עם ממוצע של windows (איור 4ב)33.
  4. הקלט את מהירות ממוצע הזמן בממוצע.
  5. מדידת מהירות ממוצע הזמן בממוצע על-ידי חזרה על הניסוי (שלבים 4, 5.2 ו-6.1 – 6.4) ב-10 – 40 ° c. להשתמש במהירויות ממוצע מוקלט להתוות את מהירות ממוצע לעומת טמפרטורה (איור 4ג)33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת מונחה-בסיס, MT מבוססי נוזלים פעילים מחייב הן קינזין ו MTs. MTs היו פולימנים מן הטובולים שכותרתו (שלבים 1.3 ו 1.4) כי היו מטוהרים מן המוח שור (שלב 1.1, איור 2א), ואחריו מיחזור כדי לשפר את טוהר (שלב 1.2, איור 2ב). החלבונים המוטוריים של קינסין הביעו ביטוי וטוהר מ -E. coli (שלבים 2.1 ו 2.2, איור 2B)41,52. הריכוז של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שליטה על החומר הפעיל באתרו פותח את הדלת כדי לביים ארגון עצמי של חומר פעיל4,5,24,28,54. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור שימוש בטמפרטורה כדי לשלוט kinesin מונחה, MT מבוססי נוזלים פעילים באתרו, מבוסס על המאפיין arrhenius של המערכת29,30,31. מכיוון שהמערכת מבוססת על חלב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלאממיד K401-בH6-במק הייתה מתנה מדוקטור זוונמיר דוכולינ. מחקר זה נתמך על ידי קרן ההפעלה של ד ר קון-טה וו במכון הפוליטכני של ווסטר. אנו מודים לד ר זוונמיר דויד עבור הפרוטוקולים לטיהור ולטובולין תוויות ולסנתז נוזלים פעילים. אנו אסירי תודה לד ר מארק ריגילה על המומחיות שלו בביטוי חלבונים וטיהור. אנו מודים לד ר ויליאם בנימין רוג'ר על שעזר לנו בבניית הבמה הנשלטת על-ידי טמפרטורה. אנו מכירים את ברנדייס MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) לשימוש במתקן החומרים הביולוגיים (BMF). אנו מכירים את האגודה המלכותית לכימיה על התאמת הנתונים מ Bate ואח '. על חומר רך33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(±)-6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-חומצה קרבוקסיליתסיגמא-אולדריץ'238813טרולוקס
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M6250
3-(טרימתוקסיליל)פרופיל מתאקרילט, 98%, ACROS Organicsפישר סיינטיפיקAC216550050
3.2 מ"מ תעודת זהות צינורות טיגון R-3603HACH2074038צינורות מים
בקוטר 31.75 מ"מ לא מצופה, חלון ספיראופטיקה אדמונד43-637דיסק ספיר
3M 1181 סרט נחושת - 1/2 אינץ' רוחב X 18 YD אורך - 2.6 מ"ל עובי כולל - 27551R.S. HUGHES054007-27551סרט נחושת
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ'A6283
תמיסת אקרילאמיד (40%/אלקטרופורזה), פישר ביו-ריאגנטיםפישר סיינטיפיקBP1402-1
אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיפוטסיום הידרטסיגמא-אולדריץ'A8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006צבע פלואורסצנטי אדום רחוק. ניתן להשעות מראש את Alexa 647 בדימתיל-סולפוקסיד (DMSO) לפני ערבוב עם מיקרו-צינורות (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 יחידת מסנן צנטריפוגליSigma-AldrichUFC801024צינור מסנן צנטריפוגלי. משקל מולקולרי חתוך: 10 kDa
אמוניום פרסולפט, 100 גרם, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
Ampicillin מלח נתרן (אבקה גבישית), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
Antivibration Table Nikon63-7590S
Avanti J-E צנטריפוגהבקמן קולטר369001
Bacto Agar סוכן מכירה, BD DiagnosticsVWR90000-760אגר
ביוטיןאלפא AesarA14207
דלי פלסטיק לבן - 2 ליטרBon84-715דלי מים
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'746495CaCl2
קטלאז מכבד בקרסיגמא-אולדריץ'C40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjניקוןMRD00045 4x אוויר אובייקטיבי
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372קוביית מסנן GFP
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5מצנן תרמו-אלקטרי (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
בלוק קירורN/AN/Aאלומיניום טחון בהתאמה אישית
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400צבע טריפניל-מתאן
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7528
דימתיל סולפוקסיד (מאושר ACS), פישר כימיקלפישר סיינטיפיקD128DMSO
DL-1,4-דיתיותרייטול, 99%, לביוכימיה, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 תרכובת גוף קירורDow1446622משחה תרמית
אתיל אלכוהול, 200 הוכחה ACS/USP/NF כיתה 5 ליטר פולי קובייהפארמקו מאת Greenfield Global111000200CB05אתנול
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטיתסיגמא-אולדריץ'E3889EGTA
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתסיגמא-אולדריץ'798681EDTA
Fisher BioReagent תוספי מדיה מיקרוביולוגיה: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents תוספי מדיה: תמצית שמריםFisher ScientificBP1422תמצית שמרים
Fluoresbrite YG Microspheres, דרגת כיול 3.00 ומיקרו; mPolysciences18861חלקיקי עוקב
גלוקוז אוקסידאז מ-Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
GpCppJena BioscienceNU-405Lגואנוזין-5'[ (α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 רגל, 99.9% נחושת נטולת חמצן תקועה OFC, אדום/שחור 2 מוליכים מלוכדים כבל רוכסן חשמל/רמקול כבל חשמל לרכב, אודיו, קולנוע ביתיאמזוןB07428NBCWחוט נחושת
גואנוזין 5'-טריפוספט נתרן מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'G8877GTP
Hellmanex IIIסיגמא-אולדריץ'Z805939חומר ניקוי
HEPES מלח נתרן (אבקה לבנה), פישר BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
מכונת בלנדר בעלת ביצועיםגבוהים AIMORESAS-UP1250
בלנדר שלו GraviTrapGE Healthcare11003399עמוד הכבידה
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758איזופרופיל &בטא;-D-1-תיוגלקטופירנוזיד
איזופרופיל אלכוהול 99%פארמקו מאת Greenfield Global231000099 איזופרופנול
JA-10 רוטורבקמן קולטר369687
L-חומצה גלוטמית אשלגן מלח מונוהידראטסיגמא-אולדריץ'G1501K-גלוטמט
ליזוזים מחלבון ביצת עוףSigma-AldrichL6876
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמא-אולדריץ'M2670MgCl2 ושור; מלח נתרן 6H2O
MESסיגמא-אולדריץ'M50572-(N-מורפולינו) חומצה אתנסולפונית מלח נתרן
MOPSסיגמא-אולדריץ'M12543-(N-מורפולינו) חומצה פרופנסולפונית
MP-3022TE טכנולוגיהMP-3022צמד תרמי
N,N,N',N'-טטרמתילאתילנדיאמין 99%, ACROS Organicsפישר סיינטיפיקAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS ספקטרופוטומטרתרמו פישר ספקטרומטר E112352 מדעיניקון
Ti2-E ניקון מיקרוסקופ הפוךניקוןMEA54000
נורלנד דבק אופטי 81מוצרינורלנד NOA81דבק UV
נובקס חד חלבון מוכתם מראש סטנדרטיתרמו פישר מדעיLC5800סולם סטנדרטי חלבון
NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס, 1.5 מ"מ, 10 בארותThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS ג'ל
אופטימה L-90K אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר365672
Parafilm PM996 עטיפה, רוחב 4 אינץ'; 125 רגל/גלילCole-ParmerEW-06720-40סרט שעווה
Pe 300 מערכת תאורה אולטרה פס יחיד, 3 מ"מ בקרת מדריך אור ספק כוח פודניקוןPE-300-UT-L-SB-40מגניב LED תאורה
פנילמתאן סולפוניל פלואורידסיגמא-אולדריץ'78830PMSF
חומצה פוספואנולפירובית מלח מונופוטסל, 99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (ברדפורד) ערכת בדיקת חלבוןתרמו פישר מדעי23200
פירס מעכב פרוטאז מיני טבליותתרמו פישר מדעיצינורות A32953
סיגמא-אולדריץ'P67571,4-פיפרזיןדיאטאנסולפונית חומצה
פלורונית F-127סיגמא-אולדריץ'P2443
פולי (אתילן גליקול)סיגמא-אולדריץ'81300PEG. משקל מולקולרי ממוצע 20,000
Da אשלגן הידרוקסיד (כדורים/ACS מוסמך), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W ספק כוח (115 VAC)ספק כוח ThermoFisher ScientificPS0300DC של קופסת הג'ל
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4Aספק כוח DC של בקר
הטמפרטורהאנזימי פירובט קינאז/לקטיק דהידרוגנאז משריר הארנבסיגמא-אולדריץ'P-0294PK/LDH
משאבת מזרקה אחת שקטה, 296 ליטר לשעהמשאבת מיכל דגיםשל אמזוןB005JWA612
רוזטה 2 (DE3) pLysS תאים מוכשרים - NovagenMillipore Sigma71403תאים מוכשרים
ZSMC0912BS מיקרוגל חד 900W תנור מיקרוגל משטח, 0.9 רגל מעוקב, נירוסטהאמזוןB01MT6JZMRמיקרוגל להרתחת המים
נתרן כלורי (גבישי/מוסמך ACS), פישר כימיקלפישר סיינטיפיקS271-500NaCl
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L3771SDS
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'S8282NaH2PO4
סטרפטווידין חלבוןתרמו פישר סיינטיפיק21122
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S7903
TC-720TE טכנולוגיהTC-720בקר טמפרטורה
Tris Base, דרגת ביולוגיה מולקולרית - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
סוג 45 רוטור Tiבקמן קולטר339160
סוג 70 רוטור Tiבקמן קולטר
רוטור 337922 מסוג 70.1 Tiבקמן קולטר342184
קלטת תיוג מעבדה לשימוש כללי VWR89097-916קלטות נייר
משקפי כיסוי מיקרו VWR, מרובעים, מס '1 1/2VWR48366-227כיסויי זכוכית
VWR שקופיות מיקרו רגילות וחלביות, שקופיות זכוכית פרימיוםVWR75799-268שקופיות זכוכית
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001קופסת ג'ל
ZYLA 5.5 USB3.0 מצלמהNikonZYLA5.5-USB3מונוכרום CCD מצלמה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002(2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102(2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114(2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375(2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470(2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688(2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1(2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246(2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564(2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486(2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601(2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037(2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102(2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142(2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102(2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333(1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006(2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304(2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microtubule Based Active FluidsKinesin Driven Flow ControlTemperature Tuning MethodFlow Speed RegulationActive Fluid PreparationFluorescent Microscopy ImagingTracer Particle TrackingTemperature Control SetupMicrofluidic Device DesignArrhenius Characteristic Analysis

מאמרים קשורים