Method Article

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

DOI:

10.3791/60571

⸱

January 18th, 2020

 ,  , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בבידול חוץ גופית של תאי גזע האדם העובריים (hESCs) הפכה את היכולת ללמוד התפתחות אנושית על רמות ביולוגיות ומולקולרי וסיפק תאים לשימוש ביישומים משובי. גישות סטנדרטיות עבור תרבות hESC באמצעות תרבות סוג המושבה כדי לשמור על מובחן hESCs ו embryoid הגוף (EB) ו שושנת היווצרות עבור בידול לתוך שכבות נבט שונות הם יעילים זמן רב. המוצג כאן הוא שיטת תרבות חד-תאית באמצעות hESCs במקום תרבות מסוג מושבה. שיטה זו מאפשרת תחזוקה של התכונות האופייניות של hESCs מובחן, כולל ביטוי של סמנים hESC ברמות הדומות לסוג המושבה hESCs. בנוסף, הפרוטוקול מציג שיטה יעילה תא מחולל קדמון (NPC) הדור מסוג תא יחיד hESCs המייצרת NPCs בתוך שבוע 1. תאים אלה מאוד לבטא מספר הגנים NPC סמן והוא יכול להבדיל לתוך סוגים שונים של תאים עצביים, כולל נוירונים ומיאסטאלוגיים ו astrocytes. זו מערכת התרבות היחידה עבור hESCs יהיה שימושי בחקירת מנגנונים מולקולריים של תהליכים אלה, מחקרים של מחלות מסוימות, מסכי גילוי סמים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) יש את הפוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט הראשי, אשר לאחר מכן להבדיל לתוך שונים מרובי עוצמה מחולל שורה של תאים. לאחר שנים אלה מעניקים את כל סוגי התאים בגוף האדם. ב מערכות התרבות hESC הפכה את היכולת ללמוד פיתוח עובריים האדם שימשו ככלי רב ערך לקבלת תובנות חדשות לגבי איך תהליכים אלה מוסדרים ברמות הביולוגי והמולקולרי. באופן דומה, מחקרים של תאי גזע פלוריטי המושרה (iPSCs) שנוצרו מתאים סומלי מחדש מבודדים מחולים אנושיים לספק תובנות הרומן לתוך מחלות שונות. בנוסף, התאים מחולל והבדיל שנגזר מ hESCs יכול להיות שימושי עבור מחקר מעורבים טיפול בתאי גזע והקרנת סמים1,2,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ממברדת מרתף מוסמכת-צלחות מצופות

  1. הפשרת לאט את מטריצת קרום המרתף של hESC-מוסמך (ראה טבלת חומרים) ב -4 ° c עבור לפחות 2 – 3 h או לילה כדי למנוע היווצרות של ג'ל.
  2. כדי להכין ממברדת מרתפים לוחות מצופים, לדלל את המטריצה ב-DMEM קר/F12 2% הריכוז הסופי. מערבבים היטב ומעילים כל באר של 6 היטב צלחת עם 1 מ ל של פתרון מטריצה מדולל.
  3. מודדת ממברנה במרתף לוחות מצופה מטריקס בטמפרטורת החדר (RT) עבור לפחות 3 h או ב 4 ° c בלילה.
    הערה: ניתן לאחסן צלחות עם מטריצת ממברנה במרתף ב -4 ° c במשך שבוע לפני הסרת פתרון המטריצה ולוחיות השימוש.

2. הסתגלות מסוג המושבה hESCs לתרבות היחידה

  1. כדי לעבור את התרב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול משופר עבור תחזוקה והתרחבות של תרבות אחת סוג תא של hESCs והבידול יעיל שלהם לתוך תאים מחולל קדמון, אשר מבדיל לאחר מכן לתוך שונים במורד הזרם העצבי, כולל נוירונים.

תמונות חדות שלב מייצגים מציגות מורפולוגיה של תאים בשלבים שונים במהלך ההסתגלות של סוג המושבה hESCs לתרבות סוג תא יחיד (איור 1א). באמצעות תנאי התרבות של התא היחיד, התגלה כי hESCs המותאם הצליחו להישמר בצפיפות גבוהה, ולאחר מכן בקלות וביעילות משנה כאשר הגיע שליטה (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מדרגי ויעיל עבור הבידול של hESCs לתוך ליננים שונים והדור של מספר מספיק של תאים הבדיל הם קריטריונים חשובים לסינון סמים וטיפול בתאי גזע. שונים של תא יחיד שיטות העברת פורסמו, שבו התאים הם מתורבתים בנוכחות של מעכב סלע או מולקולות קטנות אחרות כדי לשפר את ההישרדות, אבל המוצרים הסופיים של שיטות אלה התרבות הם סוג המושבה hESCs17,18,19,20,21. פרוטוקול תא בודד לESC.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד ר קארל ד. בורטנר על עזרתו בניתוח ה-FACS. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון הלאומי למדעי הסביבה, המוסדות הלאומיים לבריאות, Z01-ES-101585 ל AMJ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 מ"מ m-צלחותibidi81156צלחת תרבית תאים
6 בארות צלחותCorning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104-500פתרון ניתוק תאים
Activin AR& מערכת D338-AC-050
חומצה אסקורביתSigma AldrichA4403
B27 תוסףתרמו פישר17504044
B27 תוסף (-ויטמין A)תרמו פישר12587010
BDNFחומרים ביולוגיים יישומייםZ100065
bFGFPeprotech100-18C
צנטריפוגהDAMON/ICE428-6759
חממת CO2Thermo Fisher4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)Corning354277מטריצת ממברנת מרתף (משמשת לרוב הפרוטוקול כאן)
Cryostor CS 10Stemcell Technologies7930תמיסת הקפאת תאים
DispaseStemcell Technologies7923
DMEMThermo Fisher10569-010
DMEM/F12Thermo Fisher10565-018
DorsomorphinTocris3093
EGFPeprotechAF-100-16A
סרום בקר עובריFisher ScientificSH3007003HI
FGF8חומרים ביולוגיים יישומייםZ101705
GDNFחומרים ביולוגיים יישומייםZ101057
מטריצת ג'לטרקסתרמו פישרA1569601מטריצת קרום הבסיס
GlutaMaxThermo Fisher35050061תוסף גלוטמין, 100X
H9 (WA09) קו תאי גזע עובריים אנושייםWiCellWA09
Heregulin b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
נוקאאוט DMEMתרמו פישר10829018
החלפת סרום נוקאאוטתרמו פישר10828028
למיניןסיגמא אולדריץ'L2020
mTeSR1Stemcell Technologies85850hESC תרבית מדיום
N2 תוסףתרמו פישר17502001
NEAAThermo Fisher11140050
NeurobasalThermo Fisher21103049
מעכב פולי-L-אורניתיןסיגמא אולדריץ'P3655
ROCK מעכבTocris1254
SB431542Tocris1614
SHHחומרים ביולוגיים יישומייםZ200617
מדיום אב עצבי StemdiffStemcell Technologies5833מדיום הרחבה NPC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Embryonic Stem CellsSingle Cell CultureNeural Progenitor CellsEmbryoid Body FormationROCK InhibitorNeural Induction MediumDopaminergic NeuronsAstrocyte DifferentiationFACS AnalysisQuantitative PCR

Related Articles