הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60577

⸱

18 במאי 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Technical Chemistry, Gottfried-Wilhelm-Leibniz Universität Hannover

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים הליך מפורט כדי להריץ עיצוב של ניסוי במיקרו-bioreactor חקן אוטומטי ואחריו הקציר התאים וכימות החלבון באמצעות חלבון A עמודה.

תקציר

אופטימיזציה של bioprocesses כדי להגדיל את התשואה של המוצרים הרצויים היא חשיבות בתעשיית הביופרמקולוגיה. זה יכול להיות מושגת על ידי בחירת המתח ועל ידי פיתוח ביוברוזה פרמטרים. מבחנות לנער שימשו למטרה זו. הם, עם זאת, חוסר יכולת לשלוט בפרמטרים התהליך כגון pH ו חמצן מומס (DO). מגבלה זו ניתן להתגבר בעזרת מיקרו-ביוריאקטור אוטומטי. השחקנים האלה מחקים את הטיפוח בקנה מידה גדול יותר. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו הוא שילוב של עיצוב הניסוי (DOE) בתוכנה. שילוב זה מאפשר יצירת עיצוב שבו ניתן לגוון במקביל פרמטרי תהליך מרובים. ניתן לנתח את פרמטרי התהליך הקריטי ואת תנאי הביוברוזה האופטימליים בתוך התוכנה. מוקד העבודה המוצג כאן הוא להחדיר את המשתמש לצעדים המעורבים בעיצוב התהליך בתוכנה ובשילוב של ה-DOE במהלך הטיפוח-תרגול.

מבוא

השוק הביופרמקולוגיה העולמי היה שווה יותר מאשר ארה ב $250,000,000,000 בשנת 2018 והרחיבה ברציפות1. חברות התרופות מתרחק מהפקת תרופות מולקולריות קטנות לtherapeutics המיוצרים בביוטכנולוגית כגון חלבונים רקומביננטי. אלה בלבד אחראים על הכנסות של יותר מ $150,000,000,0001. התאים המיונקים נמצאים כעת בשימוש נרחב לייצור של אלה רקומביננטי תרופות חלבונים. בתקופה הנוכחית, בין 68 מוצרים מאושרים שיוצרו על ידי תאים מיונקים, 57 מיוצרים על ידי תאי שחלות בסינית אוגר (CHO)2. תאים צ'ו משמשים במיוחד עבור ייצור של חלבונים רקומביננטי הדורשים שינויים פוסט-טרנסלבותית. תאים אלה הם מועדפים כפי שהם גדלים השעיה ובכך לאפשר תוצאות הנוזלה בסרום חינם מוגדר כימית בינונית3,4. היתרון השני של שימוש בתאי צ'ו הוא כי גליקן המבנה של המוצר דומה לזה של הנוגדן מונובטיים האנושי (mAb) ותוצאות תשואה גבוהה יותר חלבון רקומביננטי ופרודוקטיביות ספציפית בשל הגברה ג'ין5.

התשואה של תרבות התאים רקומביננטי CHO (rCHO) הוגדלה על-ידי פי מאה בשני העשורים האחרונים. שיפור זה מיוחס לאופטימיזציה של הפרמטרים התהליך, האכלה אסטרטגיה ופיתוח של סרום מוגדר כימית ללא תשלום בינונית6. עם העלייה בדרישות של מוצרי התרופות, הלחץ עולה על יעילות הזמן לפיתוח של תהליך הייצור7. כדי להפחית את הלחץ תוך הבטחת איכות המוצר הנותבת מחדש את המוקד של תעשיית התרופות על איכות ידי עיצוב (QbD). QbD משמש כדי להבין את ייצור המוצר, כמו גם את התהליך. כלי חיוני המשמש את ObD הוא העיצוב של הניסוי (DOE). היא מסייעת להגברת ההבנה של התהליך על-ידי חשיפת הקשר בין משתני קלט שונים ונתוני פלט שנוצרו. החלת הגישה DOE כדי למטב את הביומיזם הוא מועיל במהלך השלבים המוקדמים של הפרויקט בהטמעת תנאי התהליך והגדלת כמות סיכוייו ואיכות. גישה זו מועילה בהשוואה לאסטרטגיה המיושנת: גורם אחד-בזמן (OFAT). הגישות הסטטיסטיות ב-DOE באמצעות הקלאסיקה, שנין או טאגוצ'י מעולים בהרבה על ה-OFAT8.

מיטוב התהליך והמדיה ניתן לבצע בצלוחיות טלטול. מבחנות הם זולים יחסית. עם זאת, לא ניתן לשלוט בפרמטרים כגון טמפרטורה, pH ו חמצן מומס (DO). כדי להתגבר על החסרונות האלה, שימוש רב הספסל ריאקטורים העליון החל נפח עבודה של 0.5 l ל 5 l ניתן להשתמש. הכורים מספקים מעקב נרחב ובקרת תהליכים מקוונים. עם זאת, השימוש בביוריאקטור רב השימוש הוא זמן ועבודה אינטנסיבית. על מנת להתגבר על החסרונות האלה, ביוריאקטור הרומן היחיד המשלב את התהליך המקיף של ניטור ביוריאקטור הספסל העליון וטיפול קל של הבקבוקון משמש. מערכת הסינון של תפוקה גבוהה וטכנולוגיה לשימוש יחיד תרמו כדי לשפר את היעילות של ביצועי תהליך ופיתוח9.

במאמר זה, ההנחיות לטעון את המתכון בתוכנת מיקרו-ביוריאקטור האוטומטי (AMBR) מפורטים. ההשפעה של מהירויות שונות של שטירר ו-pH על ריכוז התא קיימא (vcc) ו סיכוייו הוא למד במהלך הניסוי הזה. התוצאה והניתוח הנסיוני מתבצעים בתכנון תוכנת הניסוי MODDE 12. ניתוח המוצר מבוצע במערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות) עם עמודת חלבון A. הוא מבוסס על העיקרון כי האזור הFc של mAb נקשר חלבון A עם אהדה גבוהה10,11. בשיטה זו, ניתן לזהות ולכמת את mAb. הקוונפיקציה מתבצעת מעל האזורים השיא הנמדד שנמדדו ב 280 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הליך טרום תרבות

הערה: רקומביננטי CHO DG44 תאים עם ריכוז תא בר קיימא של 1 x 107 תאים/mL משמשים עבור פרוטוקול זה.

  1. הפשרת המבחנה המכילה 1.2 mL של תאים לטמפרטורת החדר ומיד להעביר את הבולם התא ל 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת חרוטי המכיל 10 מ ל של מדיום זרע קר.
  2. צנטריפוגה את צינורית צנטריפוגה חרוט עבור 5 דקות ב 190 x g וטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.
  3. טרום חום 150 mL של מדיום הזרעים בבקבוקון לנער 500 mL כדי 36.8 ° c.
  4. השעיית מחדש בעדינות את הגלולה בתוך 10 מ ל של המדיום הזרע טרום מחומם ולהעביר את התאים לתוך הבקבוקון לנער.
  5. השתמש 1 mL של המדגם מתוך הבקבוקון כדי למדוד את VCC הראשונית ואת הכדאיות באמצעות מונה התא.
    הערה: הכדאיות צריכה להיות מעל 70% לאחר הפשרה לטיפוח מוצלח.
  6. מודטה את הבקבוקון לנער ב שייקר מסלולית (קוטר שייקר של 19 מ"מ) ב 36.8 ° צ' ו 7.5% CO2 עם שיעור רועד של 120 rpm.
    הערה: תנאים אלה משתנים בהתאם למתח התאים והמדיום.
  7. שלושה ימים לאחר מעבר התאים, להסיר את הבקבוקון לנער מתוך השייקר ולמקם אותו תחת הארון למינארי הזרימה. קח 1 מ ל של דגימה כדי למדוד את הריכוז התא הסופי. חשב את אמצעי האחסון שיש להעביר למדיום מחומם מראש באופן מחמם, כך שהריכוז הראשוני של התא במעבר החדש הוא 2 x 10/5 תאים/mL.
  8. מעבר לתאים 5 פעמים בסך הכל לפני המעבר אל הביוריאקטור לטיפוח העיקרי.

2. טיפוח ראשי

  1. למדוד את ריכוז התא הסופי של התרבות הקדם. חשב את אמצעי האחסון שיועבר אל הביואורקטור כך שהריכוז הראשוני של התא במחולל הוא 3 x 10/5 תאים/mL.
  2. מלאו את הכור באמצעי הייצור יום לפני החיסונים כדי לכוון את הכור ולהגדיר את פרמטרי התהליך כגון טמפרטורה, pH ו DO.
    הערה: תנאי הטיפוח הם 36.8 ° c ו-60% ריכוז חמצן מומס (DO). בדקנו מהירויות שטירר של 1050 סל ד ו 1300 סל"ד יחד עם האלפים של 6.9, 7.1, ו-7.3. משך הטיפוח הכולל הוא 12 ימים עד שהתאים נקצרו. תהליך האצווה פועל במשך 72 שעות לאחר מכן בינוני ההזנה מתווסף כל 24 h. הפרוטוקול שישמש לטיפוח מפורט בפירוט במקטע הבא.

3. כתיבת המתכון בתוכנת המיקרו-ביוריאקטור האוטומטית

הערה: קיימות שתי דרכים לכתיבת מתכון בתוכנת תרבות התאים של AMBR: היא נוצרת באמצעות אשף או על-ידי הוספת כל שלב באופן ידני. לצורך פרוטוקול זה, שלבים המשתמשים באשף מוצגים.

  1. יצירת ניסוי חדש
    1. פתח את תוכנת תרבות התאים AMBR ובכרטיסיה מבוא לחץ על צור ניסוי חדש.
  2. טעינת המתכון
    1. בכרטיסיה ניסוי חדש , הזן את שם הניסוי יחד עם התאריך שבו עליו להתבצע.
      1. הפעילו את נקודת הביקורת של תחנת התרבות והכלים שישמשו במהלך הטיפוח-תרגול. הוספה אוטומטית תגי DOE יהיה גם מופעל עבור מעבר קל במהלך תכנות של ניסוי DOE. לחץ על הבא כדי לעבור לכרטיסיה הבאה.
    2. הגדר מידע על הוספת מדיה לתוך הכלי יחד עם האנטיקצף, הזנה, להאכיל וגלוקוז.
      1. הפעל את נקודת הבדיקה ' הוספת לוח מדיה '. הגדר את סוג הלוחית, שם ומיקום הלוח המכיל את המדיום.
        התראה: בהתאם לסוג הלוח ואם הצלחת מכילה מכסה, הפעל את הבדיקה מראש כדי להבטיח תפקוד חלק של המטפל בנוזלים
      2. לחץ על הוספת מדיה לכלי קיבול. הזן את עוצמת המדיה שתתווסף לכלי הקיבול. הגדירו את המיפוי של העברת המדיה מלוחית הכלים לכלי הדם. לחץ על הבא כדי לעבור לכרטיסיה הבאה.
    3. הגדר את תנאי הטיפוח במחולל.
      1. לאחר שהמידע התקשורתי הוזן לתוכנה, הקצה את תנאי הטיפוח. לחץ על תנאי מדיה למלא את הטמפרטורה, היעד DO, הגבלת pH העליון וערבוב RPM (למעלה ערבוב או למטה ערבוב).
    4. הגדר תוספת של האיקולים לתוך כלי הדם.
      1. הפעל את הוספת לוחית הטלפון. הגדר את סוג הלוחית, שם ומיקום הלוח המכיל את המדיום.
      2. לחץ על הוספת תאים לכלי קיבול. הזן את זמן החיסון ואת נפח המדיה שיש להוסיף לכלי הקיבול.
      3. הגדירו את הנתיב שנסע על ידי המטפל הנוזלי להעברת התא מלוחית הכלים לכלי הדם. לחץ על הבא כדי לעבור לכרטיסיה הבאה.
        הערה: ודא שימוש חוזר עצות הצנרת מנוטרל כדי למנוע החוצה זיהום ושגוי הראשוני הריכוז תא הקיימא.
    5. הגדרת תוספת של הזנה, גלוקוז ו-antifoam.
      הערה: ההליך לתוספת של הזנה, גלוקוז ו אנטיקצף דומה זה לזה. לצורך פרוטוקול זה ההליך מופיע ברשימה "הזנה". זה יכול להיות משוכפל עבור גלוקוז ו אנטיקצף.
      1. הפעל את לוחית ההזנה הוסף והגדר את סוג הלוחית, שם ומיקום. לחץ על הוסף הזנה לכלי קיבול והזן את עוצמת ההזנה שתתווסף לכלי הקיבול. הגדירו את המיפוי של העברת ההזנה מלוחית הכלים לכלי הקיבול.
      2. בהתאם לתרגול, הוסף את מספר תוספת ההזנה. לצורך טיפוח זה, הכור ניזון לאחר 72 שעות לכל 24 שעות.
      3. הוסף ידנית את עיכוב הזמן בין ההזנה על-ידי הזנת הנתונים להשהיה מתאים שנוספו. היום הראשון של האכלה הוא אחרי 72 שעות של חיסונים והשני הוא אחרי 96 שעות וכן הלאה.
        הערה: תוספת של קצף מתוכנת להתווסף כל יום כדי למנוע קצף במהלך הטיפוח.
    6. הערכת דגימה במהלך הטיפוח-תרגול.
      1. הפעל את הצלחת להוסיף לדוגמה ולהגדיר את סוג הצלחת, שם ומיקום.
      2. בדוק את לקחת דגימת מכלי שיט והזן את עוצמת הדגימה שתוסר מכלי הדם. הגדירו את המיפוי של העברת הדגימה מכלי הקיבול לצלחת. ודא כי אמצעי האחסון אינו יורד מתחת ל-10 מ"ל במהלך כל הטיפוח-תרגול.
      3. הוסיפו את מספר הדגימות שיש לנקוט במהלך הטיפוח. בדומה להזנה, להוסיף את הזמן של המדגם להיות מוסר מהספינה עבור כל נקודת מדגם קלט.
    7. . שמור את התהליך . הוא מוכן כעת להוצאה להורג
      הערה: כדי להבטיח את ההפעלה החלקה של הפרוטוקול, עבור אל הכרטיסיה ' שלבים לתהליך ' בתוכנה של תרבות התא ambr ובחר באפשרות ' עבד שלב ' כדי להמחיש את זרימת המתכון.
  3. עיצוב הניסוי במיקרו-ביוריאקטור האוטומטי
    1. על מנת להפעיל את תוכנת DOE של bioreactor חקן, להבטיח כי המתכון בתוכנה הראשית נשמר ומוכן לשימוש.
    2. פתח את תוכנת Ambr 15 DOE ולחץ על החקירה ובחר חדש.
      1. הזן את שם חקירת ה-DOE החדשה בתיבת הדו יצירת חקירה .
      2. כדי להקצות ניסוי לחקירת DOE, פתח את המתכון שנוצר כדי ללמוד את הפרמטרים השונים. לחץ על עיון ובחר את הניסוי המתאים.
    3. הגדר את פקטור ה-DOE.
      1. תגי כלי הקיבול כבר מתגייס לעמודה. כדי להגדיר את הגורם הרצוי DOE, בחר את הפרמטר ולחץ על העמודה התווית גורם DOE. בחר חדש והוסף את היחידות, הקיצורים, הגבול התחתון והעליון של הגורמים (לדוגמה, טמפרטורה, DO, pH).
    4. הגדר את גורם התגובה.
      1. לאחר גורמי DOE הוגדרו, להגדיר את התגובה בהתבסס על הניתוח הניסיוני יהיה בנוי.
      2. בכרטיסיה תגובות , הגדר את הערכים שייחשבו לניתוח של הנתונים.
      3. לחץ על עריכת תגובות DOE ולהגדיר את השם של התגובה, קיצור, יחידות, מינימום המגבלות המרביות (למשל, titer, ריכוז התא קיימא).
      4. לאחר הגדרת התגובות, בחר במשתנה AMBR עבור כל תגובה והגדר את המשתנה. ניתן לשייך תגובה אוטומטית למשתנה באמצעות מיקרו-ביוריאקטור, לבחור את המשתנה הנדרש מהרשימה הנפתחת.
      5. שנה את המשוואה עבור כל אחת מהתגובה בהתאם לדרישה. הבחירה היא בין הנתונים המינימליים, המקסימליים, הראשונים, האחרונים והממוצעים.
    5. צור עיצוב.
      1. השתמש באשף העיצוב התחל כדי לבחור את סוג העיצוב הניסיוני, כדי להוסיף או להסיר את מספר המשכפלת ונקודות המרכז.
      2. בחר את המטרה, אשר קובע את הבחירה של עיצובים ומודלים:
        הקרנה: משתמש במודלים ליניאריים ואינטראקציה כדי למצוא את הגורמים החשובים
        אופטימיזציה (RSM), משתמש במודלים ריבועית ומעוקבים למידול ואופטימיזציה מפורטים
        מטרת פיצול: מודלים לניסוח וגורמי תהליך ניתן לבחור בנפרד
      3. לאחר החלטת המטרה, בחר את הדגם ואת העיצוב יחד עם מספר נקודות מרכז ושכפול.
      4. לחץ על סיום ועבור ללשונית הבאה.
    6. . תגדיר את הניסוי
      הערה: גורמי DOE מפורטים בעמודה הימנית של התוכנה. בבחירת הגורמים הרצויים, הכלים המפעילים את הניסוי עם הפרמטר הרצוי יסומנו. הכלים בתוך תחנת התרבות ניתן להזיז על ידי לחיצה ימנית על הכלי והעברת אותו למיקום הרצוי.
      1. צור מנות עבודה שניתן לייבא בתוכנת תרבות התאים של AMBR. בהתאם למספר הניסיונות שנות העבודה השונות נוצרות ומאוחסנות לצורך הטמעה נוספת
  4. ביצוע הניסוי במנות העבודה שנוצרו במחשב הנייד של בקרת AMBR
    1. בכרטיסיה ניסוי , לחץ על יצירת הניסוי DOE לאתר את מנת העבודה שנוצרה באמצעות תוכנת DOE.
    2. אתחל את התהליך על-ידי לחיצה על התחל.
  5. ניתוח תוצאות נסיוניות
    1. לאחר הניסוי הוצא להורג, לייצא את הנתונים באמצעות תוצאות הייצוא DOE. החלון הייצוא של תוצאות ה-DOE נפתח ואת השורות המציינות את כלי התרבות ואת התחנה מפורטים בטבלה.
    2. בחר את השורות הרצויות ולחץ על מיוצא שורות נבחרות או לייצא נתונים ניסיוניים כדי לאחסן את כל התוצאות ולשמור את הקובץ לניתוח נוסף.
    3. יבא את הנתונים לתוך מודול ה-AMBR DOE על-ידי מעבר לכרטיסיה תוצאות ובחירה באפשרות ייבוא תוצאות.
    4. אתר את קובץ הנתונים הרצוי ולחץ על תוצאות הניתוח.
    5. לנתח את התוצאות עוד ב MODDE.

4. ביצוע טיפוח במיקרו-ביוריאקטור האוטומטי

הערה: השלבים הבאים מופעלים על-ידי המשתמש בעזרת הפרוטוקול שנכתב בתוכנה הנ ל. השלבים מתבצעים על-ידי המשתמש, אלא אם צוין אחרת.

  1. העמסת כלי הקיבול
    1. פתחו את כלי התרבות הגמא המעוקרים תחת ארון זרימה למינארי וממזרח לתחנת התרבות כמתואר באיור 2.
    2. נקו את צלחת המלחציים עם 70% אתנול וכפול מים מזוקקים. לאחר מכן, הקלפה את הצלחת. והציבו על גבי כלי הקיבול
    3. הר את צלחת התפס עם צלחת שטירר, ולהבטיח שכל סיכה תתוקן בחוזקה.
    4. הדק הן את צלחת הערבוב ואת הצלחת המלחציים לתוך ההרכבה הזע.
  2. הפעלת תוכנת מיקרו-ביוריאקטור
    1. השתמש בתוכנית הכתובה בסעיף 3 כדי להריץ את הטיפוח.
    2. המחש את צעדי התהליך המתוזמנים או הושלמו בכרטיסיה ' תהליך '. לשנות את צעדי הטיפוח במהלך התהליך לרוץ לפי הצורך על ידי הראשון להשהות את המטפל נוזלי ולאחר מכן עריכת מתכון התהליך.
    3. הוסיפו את הקצף לכלים לפני שהוא מתחיל לוודא שאין קצף מופרז במהלך הטיפוח. את הקצף יהיה להוסיף באופן קבוע, ואת קצף זיהה ויזואלית.
  3. הוספת מדיה לכלי הקיבול
    1. ממלאים את הצלחת 24 היטב סיפק עם מיקרו-bioreactors באופן ידני עם מדיה סטרילית ומקום בחפיסה המיועדת של המערכת. ודא שלוחית הצלחת מונחת בחפיסה שהוגדרה על-ידי התוכנית הכתובה (סעיף 3). מילוי כלי הקיבול יתקיים כמתוכנן בסעיף 3.2.2.
      הערה: הטמפרטורה והטירר מתחילים מיד לאחר הוספת המדיה והאנטיקצף. קורא החיישנים מופעל שעה אחת לאחר שכלי הקיבול מלא (הפעלת צג ההפעלה). ברגע שהקורא מופעל. המדיה נותרה למינימום של 6 שעות לפני כיול ה-pH והחיסון. ניתן לשנות את פרמטרי התהליך בתוכנה כפי שהוזכר בסעיף 3.2.3.
  4. חיסון
    1. למדוד את ריכוז התא בר קיימא לאחר המעברה -5. חשב את מספר התאים שיועברו לכלי הקיבול כדי להבטיח שריכוז התא הראשוני בכל כלי הקיבול הוא 3 x 10/5 תאים/mL.
    2. להעביר את התאים 24 צלחת הבאר עמוק כזה את הנפח של ההשעיה היא לפחות 1.6 פעמים את הנפח הנדרש. עבור כמות נדרשת של 2 מ ל של האירשת, להעביר 3.2 mL של השעיית התא לתוך כל באר בצלחת.
    3. מניחים את הצלחת 24 הבאר בחפיסה המיועדת. כלי הדם ייחוסנו כמו בסעיף 3.2.4.
  5. דגימה יומית וניתוח
    1. הסרת דגימה של 460 μL מכלי הקיבול בכל יום באמצעות המטפל הנוזלי. לדלל 200 μL של המדגם עם 800 μL של מאגר מסוננים 1x PBS (5x דילול), ולאחר מכן מקום בדלפק התא.
    2. צנטריפוגה את המדגם הנותרים עבור 5 דקות ב 190 x g וטמפרטורת החדר ולאחסן את supernatant לניתוח נוסף (גלוקוז, לקטט, גלוטמין ו גלוטמט).
    3. הקפא 100 μL של סופרנטנט ב-20 ° צ' עד לסיום הטיפוח-תרגול בחלבון.
  6. סיום הטיפוח-תרגול
    1. כאשר בקרת הפרמטרים של התהליך (כלומר, טמפרטורה, עצבנות, pH ו-DO) הופסקה, להפסיק את הניטור של התהליך.
    2. . להתיר את הצלחת ולוחית ההדק
    3. הסירו את כלי התרבות ונקו את תחנות התרבות. מניחים את לוחיות הייבוש על תחנות התרבות ודופקים אותם.
    4. בינתיים, לנקות את לוחיות התפס ביסודיות עם 70% אתנול ומים מזוקקים כפולים.
    5. לחץ על הפסק בתוכנת ביוריאקטור שחקן לאחר השלמת מחזור הייבוש.
  7. קציר של תרבות התא
    1. מסיק תאים ביום 12 לטיפוח ידי הסרת ידנית את תוכן כלי השיט לצינורות צנטריפוגה 50 mL. צנטריפוגה את ציר התא ב 190 x g עבור 30 דקות.
    2. להשליך את הגלולה תא ולאחסן supernatant ב-20 ° c.

5. מדידת ריכוז mAb

  1. השתמש בחלבון 1.7 mL עמודה לקוונפיקציה של החלבון במהלך הטיפוח-תרגול.
  2. הכן את מאגר השפה והליקציה לפני שאתה מסדר את הדגימות.
    1. השתמש בפתרון של 0.5 M Na2hpo4 המכיל 0.5 m הנאל עם pH של 7.9 כמו מאגר equilibration ופתרון של 100 מילימטר גליצין המכיל 0.5 M הנאל עם pH של 2 כמו מאגר להתחמק.
  3. סנן את שני המאגרים באמצעות קרום מ0.2 יקרומטר ו-דגה לפני שימוקמו בניתוח.
  4. לטהר את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים בעזרת מאגר שיווציה טרי.
  5. טען את החלבון עמודה הנמצאת במערכת הבין-מערכות.
  6. בצע כרומטוגרפיה עם שיעור זרימה של 1 mL/min. הגדר את טמפרטורת תנור העמודה ב-30 ° צ' וטמפרטורה אוטומטית ב -10 ° c
  7. להפשיר את הדגימות קפוא בטמפרטורת החדר ולסנן 225 μl של כל מדגם דרך ממברנה מ0.22 יקרומטר pvdf. לדלל את הדגימות עם ריכוז גבוה יותר של החלבון הרצוי הם ביחס 1:20 עם מאגר שיווציה ולסנן דרך הקרום לפני הצבת בדוגמת האוטומטי.
  8. הצב את הדגימות בדוגמת המילוי האוטומטית. טען את השיטה ואת הרצף בתוכנה והתחל את הרצף.
    הערה: השיטה מורכבת משלושה שלבים (ראה איור 1): הזרקת המדגם לתוך העמודה בשתי הדקות הראשונות; ואחריו מאגר משחרל 8 דקות והתחדשות טור עם מאגר שיווציה עבור 10 דקות.

figure-protocol-1
איור 1: חלבון A כרומאטוגרם, המייצג את השלבים השונים במהלך ריצה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מבט כולל על הטיפוח שבוצע במחקר זה מוצג באיור 2.

figure-results-1
איור 2: ייצוג סכמטי של התנאים הניסיוניים לבדיקת פרופילי מהירות pH ו-שטירר בתחנות התרבות. הדמות מייצגת גם את הפריסה הנכונה כדי למקם את כלי הקיבול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אופטימיזציה של התהליך כדי להגדיל את התשואה היא בעלת חשיבות מכרעת בתעשיית הביופרמקולוגיה. מבחנות לנער עלול לשמש להקרנה של המתח; עם זאת, הניטור של הפרמטרים התהליך כגון pH ו-DO אינם זמינים בצלוחיות. המיקרו-ביוריאקטורים יש יתרון כפי שהם מאפשרים ניטור רציפה ושליטה על התהליך. לולאות שליטה אלה במיקרו-bioreactor חקן גם לספק מצב דומה לאלה בקנה מידה גדול יותר ולכן, לספק תוצאות הדומות הרבה יותר bioreactor חקנים בקנה מידה גדול. יתרון נוסף של המיקרו-bioreactor חקן הוא מגוון רחב של מצבים שניתן לבחון בתוך אותה מסגרת זמן בעלות נמוכה יות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים רוצים להודות לBundesministerium הבילפות ולפורשנג (BMBF), משרד החינוך והמחקר הפדרלי, גרמניה וצוות הביו-ביוטכנולוגיה של הקבוצה הביוטוריוס, בגרמניה, על תמיכתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל קצות פיפטה חד פעמיות, מעוקרSartorius Stedim Biotech GmbHA-0040
200 מ"מ L-גלוטמיןCorning, Merck25-005-CV
24 צלחות באר עמוקות היטבSartorius Stedim Biotech GmbHA-0038
5 מ"ל קצות פיפטה חד פעמיות, מעוקרSartorius Stedim Biotech GmbHA-0039
ambr 15 אוטומטי מערכת מיקרוביו-ריאקטורSartorius Stedim Biotech GmbH001-2804
ambr 15 תרבית תאים 24 ביו-ריאקטורים חד פעמיים - SpargedSartorius Stedim Biotech GmbH001-1B86
Antifoam C EmulsionSigma-Aldrich, MerckA8011
מסנן סטרילי עליוןבקבוק Corning, MerckCLS4314740.1 μ m גודל נקבוביות
CEDEX חומר ניקוי (3% רירית)Roche Innovatis AG05-650-658-001
מונה תאיםRoche Innovatis AG05-650-216-001CEDEX HiRes
CHO DG44 קו תאיםCellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)Sigma-Aldrich, MerckCR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)Sigma-Aldrich, MerckCR80026
CHOKO ייצור בינוניסיגמא-אולדריץ', MerckCR80027
CHOKO Stock Culture MeiumSigma-Aldrich, MerckCR80028
Chromaster מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוהVWR צינור
קורנינג, MerckSIAL0790
אתנולMerck
גליציןקארל רוט56-40-6
בקבוקוני HPLCVWR InternationalSUPLSU860181
PBSSigma-Aldrich, MerckP4417
חלבון A עמודהתרמו פישר מדעי1502226POROS™ A 1.7  מ"ל
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ', Merck7647-14-5
נתרן פוספט דו-בסיסינטול מים סיגמא-אולדריץ', Merck7558-79-4
טריפן כחולVWR InternationalVWRVK940
YSIYSI Inc2900DYSI 2900 בחר
צנטריפוגה חרוטי בינלאומי 1070179026

מקורות

  1. Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
  2. Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136(2018).
  3. Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
  4. Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
  5. Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
  6. Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
  7. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
  8. Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
  9. Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
  10. Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
  11. Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
  12. Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
  13. Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
  14. Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
  15. Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DOEpH
מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.