מאמר שיטה

הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

DOI:

10.3791/60517

⸱

10 באפריל 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים גראם שליליים מייצרים שתי ממברנות בעלי הפרדה. הקרום החיצוני מחולק מהקרום הפנימי על ידי פריפלמטר ושכבת פטיפדוגליקן. היכולת לבודד את הbilayers כפול של חיידקים אלה היה קריטי להבנת הפיזיולוגיה שלהם פתוגנזה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו פועלת על ידי חלוקת המעטפה של חיידקים גראם שליליים לתוך הכולל, פנימי, הקרום החיצוני (OM) שברים מסכם עם בחני להעריך את הטוהר של bilayers. לאום יש צפיפות כוללת מוגברת לעומת הקרום הפנימי, בעיקר בשל נוכחות של lipooligosaccharides (לוס) וליפופוליסכלידיס (LPS) בתוך העלון החיצוני. לוס ו LPS המולקולות הם אמפיפתיים גליקולפידים כי יש מבנה דומה, אשר מורכב השומנים-disaccharolipid ו-core-oligosaccharide מתמיר. עם זאת, רק מולקולות LPS מעוטרים עם יחידת משנה שלישית המכונה O-רב-סוכר, או O-אנטיגן. הסוג והכמות של גליקולפידים הנוכחיים ישפיעו על צפיפות ה-OM של האורגניזם. לכן, בדקנו אם הקרומים של חיידקים עם תוכן גליקולפיד מגוון יכול להיות מבודד באופן דומה באמצעות הטכניקה שלנו. עבור האורגניזמים המייצרים LPS, סלמונלה בידור מסוג Typhimurium ואסאנכיה קולי, הקרומים היו מבודדים בקלות ו lps O-אנטיגן moiety לא השפעה על החלוקה bilayer. הביטוח העצמי מייצרת מולקולות לוס אנג'לס, אשר יש מסה דומה למולקולות lps לקויה של O-אנטיגן; עם זאת, הקרומים של חיידקים אלה לא יכלו בתחילה להיות מופרדים. החלטנו שהאום של המוסד לביטוח העצמי היה פחות צפוף מזה של באנקובאכריים, ולכן הכוונן את מעבר הסוכות והקרומים היו מבודדים. הטכניקה יכולה אפוא להיות מותאם ושונה לשימוש עם אורגניזמים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים גראם שליליים לייצר שתי ממברנות כי הם מופרדים על ידי החלל הפריפלזמית והתא התאים פפטידוגליקן1. הממברנה הפנימית (IM) מנתיקים את הציטוזול והוא מהווה בינה סימטרית של פוספוליפידים. Peptidoglycan יכול להגן מפני לחץ טורגור ומספק את החיידק עם צורה תא, והוא מחובר הקרום החיצוני (אום) על ידי ליפופרוטאינים2,3. ה-OM מקיף את הפריפלמטר והוא ברובו אסימטרית. העלון הפנימי מורכב מפוספוליפידים והעלעל החיצוני כולל גליקולפידים המוכרים כ-lipooligosaccharides (LOS) או ליפופוליסכדים (lps)4,5. א-סימטריה השומנים וביוכימיה של מולקולות לוס/lps בעלון ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ריאגנטים כללי ומדיה הכנה לכריית ממברנה

  1. מדיה הצמיחה חיידקים: להכין ולחטא 1 L של התקשורת מרק ב ניקוי ביסודיות ובקבוקון 2 L.
  2. מאגר הבולם הכללי (1 מאגר טריס pH 7.5; 50 mL): התמוססות 6.05 g של בסיס Tris ב 30 מ ל של H2O. כוונן את ה-pH כדי 7.5 עם הHCl 5 מ '. כוונן את הנפח הסופי ל-50 ML עם H2O באולטרסאונד.
  3. מלאי מאסטר של פתרון לקטיון דיאונטי (0.5 M EDTA pH 8; 100 mL): להוסיף 18.6 g של divalent אתילן טטראצטט · 2H2O כדי 80 ML של H2O. מערבבים במרץ והתאם את ה-PH ל8.0 עם naoh. כוונן את אמצעי האחסון הסופי ל-100 mL עם H2O באלקטרופורזה.
    הערה: מלח ניתרן של edta לא להתמוסס עד pH של....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו מספקת אמצעים יעילים כדי לבודד את IMs ו-OMs עבור חיידקים גראם שליליים. קו מיתאר של ההליך כולו מומחש (איור 1). באופן כללי, נורמליזציה של תרבויות ל-OD600 של 0.6-0.8 ב 1 L של אמצעי תקשורת, או קציר בין 6.0 ו 8.0 x 1011 תאים חיידקיים יבטיחו כי הכמות המתאימה של חומר ממברנה נאסף עבור הפרדת הבאים.

עם לאחר לשיר את החיידקים ומדרבן את ליפוסט, גלולה חום דביק כולל הקרום יהיה גלוי בחלק התחתון של צינור ultracentrifuge. לאחר הגירוד, הומוגניזציה, ומע.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו תמשיך לסייע לחוקרים להבין את התפקיד של מעטפת התא בפיזיולוגיה חיידקי ופתוגנזה. לאחר השלבים הרציפים של שלבים מטוהרים הכולל, הפנימי, ו-OM ניתן להשיג. ממברנות אלה יכולים להיות מותקפים בבידוד כדי לבדוק השערות הקשורות לוקליזציה של חלבון ממברנה ותפקוד, הובלה וסחר ברחבי הפריפלמטר, ואת הרכב של bilayers הפרט בתנאים סביבתיים שונים. מחקרים ביולוגיים לחקור את המעורבות של רכיבי OM בודדים בפתוגנזה, כגון לוס/LPS ו-OM חלבונים, ניתן גם להתנהל במודלים בעלי חיים וסלולר באמצעות שברים קרום מבודדים שנאסף על ידי טכניקה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה הזאת ממומנת על ידי P20GM10344 ו R01AI139248 הוענק ז. ד. דלבריבלו.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקי צנטריפוגה 1 ליטר, PC/PPCO, סופר מהירות, עם מכסה איטום, NalgeneVWR525-0466
1 ליטר בקבוק אחסון מדיה פיירקס עם מכסה בטמפרטורה גבוההVWR10416-312
2,000 מ"ל בקבוק ארלנמאייר, פה צרVWR10545-844
4-20% מיני ג'ל חלבון טרומי PROTEAN, 12 בארותBIORAD4561095
4x Laemmli Sample מאגר 10 מ"לBIORAD1610747
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילןVWR89049-174
7 מ"ל הומוגנייזר רקמות Dounce עם שני עלי זכוכיתVWR71000-518
70 מ"ל מכלול בקבוק פוליקרבונטבקמן קולטר מדעי החיים355622
אבקת אגרVWRA10752
B10P ספסל מד pH עם בדיקת pHVWR89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (גרסת ספסל)ThermoFisher Scientific50136146
Benzonase NucleaseMilliporeSigma70746-3
EDTA מלח דיסודיום דיהידראט 99.0-101.0%, גבישים, אולטרה-טהור Bioreagent כיתה ביולוגיה מולקולרית, J.T. BakerVWR4040-01
EmulsiFlex-C3אבסטין, בע"מ
Fiberlite F13-14 x 50cy רוטור זווית קבועהThermoFisher Scientific75006526
חומצה הידרוכלורית 6.0 NVWRBDH7204
IBI Scientific Orbital Platform ShakerFischer Scientific15-453-211
LB מרק מילרVWR214906
ליזוזים, חלבון ביצה, VWRV0063 VWR בדרגה טהורה במיוחד
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמא אולדריץ'M2670
NADHסיגמא אולדריץ'10107735001
אופטימה XPN-80 - IVDבקמן קולטר מדעי החייםA99839
מוצרי פארמקו  אלכוהול טהור 200 הוכחה GL 4/CS Fischer Scientific
, מאוזנת עם 10 מ"מ Tris HCl, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, BioReagent, לביולוגיה מולקולריתסיגמא - MilliporeP4557
Pierce Coomassie Plus (ברדפורד) ערכת בדיקהThermofisher23238
Pro-Q אמרלד 300 ערכת כתמי ג'ל ליפופוליסכרידThermofisherP20495
Proteacease -50, ללא EDTAG Biosciences786-334
Proteinase K, כיתה ביולוגיה מולקולרית ניואינגלנד BiolabsP8107S
נתרן הידרוקסיד ו-GE; 99.99%VWRAA45780-22
Sorval RC 6 Plus צנטריפוגהThermoFisher Scientific36-101-0816
סוכרוזMilliporeSigmaSX1075-3
SW 41 Ti רוטור דלי מתנדנדבקמן קולטר מדעי החיים331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥ 99.9% (בסיס מיובש), אולטרה-טהור Bioreagent ביולוגיה מולקולרית כיתה, J.T. BakerVWRJT4109-6
סוג 45 Ti רוטור טיטניום בזווית קבועהבקמן קולטר מדעי החיים339160
צינור שקוף במיוחד, 14 x 89 מ"מבקמן קולטר מדעי החיים344059
Vortex-Genie 2VWR102091-234
תמיסת פנול NC1624582

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).<....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gram negative BacteriaInner MembraneOuter MembraneSucrose Density GradientMembrane FractionationUltracentrifugationAcinetobacter baumanniiLipooligosaccharidesNADH Dehydrogenase AssayMembrane Purity

מאמרים קשורים