הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

21.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60575

⸱

29 בינואר 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

תקציר

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לחקור ביטוי חלבונים ולוקליזציה במהלך מצבי התפתחות נורמלית ומחלות. למרות שפרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה רבים הוטלו לצורך מקטעי רקמות ורקמות, פרוטוקולים אלה דורשים לעתים קרובות שינוי ואופטימיזציה עבור אורגניזמים מודל שאינם יונקים. מערכת זברפיש משמשת יותר ויותר כמערכת מודל במחקר בסיסי, ביולוגי וטרנסלזמי לחקירת מנגנוני ההתפתחות המולקולריים, הגנטיים והסלולאריים של התהליכים ההתפתחותיים. Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמערכת מודל, אבל גם דורשים טכניקות שונות עבור זיהוי חלבון אופטימלי. כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו לגבי. פרוטוקול זה מתאר בנוסף כמה אסטרטגיות הרכבה שונות שניתן ליישם וסקירה של היתרונות והחסרונות שכל האסטרטגיה מספקת. כמו כן, אנו מתארים שינויים בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי של מצעים כרומוגניים ברקמות הר שלמות וזיהוי של קרינה ברקמת זחל מנות. פרוטוקול זה חל באופן כללי על חקר שלבים ומבנים עובריים רבים.

מבוא

הדגים (danio rerio) התפתחה כמודל רב עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים מכמה סיבות כולל זמן הדור הקצר, התפתחות מהירה, ואת היכולת הגנטית לטכניקות גנטיות. כתוצאה מכך, הדגים משמשים בדרך כלל בתפוקה גבוהה של מולקולת מולקולה קטנה עבור מחקר הרעילות וגילוי הסמים. Zebrafish הם גם מודל אטרקטיבי למחקר של תהליכים התפתחותיים בהתחשב כי נקבה אחת יכולה לייצר באופן שגרתי 50-300 ביצים בכל פעם, העוברים ברורים באופן ברור לפתח באופן חיצוני המאפשר הדמיה יעילה של תהליכים התפתחותיים. עם זאת, מחקר מוקדם הסתמך בעיקר על מסכי גנטיות קדימה באמצעות N-אתיל-N-הניטרוסוראה (אנו) או אחרים מוטגנים בשל אתגרים בהקמת טכניקות גנטיות הפוכה. בערך לפני שני עשורים, שורגוולנוס. השתמשו לראשונה ב-"דג" כדי להוריד גנים ממוקדים1 מורגוולנוס הם מיעוט אנטי-היגיון קטן, העכב את התרגום של mRNA המטרה לאחר ההזרקה לעובר בשלב התפתחותי מוקדם. החולשה העיקרית של מורגוולנוס היא שהם מדולל כמו תאים הפער בדרך כלל לאבד את היעילות על ידי 72 שעות לאחר הפריה (hpf). בעוד מורגוולנוס להישאר כלי רב עוצמה עבור דג זברה גנים שיבוש, שעתוק activator כמו אפקטור נוקלאוסיס (talens), אבץ-האצבעות הנוקלאוטיות (zfns), ו מקובצים באופן קבוע במרווחים קבועים palin,הגנוםהקצר (crisprs) הם יותר לאחרונה בשימוש ישירות המטרה הגנטית zebra אלה אסטרטגיות גנטיות הפוכה, בשילוב עם גנטיקה קדימה מסכי תפוקה גבוהה, הקימו את דג זברה כמודל רב עוצמה כדי ללמוד ביטוי גנים ותפקוד.

היכולת ללמוד את פונקציית הגנים דורשת בדרך כלל הערכה של התפלגות הזמן הזמני של גנים או ביטוי מוצר גנטי. שתי הטכניקות הנפוצות ביותר כדי להמחיש דפוסי ביטוי כאלה במהלך ההתפתחות המוקדמת נמצאים היברידיזציה באתרו (ISH) ואת כל הר אימונוהיסטוכימיה (IHC). באתר היברידיזציה פותחה לראשונה בשנת 1969 ומסתמך על השימוש בבדיקות אנטי-RNA המותווית נגד היגיון כדי לזהות ביטוי mRNA באורגניזם4. לעומת זאת, נוגדנים המסומנים בתווית משמשים ב אימונוהיסטוכימיה כדי להמחיש את הביטוי חלבון. הרעיון של תיוג חלבונים לאיתור תאריכיםשל שנות ה -30 ו- ihc הראשון הניסוי פורסם בשנת 1941 כאשר נוגדנים fitc התווית שימשו כדי לזהות חיידקים פתוגניים ברקמות הנגועות6. ISH ו-ihc התפתחו והשתפרו באופן משמעותי במהלך העשורים הבאים וכעת הן בשימוש שגרתי במעבדת המחקר המולקולרית והאבחוני7,8,9,10,11. בעוד שתי טכניקות יש יתרונות וחסרונות, IHC מציע מספר יתרונות על ISH. למעשה, IHC הוא הרבה פחות זמן רב מאשר ISH והוא בדרך כלל פחות יקר בהתאם לעלות של הנוגדן העיקרי. בנוסף, ביטוי mRNA אינו תמיד ממדד אמין של חלבון ביטוי כפי שהוא הוכח עכברים ואנשים שרק על שליש של וריאציה שפע של חלבון ניתן להסביר על ידי mRNA שפע12. מסיבה זו, IHC היא תוספת חשובה לאישור נתוני ISH, כאשר הדבר אפשרי. לבסוף, ihc יכולים לספק נתוני התאמה לשפות משנה ולוקליזציה משותפים שאינם ניתנים לקביעה על-ידי ISH13,14,15. כאן, אנו מתארים שיטה צעד אחר צעד כדי לזהות באופן מהימן חלבונים על ידי אימונוהיסטוכימיה בכל העוברים הר דג זברה וזחלים. המטרה של טכניקה זו היא לקבוע את הביטוי המרחבי והזמני של חלבון מעניין בעובר כולו. טכנולוגיה זו משתמשת אנטיגן העיקרי נוגדנים ומתויג באמצעות נוגדנים משניים מסומנים. הפרוטוקול הוא להתאמה בקלות לשימוש על מקטעים רקמה רכוב שקופיות לשימוש עם מצעים כרומוגניים במקום של זריחה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי פיתוח שריר השלד דג זברה מבטא קולטני גלוטמט ביונוספטרופי, בנוסף קולטני אצטילכולין. NMDA-type גלוטמט לקולטן תת יחידות לזיהוי על שריר האורך ב -23 hpf.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים לעבודה עם מבוגרים הרבייה והעוברים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מורי סטייט.

1. איסוף העובר וקיבוע

  1. הכנת טנקים המכינות ידי הצבת דג זברה מבוגרים זוגות סקס או קבוצות בטנקים עם רשת שינוי או הצמד ממולא מים מערכת בלילה.
  2. באור דולק, לשנות את המים ההשכן המיכל עבור מים מערכת טריים להסיר צואה. השתמש מחזור כהה של 14 h/10 h עם אורות מתקרבים ב -9 בבוקר.
  3. , ברגע שהביצים מטילות. החזר את המבוגרים למיכלי הבית
  4. לאסוף ביצים על ידי ציור אותם באמצעות pipet העברה או לשפוך אותם לתוך מסננת רשת שינוי.
  5. להעביר את הביצים לצלחות פטרי מילא באמצע הדרך עם העובר בינוני (כגון 30% Danieau או בינוני העובר של E2 עם 0.5 mg/L מתילן blue), הגבלת מספר העוברים לצלחת ל50.
  6. הסר את כל הביציות המתות או שאינן מתחלקת.
    הערה: עוברים מתים יכולים להיות מזוהים בקלות כאשר הם נעשים אטומים ולעתים קרובות מופיעים "מעונן". אם מתילן כחול מתווסף למדיום העובר, העוברים המתים לקחת מראה כחול כהה.
  7. מנות מודגרות של ביצים ב-28.5 ° c עד שיגיעו לשלב הרצוי. לניסוי זה, להעלות את העוברים עד 23 hpf.
  8. אופציונלי) להעביר את העוברים ב 24 hpf כדי 200 μm 1-פניקסיל 2-thiourea (ptu) במדיום העובר כדי למנוע melanogenesis16,17. לחילופין, עוברים מלבין שלאחר הקיבעון (ראו מקטע אופציונלי 5).
  9. שינוי בינוני העובר או בינונית PTU מדי יום.
  10. העוברים מורורonate בעזרת מלקחיים אולטרה-עדינים מתחת לstereomicroscope. לחילופין, העוברים כימית באמצעות דגירה של 1 מ"ג/mL בתוך בינונית העובר במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את העוברים מהפרואז ושטפו שלוש פעמים במדיום העובר.
  11. עוברים בעלי כורייתם. נדבקים לפלסטיק לשמור אותם בזכוכית או בצלחות פטרי מצופה עם 1-2% agarose התפרקה במדיום העובר. להעביר עוברים למטה באמצעות אש מלוטש פסטר הכומר כדי למזער את הנזק.
  12. להעביר את העוברים כדי 1.5 mL צנטריפוגה צינורות באמצעות פלסטיק או אש מלוטשת pipet.
  13. להסיר מדיום העובר עם מיקרופיפטה. להשאיר מספיק נוזל רק כדי לכסות את העוברים אחרי כל שינוי נוזל.
  14. הכינו 4% פאראפורמלדהיד (כיתה) בתמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS) בתוך מכסה כימי.
    התראה: המטה הוא חומר מסוכן. לבשו כפפות ולהיפטר מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.
  15. לתקן את העוברים ב 4% בכיוון כיתה של 1-2 h עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. לחלופין, תקנו את העוברים 4 שעות עד לילה ב -4 ° c.
  16. כביסה שלוש פעמים ב-1x PBS + 1% טריטון-X (PBTriton) עבור 5 דקות.
  17. השתמשו בעוברים באופן מיידי או היאחסנו ב -4 ° c עד שבוע אחד.
  18. עבור אחסון לטווח ארוך, המייבשים את העוברים ב 100% מתנול (MeOH) 2 h או לילה ב-20 ° c. לאחסן את העוברים ב-20 ° c ב-MeOH במשך כמה חודשים.
    התראה: MeOH הוא חומר מסוכן. לבשו כפפות ולהיפטר מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.

2. הכנה לעובר

  1. מימה מחדש את העוברים באמצעות incubations סדרתי בטמפרטורת החדר.
    1. דגירה ב 75% MeOH/25% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.
    2. דגירה ב 50% MeOH/50% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.
    3. מודקון ב 25% MeOH/75% 1x PBS עבור 5 דקות, נדנדה.
    4. דגירה ב 100% PBTriton עבור 5 דקות, נדנדה.
  2. אופציונלי הכנת מעבד טרי מפרוטאינאז K פתרון עבודה (10 μg/mL ב PBTriton) על הקרח על ידי הוספת 10 μL של מלאי המופרש החדש של מניות פרוטטינואז K (10 מ"ג/mL).
    1. החדירות העוברים על ידי לעכל עד 30 דקות ב פרוטטינואז K.
      הערה: העיתוי המוצע הוא < 24 hpf: ללא עיכול; 24 hpf: 15 דקות העיכול; ובגיל 7 ימים: 30 דקות של עיכול.
    2. לשטוף עוברים החדירות ב PBTriton ו-לתקן מחדש ב 4% הכיור עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. רוחצים את העוברים שלוש פעמים ב PBTriton עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה.

3. הנוגדן העיקרי דגירה

  1. בחר פתרון חסימה מסחרית או סרום התואם את המינים מארח הנוגדן המשני (ex. 10% סרום עז ב PBTriton) עם או בלי 2 מ"ג/mL סרום הפרה אלבומין (BSA).
  2. לחסום את העוברים בפתרון חסימת עבור 1-3 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° צ' בעת הנדנדה.
  3. דגירה של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימה או 1% סרום ב PBTriton לילה ב 4 ° צ' בעת נדנדה. בניסוי זה, הנוגדנים העיקריים ששימשו היו anti-NMDAR1, קולטן אנטי פאן-אמפא, ו anti-פוספהו-Histone H3, כל אחד מדולל לריכוז הסופי של 1:500 ב 1% סרום עז ב PBTriton.
  4. כביסה חמש פעמים ב PBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.

4. הדגירה הנוגדן המשני

  1. בחר נוגדן משני המבוסס על המינים המארחים של הנוגדן העיקרי ואת אורך הגל הרצוי.
  2. דגירה של נוגדן משני מדולל בפתרון חסימה או 1% סרום עבור 2 h בטמפרטורת החדר (או לילה ב 4 ° c) בזמן נדנדה.
    הערה: נוגדנים משניים בפלורסנט רגישים לאור. השתמשנו 1:500 עז נגד עכבר Alexa488 מדולל ב 1% סרום עז ב PBTriton.
  3. לכסות את הצינורות עם רדיד אלומיניום או לכסות עם תיבת חסימת אור עבור זה ואת כל הצעדים הבאים.
  4. שטוף שלוש פעמים ב PBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן הנדנדה.
  5. העבר את העוברים לתמיסת גליצרול של 50% ב-PBS על מיטה של 2% agarose במדיום העובר והמשך לתיעוד או המשך לשלבי עיבוד נוספים להלן.

שלבים אופציונליים

5. הלבנת

  1. הכנת פתרון אקונומיקה בצינור 1.5 mL על ידי הוספת 810.7 μL של ddH2O, 89.3 μl של 2 M KOH, ו 100 μl של 30% H2O2.
  2. היפוך הצינור שלוש פעמים כדי לערבב.
  3. פיפטה 1 מ ל של כיוון פתרון אקונומיקה לעוברים.
  4. פתח את מכסה צינור העובר כדי לאפשר גז להימלט. הקש בעדינות על השפופרת על הספסל כדי להוציא בועות.
  5. נטר את תהליך הלבנת (להשתמש במיקרוסקופ אם יש צורך) ולהפסיק את התגובה כאשר הפיגמנט הוא הוסר מספיק (כ 5 דקות עבור 24 hpf או 10 דקות עבור 72 hpf).
  6. הסר בזהירות את הפתרון הלבנת עם מיקרופיפטה ושטוף עוברים שלוש פעמים ב 1 מ ל של PBTriton.
    הערה: עוברים נדבקים בשלב זה.
  7. המשך לתיעוד או להמשך עיבוד שלבים להלן.

6. ניתוח העובר ודילקינג

  1. כדי להסיר את החלמון, להעביר כמות קטנה (~ 200 μL או מספיק כדי לכסות לחלוטין את העובר אך מגביל מספיק כדי להגביל את המקום שבו הוא יכול לצוף) של 1x PBS לשקופית דיכאון או שקופית זכוכית פשוטה.
  2. השתמש באמצעות העברת פלסטיק העברה לנוע 1 או יותר עוברים ל-droplet של PBS.
  3. השתמש מלקחיים אולטרה דק ו-100 פינים חרק לשבור את החלמון בעדינות מאוד בגרגרים החלמון של משטח המים של העובר (ראה גם צ'נג et al., 2014)18.
  4. להסיר גרגרי חלמון ולחדש את PBS לפי הצורך.
  5. חזור על הפעולה עד שעובר יהיה נקי מספיק מחלמון.

7. הרכבה שטוחה בשקופיות

  1. העבר עוברים להחליק על שקופית זכוכית טעונה עם פיפטה פלסטיק או מיקרופיפטה 1 mL עם קצה חתוך (כדי להפחית את הלחץ ההטיה). אוריינט כרצונך עם טיפ מיקרופיפטה ב200 μL או סיכת חרק.
  2. וויק התרחק מעודפי PBS עם מגבת של קים או נייר.
  3. הוסף 2-3 טיפות של מדיה הרכבה לשקופית ו coverslip.
  4. האוויר יבש במשך כ 5 עד 10 דקות.
  5. אטום את הזכוכית המכסה על השקופית עם לק ברור.
    הערה: הקצוות של זכוכית העטיפה חייבים להיות מכוסים לחלוטין בשכבה דקה ורציפה של לק ציפורניים.
  6. אפשר לייבש כ 10 דקות לפני הדמיה.

8. הרכבה באגקם

  1. להכין 1% agarose במדיום העובר על ידי הוספת 0.5 g של agarose כדי 50 mL של בינוני העובר בבקבוקון בטוח במיקרוגל או בגביע של לפחות 3x נפח גדול יותר מאשר הרצוי.
  2. חום במיקרוגל, מתערבל כל 30, עד שעלה התפרקה לחלוטין.
  3. לעשות 1 mL משבצינורות צנטריפוגה 1.5 mL. מאחסנים את הליטים בטמפרטורת החדר.
  4. כיסוי שפופרת עם מנעולי כובעים לפני החימום.
  5. מניחים מנורות במחזיק צינור צף בתוך מיכל חצי מלא מים.
  6. מיקרוגל את הגביע עם צינורות צף עבור 2-3 דקות, או עד agarose הוא נמס לחלוטין.
  7. העבר עובר לשקופית הגישור עם פיפטה פלסטיק או מיקרופיפטה מ200 μL עם קצה חתוך (כדי להקטין את מתח ההטיה).
  8. מיקום העובר על שמיכות מלבני באמצעות סיכות חרק ולהוסיף כ 20 μL נמס מומסת ישירות העובר.
  9. במהירות המזרח את אזור הריבית הקרובה ביותר שמיכות באמצעות 100 פינים חרק.
    הערה: זהו הר הפוך.
  10. החזר את הצינור האגקם אל צינור המים החמים הצף בין כל שימוש למיקרוגל לפי הצורך.
  11. תמונה באמצעות מיקרוסקופ כאשר הצמח מתקשה. שמרו על העובר הטעון הפוך לשימוש במיקרוסקופ הפוך. להעיף את הכיסויים מעל (כך agarose היא תחת coverslip) לשימוש על מיקרוסקופים ישרים.

9. הרכבה על שקופיות מגושרים

  1. כדי להפוך שקופיות גישור, הדבק כיסוי מרובע לשקופית זכוכית באמצעות נקודה קטנה של דבק-על.
    הערה: צריך להיות שוקת לפחות 5 מ"מ רוחב בין הכיסויים. שני #1 coverslips גבוהה בדרך כלל מתאים 24-48 hpf עוברים בעוד שלושה שמיכות גבוהה יכול להיות הכרחי עבור 72 hpf.
  2. העבר 1-2 להעביר עוברים לשקופית הגישור עם פיפטה פלסטיק או 200 μL מיקרופיפטה עם קצה חתוך (כדי להפחית את לחץ ההטיה).
  3. הפתיל נוזל עודף עם מגבונים קים או נייר מגבת.
  4. הוסף טיפה של ≥ 80% גליצרול ישירות לעובר.
  5. מכסים עם זכוכית עטיפה מלבנית. ה-droplet של גליצרול צריך לגעת בזכוכית המכסה.
  6. להוסיף גליצרול יותר לחלל בין זכוכית המכסה להחליק לפי הצורך כדי לכסות לחלוטין את העובר עם שוליים של גליצרול בצידי העובר.
  7. החלק את זכוכית העטיפה המלבנית בעדינות כדי לגלגל את העובר למצב הדמיה.

10. מכתים כתמים

הערה: סעיף זה מתחיל לאחר שלב 4.2 לעיל ומחליף את שאר שלב 4.

  1. מודאת העוברים בפתרון חסימה עם נוגדן משני peroxidase מעלה עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c בעת נדנדה.
  2. שטוף שלוש פעמים בPBTriton במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. להעביר את העוברים לצלחת תרבות או דיכאון שקופית עם פיפטה העברה.
  4. מערבבים 50 μL של 1% בקלות (3, 3 '-diaminobenzidine) מומס2O ו 50 μl של 0.3% חמצן מימן ולהביא 1 מ ל עם PBS.
    התראה: הנגיעה היא חומר מסוכן. לבשו כפפות והיפטרו מנוזלים מזוהמים ומוצקים באזורים ייעודיים.
  5. לכסות את העוברים HRP עם הפתרון מוכן לעיל ולפקח על פיתוח צבע (בדרך כלל 1-5 דקות) תחת מיקרוסקופ.
  6. לאחר שהגיע לרמה הרצויה של פיתוח צבע, לשטוף את העוברים לזמן קצר ב-PBS.
  7. להעביר את העוברים חזרה לצינור 1.5 mL לפני קיבעון.
  8. לתקן מחדש את העוברים עבור 15-20 דקות ב 4% בכיוון הכיור בטמפרטורת החדר.
  9. רחץ את העוברים שלוש פעמים ב PBTriton עבור 5 דקות.
  10. . המשך לתיעוד

11. פרוטוקול משתנה עבור כתמים רקמה מנות שנטענה בשקופיות

  1. להקיף רקמות להיות מוכתם בעט פאפ.
  2. העבר את השקופיות לתא לח.
  3. . הוסף 1 מ ל של Pbs ישירות לשקופית
  4. דגירה 7 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר הטבעה בינונית.
  5. שופכים את PBS על ידי היפוך שקופית.
  6. מימה 1 דקות עד 1 מ ל של מאגר TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 מ"מ הנאל, 0.1% Tween20).
  7. חסום עד 1 מ ל של פתרון חסימה (מסחרי או 10% סרום + 2% BSA) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
  8. דגירה לילה בנוגדן העיקרי מדולל 1% סרום או חסימת פתרון ב 4 ° c.
  9. כביסה חמש פעמים עד 1 מ ל של מאגר TNT בטמפרטורת החדר.
  10. דגירה של נוגדן משני עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c. כסו את החדר בנייר כסף או השתמשו במכסה כהה.
  11. רוחצים 5 פעמים ב-TNT בטמפרטורת החדר. יוצקים את הכביסה האחרונה.
  12. הר עם 2-3 טיפות של הרכבה בינונית ו coverslip. בואו לשבת 5-10 דקות.
  13. לאטום את זכוכית העטיפה על השקופית באמצעות לק ברור מסמר. אפשר להתייבש לגמרי לפני ההדמיה.

12. תעוד ותיעוד

  1. הקלט את הפרוצדורה המלאה ואת כל הסטיות במחברת מעבדה.
  2. הקלט את הריכוז, שם, מספר קטלוג, יצרן, ומספר רב של הנוגדן העיקרי.
  3. מניחים מדגם שנטען כראוי על במת המיקרוסקופ. אתר את אזור הריבית.
  4. בחר בדוגמה בהירה יחסית. הגדר חשיפה למצלמה והרווח כך שהאות יהיה בהיר מספיק ללא הפחתה.
  5. השוואת עוצמת הצביעה של אותו אזור מעניין באמצעות אותן הגדרות חשיפה בעת השוואת בין עוברים ונוגדנים ניסיוניים המסומנים באמצעות נוגדן (ex. IgG) עוברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל הר אימונוהיסטוכימיה משתמש בנוגדנים כדי לזהות את התבנית המרחבית של ביטוי החלבון בבעל החיים שלמים. זרימת העבודה הבסיסית של אימונוהיסטוכימיה (מתוארת באיור 1) כרוכה הרבייה דגים, העלאת והכנת העוברים, חסימת אנטיגנים שאינם ספציפיים, באמצעות נוגדנים העיקרי אנטיגן מסוים כדי למקד את החלבון של עניין, מזהה את הנוגדן העיקרי עם נוגדן משני מתויג, הרכבה הדגימה, ותיעוד הביטוי.

כל הר אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב ער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אימונוהיסטוכימיה הוא כלי רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הביטוי הזמני-מיותר של חלבון כמעט כל עניין של אורגניזם. אימונוהיסטוכימיה משמש על מגוון רחב של רקמות ואורגניזמים מודל. פרוטוקול זה הותאם במיוחד לשימוש ב-zebrafish. אימונוהיסטוכימיה במינים שונים עשויים לדרוש קיבוע שונים וטכניקות טיפול, חסימת פתרונות בהתאם מינים ונוכחות של peroxidases אנדוגניים, וזמני דגירה בשל עובי והרכב של רקמות. Ihc ב-דג זברה כבר אינטגרלי לקידום ההבנה שלנו של סרטן24, מחלה מטבולית25, הפרעות נויר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מידע לחשוף.

תודות

מימון מ-NIH גרנט 8P20GM103436 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgaroseFisher ScientificBP160-100
רדיד אלומיניום, כבדקירקלנדניתן להחליף כל מותג
נוגדן נגד NMDAMillipore SigmaMAB363
אנטי-פוספו-היסטון H3 (Ser10), שיבוט RR002Millipore Sigma05-598
קולטן אנטי-פאן-AMPA (GluR1-4)Millipore Sigma
אלבומין בסרום בקר (BSA)פישר סיינטיפיקBP1600-100
סידן חנקתי [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
, 1.5 מ"לAxygenMCT150C
לק שקוףסאלי הנסוןניתן להחליף
כל לק או מקשיחשקופית דיכאון (קעור)אלקטרונים Miscroscopy Sciences71878-01
DiaminobenzidineThermo Scientific1855920
מדיום עוברי, Danieau, 30%17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES במים טהורים במיוחד.
מדיום עוברי, E27.5 מ"מ NaCl, 0.25 מ"מ KCl, 0.5 מ"מ MgSO<תת>4, 75 μ M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
מחזיק צינור צףThermo Scientific59744015
מיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטיLeica BiosystemsDMi8
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיLeica כיסויי זכוכית BiosystemsM165-FC
18 מ"מ x 18 מ"מקורנינג284518
כיסויי זכוכית 22 מ"מ x 60 מ"מThermo Scientific22-050-222
שקופיות זכוכיתפישר סיינטיפיק12-544-4
גליצרולפישר סיינטיפיקBP229-1
עיזים נגד עכבר IgG Alexa 488InvitrogenA11001
תמיסת HEPESSigma AldrichH0887
תא לח עם מכסהSimportM920-2
מי חמצן, 30%Fisher ScientificH325-500
Immunedge פאפעט וקטור מעבדותH-4000
סיכות חרקים, גודל 00Stoelting5213323
מגנזיום גופרתי (MgSO4 · 7H2O)Sigma Aldrich63138
מסננת רשתOneidaניתן להחליף כל מותג
מתנולסיגמא אולדריץ'34860
מתילן כחולסיגמא אולדריץ'M9140
מנעול מכסה מיקרו-צינורמחקר מוצרים בינלאומיים145062
תנור מיקרוגלToastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
סרום עיזים רגילMillipore SigmaS02L1ML
מערבל אגוזיםפישר סיינטיפיק88-861-044
ParaformaldehydeFisher Scientific04042-500
פיפטות פסטרפישר מדעי13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 ב-1x PBS
Permount הרכבה בינוניתפישר כימיקלSP15-500
צלחת פטרי (זכוכית)פיירקס3160100
צלחת פטרי (פלסטיק)פישר סיינטיפיקFB0875713
1-פניל 2-תיאוריאהאקרוס אורגני207250250
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), 10x, pH 7.4Gibco70011-044
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), 1x1x עשוי ממלאי 10x מדולל ב-dH2O
אשלגן כלורי (KCl)Sigma AldrichP9333
אשלגן הידרוקסיד (KOH)FisherP250-500
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH<תת>2PO4)Sigma AldrichP5655
PronaseSigma Aldrich10165921001
Proteinase KInvitrogenAM2544
נתרן כלורי (NaCl)Sigma AldrichS7653
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)סיגמא אולדריץ'S7907
מיכל השרצה עם מכסה והכנסהAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
ג'ל דבק סופר3M סקוטש
TNT100 מ"מ טריס, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl; 0.1% טווין20; תוצרת dH2O
העברתפיפטה פישר13-711-7M
חומצה טריכלורואצטית (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris BaseFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
מלקחיים אולטרה-דקיםפישר סיינטיפיק16-100-121
מים, אולטרה-טהורים/מזוקקים כפוליםפישר סיינטיפיקW2-20
MABN832צינורות צנטריפוגה

מקורות

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376(2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991(2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי חלבוןמיקרוסקופיה קונפוקליתסמיגות בנוגדניםקיבוע רקמהתמיסת חסימהנוגדן משניאסטרטגיות הרכבהזיהוי פלואורסצנציה
כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.