כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) משמש רבות לניטור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזילוגיים בתוך הדירוג הvivo של הגיוס הלוקואני. הפרוטוקול הנוכחי מייצג שיטה מעשית ומנויית כדי להמחיש את האינטראקציה האנדוקובית לוקיציט המובילה לגיוס לוקיציט ברקמת שריר השלד בתוך האורגניזם השלם של העכבר. המודל ישים לכל תחומי המחקר המתמקדים בהפעלת גרנולוציט ותפקידם במחלות.
אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול להנחות דרך השיטה ולהדגיש מלכודות פוטנציאליות וקשיים טכניים. הפרוטוקול מכסה את ההיבטים הבאים: הגדרות ניסיוני וחומר נדרש, הרדמה של העכבר, חיתוך של שריר cremaster, כמו גם הקנה הנשימה והעורק הראשי, הקלטות IVM וניתוח לא מקוון. תבניות נתונים כמו לוקיציטים מדומה, שטף מתגלגל (RF) ושבר שטף מתגלגל (RFF) מוסברים בפירוט ויישומים מתאימים נדונים. תוצאות הנציג מעכברים mdx לקוי הדיסטרופין מסופקים בסעיף התוצאות.
IVM הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך גיוס לוקיציט ב vivo הגדרה; עם זאת, התיחום למשל לפונקציה אנדותל ולוקיציט עשוי לדרוש שילוב עם הגדרות vivo ex כמו ניסויים בתאי הזרימה. יתרה מזאת, הרקע הגנטי של בעלי העניין עשוי להשפיע במידה ניכרת על גיוס בסיסי, המחייב כוונון משובח של הפרוטוקול המסופק. למרות המגבלות שלה, IVM עשוי לשמש פלטפורמה לתרגם בקלות ממצאים בעלי מבחנה מחוץ לאורגניזם חי בעלי חוליות.
מבוא
מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) הוא כלי מיושם נפוץ בתחום הביולוגיה הלוקוציט. גיוס לוקיציט מלווה במפל של אירועים מוגדרים היטב, שיזמו לכידת הלוקוציט, גלגול והדבקה לקיר האנדותל, ולבסוף העברת הגירה והעברה של לוקיציטים לאתר בפועל של דלקת1. כל צעד מתווך ונשלט על ידי נוגדנים שונים (למשל, IL-8/CXCL8), קולטנים (g., lfa-1, Mac-1) ומולקולות הדבקה של תא אנדותל המקביל (g., icam-1, vcam-1 ו-e-selectin)2,3. האינטראקציה של אתרים רגולאטורים שונים, מקדמי שליטה ומגשרים של גיוס לוקיציט מדורגים כמו קולטן של מוצרים מתקדמים לסוף גליקטיון (זעם), מולקולה הדבקה משולבת 1 (icam -1), c-X-c מוטיב ליגנד (cxcl) 1/2 והקולטן של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי חיים היו תחת מבוקרת וספציפי התנאים ללא הפתוגן בבית IBF (ביופקולטציזיסיאיסמליסספיאדיבאיזשיונגאבריסגריסיוריסיימאנטאינטונג), חאידלברג. כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על-ידי ה-IRB המקומי והרגראשיפראססרוסיה קרלסרוהה, באדן-Wuerttemberg, גרמניה.
1. מינהל הרדמה
- מורדם העכבר על ידי הזרקת הצפק (כיתה) הזרקה של 125 מ"ג/ק"ג ו 12.5 מ"ג/ק"ג xylazine.
- מקום ולתקן את העכבר בתנוחה שכיבה על גבי משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר (36.5-38 ° c). השתמש בתפר סטרילי שאינו נספג (6/0) לרוח לולאה פשוטה סביב השיניים המצח והקלטת את החיבור של התפר למשטח החימום. קיבעון זה נועד לשמור על הפה פתוח כדי למנוע הפרעה בנשימה.
- בדוק את ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
IVM לפי הפרוטוקול המסופק תניב תובנות ייחודיות לתוך המפל של גיוס לוקיציט שריר השלד. סעיף התוצאות יתמקד בתוצאות אופייניות המתקבלות על-ידי IVM וידגיש בעיות פוטנציאליות שעלולות להיתקל בהן.
התוכנית הניסיונית למיקרוסקופיה הינה מחולקת באיור 1. הכנת שריר cremaster והסרת רקמת החיבור חיונית כדי להשיג תמונות מיקרוסקופיים ממוקדת עם משטח אחיד. רקמת חיבור עודפת מובילה בסופו של דבר לתמונות מיקרוסקופיים מטושטשות (וידאו משלים 1) בעת ביצוע ivm.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
IVM כשיטה נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד סוגים שונים של תאים באיברים שונים ותיאר בהרחבה ודנו19. המטרה העיקרית של מחקר זה היא לספק גישה יעילה להגדיר ולבצע IVM בשריר cremaster. תרגול השיטה יפיק תוצאות אמינות ומיוצרות. לפיכך, תכנון וסטנדרטיזציה הם גורמי מפתח לשלוט בטכניקה. מעל לכל, הטכניקה תלויה מאוד פרמטרים הומודינמיים ומיקרוכלי דם, אשר צריך להיות מפוקח בקפדנות ונשלט עבור. ככזה, הומודינמיקה שונה בין קבוצות תניב תוצאות מטעה.
למרות תפקידה בחקר התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים, IV.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר זה היה נתמך על ידי הממשלה הפדרלית הגרמני של החינוך והמחקר (BMBF) 01GL1746E כחלק הקונסורציום הראשוני. המחברים מכירים ברטה הירמן וסילביה Pezer לקבלת סיוע טכני מיומן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרי | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | הרדמה. גנרי / IUPAC שם: קטמין |
| קסילזין | CP-Pharma GmbH | מאמר-מס': 1205 | הרדמה. שם גנרי / IUPAC: קסילזין (בצורת הידרוכלוריד) |
| תמיסת מלח | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | הכנה כירורגית. גנרי / IUPAC שם: מחט מזרק נתרן כלורי |
| Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | הכנה כירורגית |
| תפר 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | תכשיר כירורגי |
| שפופרת פוליאתילן #10 | BD GmbH | ספק מס' 427401 | תכשירים כירורגיים |
| צינור פוליאתילן #90 | BD GmbH | ספק מס' 427421 | תכשירים כירורגיים |
| רודמין 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | מספר CAS 989-38-8 | צביעת לויקוציטים. שם גנרי / IUPAC: אתיל 2-[3-(אתיל-אמינו)-6-אתילימינו-2,7-דימתילקסנטן-9-יל]בנזואט |
| <ציוד התקנה חזק> | |||
| זקוף | אולימפוס | מיקרוסקופיה | BX51W1 |
| אובייקטיבית פי 40 | Zeiss | Achroplan 40 & times; /0.80 W | מיקרוסקופיה |
| ImSpector תוכנה | Lavision Biotec GmbH | גרסה 4.0.469 | תוכנה |
| ImageJ | המכון הלאומי לבריאות, ארה"ב | גרסה 1.51j8 | תוכנה |
מקורות
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
