מאמר שיטה

דגים קטנים, שאלות גדולות: אוסף של טכניקות מודרניות לחקר טטרה מקסיקנית

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60592

⸱

24 בפברואר 2020

 , 
1Genetics Department, Blavatnik Institute, Harvard Medical School

במאמר זה

תקציר

מאמרים שנדונו:

Stahl, B. A. et al. מניפולציה של תפקוד גנים בדגי מערות מקסיקניים. כתב העת לניסויים חזותיים. (146) (2019).

Peuß, R. et al. אוסף גמטות והפריה חוץ גופית של Astyanax mexicanus. כתב העת לניסויים חזותיים. (147) (2019).

Worsham, M. et al. מעקב התנהגותי והדמיה נוירו-מאסט של דגי מערות מקסיקניים. כתב העת לניסויים חזותיים. (147) (2019).

Jaggard, J.B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E.R., Keene, A.C. מדידות אוטומטיות של שינה ופעילות תנועתית בדגי מערות מקסיקניים. כתב העת לניסויים חזותיים. (145) (2019).

Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J.B. הכלאה שלמה באתרה עבור עוברי Astyanax. כתב העת לניסויים חזותיים. (145) (2019).

Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. העלאת מקסיקני הטטרה Astyanax המקסיקני לניתוח פנוטיפים פוסט-זחלים ואימונוהיסטוכימיה שלמה. כתב העת לניסויים חזותיים. (142) (2018).

מאמר מערכת

למרות עניין רב שנים במקורות המגוון של בעלי חיים, יש לנו הבנה מוגבלת של השינויים הגנטיים העומדים בבסיס האבולוציה של מורפולוגיה, פיזיולוגיה והתנהגות. הטטרה המקסיקנית, Astyanax mexicanus, התגלתה כמודל רב עוצמה לקידום ההבנה שלנו כיצד תכונות מתפתחות. מין זה של דגים קיים כשני מורפוטיפים, מורפוטיפ ששוכן בנהר בעל עיניים (דג פני השטח) שנמצא בשפע בנהרות ברחבי מקסיקו ודרום טקסס, ומורפים חסרי עיניים שוכני מערות (דגי מערות) המשגשגים במערות אבן הגיר הכהות תמיד באזור סיירה דל אברה בצפון-מזרח מקסיקו1. ישנן 29 אוכלוסיות מערות ידועות שמקורן לפחות בשתי פלישות עצמאיות של דגי שטח 2,3. צורות המערה והנהר נותרו פוריות וקל לגידול במעבדה, מה שמאפשר לחוקרים למפות גנטית את התכונות המתפתחות בתגובה ללחצים הסלקטיביים הייחודיים במערה. לדוגמה, היעדר אור הוביל לרגרסיה של העיניים 4,5,6,7,8,9, פיגמנט 10,11,12,13,14 ושינה 15,16,17,18,19; הגבלת חומרים מזינים נבחרה לאכילת יתר20, עלייה במשקל21 ואחסון שומן22; וניווט בחושך קידם יכולת מוגברת לחוש את הסביבה 23,24,25,26,27,28. מספר הולך וגדל של חוקרים רותמים את הדג הזה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של האבולוציה. מכיוון שחלק מהתכונות המסתגלות בדגי מערות, מזיקות בבני אדם, דג המערות הפך גם לאטרקטיבי למחקר ביו-רפואי 21,29,30,31. במטרה לקדם את יכולת השחזור ולספק פלטפורמה לחוקרים חדשים, אוסף שיטות JoVE זה מספק טכניקות לגידול, מדידת תכונות ובחינת פעילות גנים.

כנקודת התחלה, הליך ההפריה החוץ גופית שהודגם על ידי Peuß et al. 32 משרת מטרות מרובות מכיוון שהוא מספק שיטה להשגת 1) הכלאות מערות/פני שטח שעשויות להיות קשות לגידול, 2) עוברים בשלב תא אחד להזרקות מיקרו, ו-3) דגימות מותאמות שלב לניתוח פנוטיפים עובריים. A. mexicanus משריץ בדרך כלל במהלך הלילה. Peuß et al. תאר מערכת לשינוי מחזור אור-חושך ולהשגת דגים המוכנים לאיסוף גמטות בשעות העבודה הרגילות. ההדגמה החזותית שלהם של איסוף הגמטות מועילה במיוחד מכיוון ששלב זה דורש טכניקה זהירה. המאמר שלהם חיוני למספר יישומים במורד הזרם, כולל השוואה של דפוסי ביטוי גנים במהלך האמבריוגנזה.

לוק ואחרים. 33 מספקים פרוטוקול הכלאה חזק באתרו המותאם להמחשת ביטוי גנים בעוברים מקסיקניים . הם מפשטים הליך רב-יומי זה באמצעות רשימת פעולות לביצוע (המסופקת כקובץ משלים) ומשתפים הנחיות לפתרון בעיות. כהשלמה לשיטה זו, רידל ואחרים. 34 מראים כיצד לבחון ביטוי גנים ולוקליזציה של חלבונים בדגים שבקעו באמצעות אימונוהיסטוכימיה שלמה. כדי לבצע השוואות משמעותיות בין מורפוטיפים לאחר הבקיעה ותחילת ההאכלה, יש צורך לשלוט בתנאי הגידול. הם מראים כיצד לגדל בוגרים באמצעות השרצה טבעית ולגדל זחלים בצפיפות קבועה על דיאטת רוטיפר שיש לה יתרונות ניכרים בתכולת החומרים המזינים ובעלות בהשוואה למקורות מזון אחרים. פרוטוקול הצביעה החיסונית שלהם מזהה בהצלחה אנטיגנים במוח, במעיים ובלבלב עד 12 יום לאחר הבקיעה, ומאפשר לחקור שלבים מאוחרים של התפתחות ותפקוד האיברים. חשוב לציין, הם מספקים רשימה של נוגדנים ששימשו בהצלחה ב-A. mexicanus. השיטות המשולבות של לוק ואחרים. ורידל ואחרים. שימושיים לניתוח ההשפעות של מניפולציה גנטית.

באוסף שיטות זה, Stahl et al. 35 מתארים דרכים מרובות לתפעל את תפקוד הגנים ב-A. mexicanus כולל: מיקרו-הזרקת מורפולינו, מוטגנזה בתיווך CRISPR-Cas9 וטרנסגנזה בתיווך Tol2. בנוסף להדגמת הזרקת פיקו וסינון של עוברים מוזרקים, הם מספקים הנחיות מועילות לתכנון מורפולינים, RNA מנחים וטרנסגנים. הם חולקים תוצאות המאמתות כל אחת מהטכניקות הללו. לדוגמה, התמקדות בהיפוקרטין/אורקסין (HCRT) באמצעות מורפולינו חוסם חיבור מפחיתה את הפעילות התנועתית ומגבירה את השינה בדגי מערות; עריכת OCA2 (המוקד הסיבתי ללבקנות דגי מערות) בדגי שטח באמצעות CRISPR/Cas9 מייצרת דגי שטח לבקנים; והחדרת אינדיקטור סידן מקודד גנטית המונע על ידי מקדם דג זברה פאן-עצבי באמצעות טרנסגנזה של Tol2 משיגה ביטוי עצבי כמעט בכל מקום בטטרה המקסיקנית. הם מציינים שרבים מהכלים הגנטיים שפותחו בדגי הזברה יכולים להיות מועברים ישירות לדגי מערות בגלל הגנום הדומה שלהם. המאמר שלהם הוא משאב חיוני לחוקרים המבצעים מחקרים פונקציונליים ב-A. mexicanus ומשלים את המאמרים הנוספים המתמקדים במדידת פנוטיפים, כולל התנהגות.

דגי מערות הפחיתו באופן דרמטי את השינה ושינו את השעון הביולוגי 36,37,38. זה מהווה הזדמנות מרגשת לחקור את התרומה של גנטיקה וסביבה לשונות בשינה אצל בעלי חוליות. Jaggard et al. 39 מראים כיצד לבנות מערכת מחומרים זולים שניתן להשתמש בהם כדי לתעד שינה בשלבי חיים שונים ובהקשרים שונים. יתר על כן, הם מתארים כיצד לבצע אוטומציה של מעקב אחר דגים במערך זה ולהשיג מדידות כמותיות לשינה ותנועה. הטכניקה שלהם ישימה לבדיקות תרופות וגנטיות בתפוקה גבוהה, כמו גם למחקרי מיפוי גנטי מסורתיים.

בנוסף לשינה מופחתת, דגי מערות פיתחו הבדלים בפעילויות תנועתיות הקשורות לחיפוש מזון, כולל זווית האכלה משתנה ומשיכת רטט 16,30,40. מרכזי להבנת האופן שבו פעילויות אלה התפתחו הוא קישורן לשינויים התפתחותיים. וורשאם ואח'. 41 מציגים שיטות לרישום התנהגויות ומתאם ביניהן עם שינויים בנוירו-מאסטים; מבנים מכניים-חושיים חיצוניים המגיבים לזרימת מים. הם מראים תחילה כיצד ליצור תאים לתיעוד רטט, משיכה ושינה, ומספקים תיאור מפורט כיצד לכמת את ההתנהגויות באמצעות תוכנה חופשית וסקריפטים הניתנים להתאמה אישית. לאחר מכן, הם מדגימים כיצד לדמיין נוירו-מאסטים בדגים בוגרים חיים באמצעות כתם מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי, ושוב, באמצעות תוכנה חופשית, כיצד לכמת את מספר הנוירו-מאסטים באופן אוטומטי למחצה. משיכת רטט ומספר נוירומסטים נמצאים בקורלציה23; השיטה שלהם מספקת פרוטוקול צעד אחר צעד לחקירת מערכת יחסים זו. ניתן להשתמש בשיטות של Jaggard ו-Worsham כדי לחשוף התנהגויות נוספות וניתן ליישם אותן גם על מינים אחרים של דגים. שיטות אלו מניבות תוצאות כמותיות ועקביות החיוניות לגילוי הבסיס הגנטי של האבולוציה ההתנהגותית.

טכניקות מודרניות למדידה ומניפולציה של תפקוד גנים דחפו מחקרים אבולוציוניים מהשוואה למכניסטית. יחד, המאמרים באוסף שיטות זה משמשים כספר הדרכה לביצוע חקירות של תפקוד גנים ב-A. mexicanus. בעוד שחוקרים חשפו הבדלים מרתקים במורפולוגיה, בפיזיולוגיה ובהתנהגות בין פני השטח למערה, ישנן תכונות רבות שעדיין לא נחקרו בפירוט, וסביר להניח שעוד לגלות. ככל שנעשית עבודה נוספת, הדג הקטן הזה ימשיך להשפיע רבות על הבנתנו את האבולוציה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מכירים במימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (NH089934, DK108495). פ' ליל וא' פאוורס מוכרים לעריכה.

מקורות

  1. Mitchell, R. W., Russel, W. H., Elliot, W. R. Mexican eyeless characin fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. Special Publications, the Museum Texas Tech University. 12, (1977).
  2. Elliott, W. R. Cave Exploration and Mapping in the Sierra de El Abra Region. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , 9-40 (2015).
  3. Herman, A., et al. The role of gene flow in rapid and repeated evolution of cave-related traits in Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Molecular Ecology. 27, 4397-4416 (2018).
  4. Rohner, N., et al. Cryptic variation in morphological evolution: HSP90 as a capacitor for loss of eyes in cavefish. Science (80). 342, 1372-1375 (2013).
  5. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
  6. Lyon, A., Powers, A. K., Gross, J. B., O'Quin, K. E. Two - Three loci control scleral ossicle formation via epistasis in the cavefish astyanax mexicanus. PLoS One. 12, (2017).
  7. Atukorala, A. D. S., Franz-Odendaal, T. A. Genetic linkage between altered tooth and eye development in lens-ablated Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  8. Gore, A. V., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2, 1155-1160 (2018).
  9. Sumner-Rooney, L. The kingdom of the blind: disentangling fundamental drivers in the evolution of eye loss. Integrative and Comparative Biology. , (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
  11. Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive Evolution in the Mexican Cave Tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
  12. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evolution & Development. 10, 196-209 (2008).
  13. Stahl, B. A., Gross, J. B. Alterations in Mc1r gene expression are associated with regressive pigmentation in Astyanax cavefish. Development Genes and Evolution. 225, 367-375 (2015).
  14. McCauley, D. W., Hixon, E., Jeffery, W. R. Evolution of pigment cell regression in the cavefish Astyanax: A late step in melanogenesis. Evolution & Development. 6, 209-218 (2004).
  15. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
  16. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15(2015).
  17. Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220, 284-293 (2017).
  18. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. Elife. 7, (2018).
  19. Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the mexican cavefish. Brain, Behavior and Evolution. 80, 233-243 (2012).
  20. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 9668-9673 (2015).
  21. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
  22. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  23. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20, 1631-1636 (2010).
  24. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K. Modularity and sense organs in the blind cavefish, Astyanax mexicanus. Evolution and Development. 8, 94-100 (2006).
  25. Hinaux, H., et al. Sensory evolution in blind cavefish is driven by early embryonic events during gastrulation and neurulation. Development. 143, 4521-4532 (2016).
  26. Blin, M., et al. Developmental evolution and developmental plasticity of the olfactory epithelium and olfactory skills in Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  27. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441, 328-337 (2018).
  28. Powers, A. K., Boggs, T. E., Gross, J. B. Canal neuromast position prefigures developmental patterning of the suborbital bone series in Astyanax cave- and surface-dwelling fish. Developmental Biology. 441, 252-261 (2018).
  29. Rohner, N. "Out of the Dark" Cavefish Are Entering Biomedical Research. Zebrafish, Medaka, and Other Small Fishes. , 253-268 (2018).
  30. Yoshizawa, M., et al. The evolution of a series of behavioral traits is associated with autism-risk genes in cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18, 89(2018).
  31. Stockdale, W. T., et al. Heart Regeneration in the Mexican Cavefish. Cell Reports. 25, 1997-2007 (2018).
  32. Peuß, R., et al. Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  33. Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  34. Riddle, M., Martineau, B., Peavey, M., Tabin, C. Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  35. Stahl, B. A., et al. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  36. Duboué, E. R., Keene, A. C. Investigating the Evolution of Sleep in the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , 291-308 (2015).
  37. Frøland Steindal, I. A., Beale, A. D., Yamamoto, Y., Whitmore, D. Development of the Astyanax mexicanus circadian clock and non-visual light responses. Developmental Biology. , (2018).
  38. Carlson, B. M., Gross, J. B. Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 208, 114-129 (2018).
  39. Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  40. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16933-16938 (2013).
  41. Worsham, M., et al. Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish. Journal of Visualized Experiments. , (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Astyanax MexicanusGene Function ManipulationGamete CollectionIn Vitro FertilizationBehavioral TrackingNeuromast ImagingSleep MeasurementsLocomotor ActivityWhole mount In Situ HybridizationPost larval PhenotypesImmunohistochemistryJournal Of Visualized Experiments
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.