בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום השפיר האנושי כדי לקבוע את התכונות הטרוגניות והפונקציונליות שלהם עבור יישום אפשרי במודלים קליניים וphysiopathological.

תקציר

מספר פרוטוקולים דווחו בספרות על הבידוד והתרבות של תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC). עם זאת, אלה להניח כי האפיתל השפיר היא שכבה הומוגנית. ניתן לחלק את השפיר האנושית לשלושה אזורים אנטומיים: השתקפות, הפלפה והטבור. לכל אזור יש תפקידים פיזיולוגיים שונים, כמו בתנאים פתולוגיים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את. הרקמה האנושית בשלוש מחלקות ולתחזק אותה בתרבות, תאים שמקורם בשפיר משתקף על הציגו מורפולוגיה בוטאידית, בעוד תאים משני האזורים ואזורי הטבור היו קשקשיים. עם זאת, כל התאים המתקבלים יש פנוטיפ אפיתל, הפגינו על ידי זיהוי חיסוני של E-קדהרין. לפיכך, מכיוון שהאזורים השונים והמשתקפים באתרו שונים ברכיבים סלולריים ובתפקודים מולקולריים, ייתכן שיהיה צורך בלימודי מבחנה כדי לשקול הבדלים אלה, משום שיכולים להיות להם השלכות פיזיולוגיות לשימוש ב-haec ב מחקר ביו ויישום מבטיח של תאים אלה ברפואה רגנרטיבית.

מבוא

תאים האפיתל השפיר האדם (HAEC) מקורם בשלבים המוקדמים של התפתחות עובריים, בסביבות שמונה ימים הפריה. הם נובעים מאוכלוסייה של תאים אפיתל הקשקש של אפיפיצוץ שנובעים השכבה הפנימית ביותר של קרום השפיר¹. כך, HAEC נחשבים שאריות של תאים בעלי עוצמה מאפיפיצוץ כי יש פוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט של העובר². בעשור האחרון פיתחו קבוצות מחקר מגוונות שיטות לבידוד תאים אלה מקרום השפיר בתקופת ההיריון על מנת לאפיין את המאפיינים הקשורים לשוערת פלאוריאון שלהם במודל תרבות מחוץ לתחום^3,4.

בהתאם, הוא נמצא כי התכונות התכונות HAEC מאפיין של תאי גזע האדם pluriפוטנטי (HPSC), כגון אנטיגנים פני השטח SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; הליבה של מרכיבי תמלול שעתוק OCT4, SOX2, ו-NANOG; ומסמן ההתפשטות KI67, הרומז שהם מחדשים את עצמם^5,6,7. יתר על כן, תאים אלה כבר מאותגרים באמצעות פרוטוקולי בידול להשיג תאים חיוביים עבור סמנים ספציפיים שושלת היוחסין של שלוש שכבות הנבט (העור, מזועור, ואנדועור)^4,5,8, כמו גם במודלים של בעלי חיים של מחלות אנושיות. לבסוף, haec אקספרס E-קדהרין, אשר מדגימים כי הם שומרים על טבע אפיתל בדיוק כמו hsc^5,9.

מלבד המוצא העובריים, haec יש תכונות פנימיות אחרות העושות אותם מתאים ליישומים קליניים שונים, כגון הפרשה של מולקולות אנטי דלקתיות ו-אנטיבקטריאלי^10,11, גורמי גדילה ושחרור ציטוקינים¹², אין היווצרות של teratomas כאשר הם מושתלים לתוך עכברים לקויה בניגוד עם hpsc², ואת הסובלנות החיסונית כי הם לבטא hla-G, אשר מקטין את הסיכון של דחייה לאחר השתלת¹³.

עם זאת, הדיווחים הקודמים הניחו כי המין האנושי הוא קרום הומוגנית, מבלי להתחשב בכך שהוא יכול להיות מחולק מבחינה אנטומית ופיזיולוגית לשלושה אזורים: משטחי השפיר המכסים את הדציבלים, הטבור (החלק שעוטף את חבל הטבור), ומשתקף (שאר הקרום אינו מוצמד לשליה)¹⁴. הוכח כי האזורים המשחיים ומשתקפים של השפיר על הבדלים בתצוגה מורפולוגיה, פעילות מיטוכונדריאלי, זיהוי של מינים חמצן תגובתי¹⁵, mirna ביטוי¹⁶, והפעלה של מסלולים איתות¹⁷. תוצאות אלה מרמזות על כך שהשפיר האנושי משולב על ידי אוכלוסיה הטרוגנית עם פונקציונליות שונה שיש להתייחס אליה למחקרים נוספים שבוצעו בתוך מודלים מחוץ לבית או במודלים של מבחנה. בעוד מעבדות אחרות עיצבו פרוטוקולים לבידוד של HAEC מהקרום כולו, המעבדה שלנו הקימה פרוטוקול לבידוד, תרבות, ואפיון תאים מאזורים אנטומיים שונים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה האתית של המכון הלאומי דה פראטולוגיניה במקסיקו סיטי (רישום מספר 212250-21041). כל ההליכים שבוצעו במחקרים אלה היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של המכון הלאומי לפראינואטולוגיה, הצהרת הלסינקי, וההנחיות שנקבעו בתקן המקסיקני הרשמי של משרד הבריאות.

1. הכנה

1. הכינו פתרון של ה-PBS 1x עם EDTA. כדי לעשות זאת, להוסיף 500 μL של 0.5 M EDTA המניה לתוך 500 mL של 1x PBS עבור ריכוז סופי של 0.5 mM EDTA.
2. הכינו את מדיום התרבות לחברת HAEC. לקחת 450 mL של גלוקוז גבוה-DMEM, מוסף אותו עם 5 מ ל של נתרן פירובט (100 mM), 50 mL של סרום בלתי פעיל של העוברי העובר בתאי גזע, 5 מ ל של חומצות אמינו לא חיוניות (100x), 5 מ ל אנטיביוטי-(100x), 5 מ"ל של L-גלוטמין (200 mM), ו 500 μL של מרקוטואתנול (1, 000x).
3. לחטא את המכולות להובלת ועיבוד הרקמה: מיכל נירוסטה עם מכסה כדי להעביר את השליה כולה מבית הניתוח למעבדה, מגש (20 ס"מ x 30 ס"מ x 8 ס"מ) כדי לשטוף ולהסיר דם מן השליה כולה לפני הניתוח של קרום השפיר וקרש חיתוך פלסטי כדי להפריד את קרום השפיר לשלושת האזורים.
4. לחטא את כלי הניתוח (אזמל, מספריים, מלקחיים, ומלחציים), 500 mL, כותנה, ותמיסת מלח.

2. קבלת רקמת שנטל

הערה: ממברנות השפיר הושגו מנשים בהריון לטווח מלא (37-40 שבועות), תחת אינדיקציה למסירה בניתוח קיסרי, ללא כל עדות לעבודה פעילה, וללא מאפיינים מיקרוביולוגית של זיהום. הליכי הבידוד והתרבות המשלימים בוצעו בתוך ארון ביולוגי בתנאים סטריליים.

1. בחדר הניתוח, הצמד את חבל הטבור כדי למנוע את זרימת הדם לשאר הרקמה. לאסוף את השליה כולה עם חבל הטבור מהודק במיכל סטרילי.
2. הוסף 500 mL של תמיסת מלח למיכל כדי מימה את השליה.
3. סגרו את המכולה והרכב את הרקמה למעבדה בטמפרטורת החדר.
4. שים את המיכל עם השליה בתוך ארון הביטחון הביואלי.
   הערה: במקרה שהקרע לא יבוצע בתוך 15 דקות של איסוף השליה, אחסן את המיכל עם השליה על הקרח עד עיבוד. הימנע יותר 1 h של זמן שחלף בין קבלת השליה ותחילת הקרע.

3. הפרדה מכנית לכל אזור בקרום השפיר

הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי בתנאים סטריליים ובטמפרטורת החדר.

1. הסר את השליה כולה ממיכל ומניחים אותו על מגש עם חבל הטבור פונה כלפי מעלה.
2. לנקות את קרישי הדם מהמשטח של. הצ-שפיר שמכסה את השליה
3. לזהות את שלושת האזורים של הקרום: שפיר הטבור על עוטף את חבל הטבור, שפיר השפיר על המכסה של הדציבלים, ואת האזור משתקף, שהוא שאר השפיר כי הוא לא מחובר השליה (איור 1).
4. לנתח את שפיר הטבור על האזור (איור 2 א).
   1. באמצעות מלקחיים מבתר, להחזיק את החלק של ממברנה בשפיר המכסה את הצומת של השליה ואת חבל הטבור.
   2. עם אזמל, לנתח את האזור המקיף את החוט תוך מתיחה כדי להפריד אותו מן chorion.
   3. להפקיד את הרקמה המופרדת בגביע עם תווית 100 mL של תמיסת מלח.
5. מנתח את השפיר באזור (איור 2B).
   1. עם גזה סטרילית כותנה, להסיר את קרישי הדם מהמשטח של הצ-שפיר על זה מכסה את השליה.
   2. להחזיק את הקרום על הגבול בין השליה לבין האזור משתקף עם מלקחיים לבתר.
   3. חותכים לאורך ההיקף של השליה עם האזמל.
   4. להיזהר לא לחתוך שום כלי מן השליה.
   5. מניחים את הרקמה המופרדת בגביע אחר עם תווית 300 mL של תמיסת מלח.
6. הפרידו את שאר קרום השפיר שאינו מוצמד לשליה (כלומר, החלק המשתקף) מהצ (איור 2C).
   1. לאסוף את האזור משתקף בגביע אחר עם תווית 300 mL של תמיסת מלח.
      הערה: הוסף פתרון מלוחים ללא הרף במהלך הניתוח כדי למנוע הרקמה מייבוש.

4. שטיפת הקרומים

הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי תחת תנאים סטריליים בטמפרטורת החדר.

1. להיפטר תמיסת מלוחים של כל אזור קרום בנפרד.
2. הוסף 100 mL של תמיסת מלח טרי לאזור הטבור.
3. להוסיף 300 mL של תמיסת מלוחים טריים לאזורים האזור משתקף בהתאמה.
4. מערבבים את הקרומים בעזרת מלקחיים להסרת שאריות דם.
5. . התעלם מתמיסת המלח
6. חזרו על השטף והעצבנות לפחות 3 x עד שהקרום שקוף.
7. המקום ולהרחיב את הקרומים על הלוח כדי לנקות עם גזה סטרילי קרישי דם שלא הוסרו עם שוטף.
   הערה: חשוב מאוד להסיר כמות של אריתרופוציטים רבים ככל האפשר, כאשר נוכחותם משפיעה על התפקוד הטריפסין ועל הכדאיות של תרבויות התאים העוקבות.

5. העיכול האנזימטי של הקרומים מאזורים שונים

הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי תחת תנאים סטריליים.

1. חותכים את האזורים המשתקפים והמפוצלים לשניים או שלושה קטעים.
2. . אל תחתוך את אזור הטבור
3. מניחים את השברים של כל אזור בצינורות צנטריפוגה. הוסיפו 20 מ ל של 0.5% טריפסין/EDTA לאזורים המשתקפים והשפלרים ו-5 מ ל של 0.5% טריפסין/EDTA לאזור הטבור, בהתאמה.
   הערה: חשוב לחתוך את האזורים המשתקפים והמשרים לחתיכות קטנות יותר מכיוון שהם צריכים להיות שקועים לחלוטין בתמיסה של טריפסין.
4. לנער את צינורות הצנטריפוגה בקלות עבור 30 s.. להיפטר מטריפסין
5. הוסף 30 מ ל של חדש 0.5% טריפסין/EDTA לאזורים המשתקפים והמשרים ו 15 מ ל של חדש 0.5% טריפסין/EDTA לאזור הטבור, בהתאמה.
6. מניחים את הצינורות. בתוך מסובבי שבתוך החממה
7. דגירה עם סיבוב (20 סל ד) עבור 40 דקות ב 37 ° c.
   הערה: אם מסובב צינור אינו זמין, טלטל את הצינורות באופן ידני כל 10 דקות.
8. העבר את הטריפסין/פתרונות התא מכל אזור לצינורות צנטריפוגה חדשים.
9. הוסיפו את הנפח של המדיה HAEC שחומם מראש ב-37 ° צ' לצינור כדי להשבית את האנזים.
10. . לאחסן את העיכול הראשון על הקרח
11. חזור על שלבים 5.6-5.8 לתקופת עיכול שנייה.
12. עבור כל אזור, להחזיק קצה אחד של החלק השפיר על באמצעות מלקחיים מבתר, ועם זוג אחר לסחוט לאורך הרקמה כדי להסיר שורות של תאים אפיתל שלא לגמרי לקלף במהלך תקופות דגירה הקודם.
13. לאסוף את העיכול השני לתוך קבוצה אחרת של צינורות צנטריפוגה ו להשבית עם 2x את נפח המדיה HAEC.
14. השמט את הקרומים העועכלים למיכל בידוד.

6. בידוד החטק

הערה: יש לבצע את ההליך בתוך ארון אבטחה ביולוגי תחת תנאים סטריליים.

1. צנטריפוגה את כל הצינורות ב 200 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
2. להיפטר supernatant ולהוסיף 10 מ ל של מדיה HAEC prewarmed (עד 37 ° c) לצינור ו pipet בעדינות כדי לבטל את הצבירה של כל גלולה.
3. שלבו את השעיות הסלולר של שתי העיכול בצינור בודד לכל אזור ממברנה.
4. לסנן את השעיות הסלולר באמצעות 100 יקרומטר תא משתמשים כדי להסיר את הפסולת מטריקס לחלץ ולקבל תאים בודדים.
5. הכינו שלושה אליטים עם 90 μL של טרי, כחול בצינור מיקרוצנטריפוגה.
6. הוסף 10 μL של כל תא השעיה לכל אזור ממברנה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה ולערבב.
7. ספור את התאים בעזרת. מיקרוסקופ תחת שדה אור

7. התרבות של HAEC

1. זרע HAEC משלושת האזורים בנפרד בצפיפות של 3 × 10⁴ תאים/cm² עם מדיה prewarmed haec, שיושלם עם 10 ng/mL של גורם הגידול באפידרמיס האנושית (egf).
   1. הזרע את התאים בלוחות 100 מ"מ כדי לשמור אותם בתוך מבחנה או 24 לוחות טוב לניתוח חיסוני.
2. הnormoxic את המנות ב-37 ° c בתנאים מוקדמים (5% CO₂) באינקובטור מחולל לחות.
3. הוסף את EGF מדי יום ושנה את המדיום כל יום שלישי.
   הערה: התאים יהפכו להיות שוטפת לאחר 4 עד 6 ימים.
4. השתמש בתאים עבור אימונוהיסטוכימיה המקובלת, ניתוח מיון התא, הקפאה, הוצאת RNA והפקת חלבון, או כדי להמשיך במעבר.

8. המעבר המאוחד

1. הסר את המדיום HAEC ושטוף 2x עם פתרון של PBS/EDTA 0.01 M.
2. מודקון עם פתרון של PBS/EDTA 0.01 M עבור 15 דקות ב 37 ° c.
3. הסר את ה-PBS/EDTA והוסף 1.5 mL של 0.5% טריפסין/EDTA.
4. מודקון עבור 5-8 דקות ב 37 ° c.
5. הפוך את האנזים עם שני כרכים של המדיה HAEC.
6. לאסוף את הפתרון המעורב צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g.
7. ספור את התאים והמשך במעברים הבאים או השתמש בתאים לצורך ניתוח נוסף.

תוצאות

HAEC היו מבודדים מכל אחד משלושת האזורים האנטומיים של קרום השפיר ומתורבת באופן אינדיבידואלי בתוך מבחנה. לאחר 48 h של התרבות, תאים עם פנוטיפים אפיתל על פני השטח של הצלחת, למרות התקשורת גם הכיל פסולת תא תאים צפים, אשר הוסרו לאחר המדיום השתנה (איור 3).

במהלך העיבוד של התרבות העיקרית (מעבר אפס, P0), כמה סיבוכים עלולים להתרחש כי יכול להפריע לניתוח נתונים ניסיוני (איור 4): מומלץ להיפטר התרבויות ולעבד קרום אחר על זיהוי נוכחות של חיידקים בשל ז...

דיון

אנו מיושמים פרוטוקול חדש כדי לבודד HAEC מקרום המונח. הוא שונה מדיווחים קודמים בכך שכל ממברנה חולקה לשלושת האזורים האנטומיים שלה לפני בידוד כדי לנתח תאים מכל אחד מהם.

אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא רחיצת הקרום כדי להסיר את כל קרישי הדם, כי הם יכולים להפריע לפעילות של טריפסין בעת הפרדת תאי האפיתל. אי לבצע צעד זה כראוי יכול להוביל להשגת התרבות העיקרית עם אריתרופוציטים מוגזמת ומספר תאים האפיתל חסיד. אם לא נצפתה כל החזקה ב -24 שעות הראשונות לאחר זריעת התאים, אנו ממליצים להשליך את התרבות. נ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<ריאגנטים תרבית חזקים>
2-מרקפטואתנול	תרמו פישר סיינטיפיק/גיבקו	21985023	55 מ"מ
ללא בעלי חיים רקומביננטי אנושי EGF	Peprotech	AF-100-15
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית	תרמו פישר סיינטיפיק/גיבקו	15240062	100X
מדיום הנשר השונה של דולבקו	Thermo Fisher Scientific/Gibco	12430054	בתוספת גלוקוז גבוה ו-HEPES
EDTA	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9260G	0.5 M
תאי גזע עובריים FBS, מוסמך	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10439024
חומצות אמינו לא חיוניות	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11140050	100X
Paraformaldehyde	כל מותג
Phosphate-Buffered	Saline Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
תמיסת מלח (נתרן כלורי 0.9%)	כל מותג
נתרן פירובט	תרמו פישר סיינטיפיק/גיבקו	11360070	100 מ"מ
טריפסין/EDTA 0.05%	תרמו פישר סיינטיפיק/גיבקו
<חזק> חומר חד פעמי
100 ומיקרו; m מסננת תאים	קורנינג / פלקון	352360
100 מ"מ צלחת תרבית	מטופלת TC	430167
24 בארות צלחות מרובות שקופות	קורנינג / Costar	3526
6 בארות צלחות מרובות שקופות TC מטופלות	קורנינג / Costar	3516
צינור צנטריפוגה סטרילי לא פירוגני	כל מותג		עם חרוטי תחתון
קצוות סטריליים לא פירוגניים של 1,000 ומיקרו; l, 200 ומיקרו; l ו-10 µl.
גזה
פיפטות סרולוגיות סטריליות של 5, 10 ו-25 מ"ל	כל מותג
כפפות כירורגיות סטריליות	כל מותג
<חזק>ציוד
Micropipettes
פיפט ממונע מילוי/מתקן
כוסות סטריליות של 500 מ"ל
קרש
אזמלים סטריליים, מספריים, מלקחיים, מהדקים
מגש
צינור מסובב	MaCSmix
<חזק>נוגדנים וערכות			<חזק>נוגדנים ID
אנטי-E-cadherin	BD Biosciences	610181	RRID:AB_3975
Anti-KI67	Santa Cruz	23900	RRID:AB_627859)
Anti-NANOG	Peprotech	500-P236	RRID:AB_1268274
Anti-OCT4	Abcam	ab19857	RRID:AB_44517
Anti-SOX2	Millipore	AB5603	RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4	איתות תאים	4755	RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60	איתות תאים	4746	RRID:AB_2119059
עז נגד עכבר Alexa Fluor 488	תרמו פישר סיינטיפיק	A-11029	RRID:AB_2534088
עז אנטי-ארנב Alexa Fluor 568	תרמו פישר סיינטיפיק	A-11036	RRID:AB_10563566
ערכת בדיקת טונל	Abcam	66110

25300054 TC כותנה סטריליתצנטריפוגה ארון בטיחות ביולוגיתחיתוך מפלסטיק סטרילי מיכל נירוסטה סטרילי סטרילי