מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Zoe  T. Cook; Nicole  L. Brockway; Tamily A. Weissman

doi:10.3791/60593

Method Article

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

DOI:

10.3791/60593

⸱

March 23rd, 2020

Zoe T. Cook¹ , Nicole L. Brockway¹ , Tamily A. Weissman¹

¹Biology Department, Lewis & Clark College

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח מערכת העצבים של בעלי החוליות דורש תיאום מדויק של התנהגויות סלולר מורכבות ואינטראקציות. השימוש ברזולוציה גבוהה בטכניקות הדמיה vivo יכול לספק חלון ברור לתוך תהליכים אלה באורגניזם החי. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר תאים וצאצאים שלהם בזמן אמת כטופסי מערכת העצבים. בשנים האחרונות, פיתוחים טכניים בטכניקות ריבוי צבעים הרחיבו את סוגי השאלות שניתן לחקור. את הגישה ססגוניות במחקר ניתן להשתמש כדי לא רק להבדיל בין תאים כמו, אלא גם כדי לצבוע את הצבעים שיבוטים שונים מרובים של תאים הקשורים כי כל אחד מהם שואבים תא מחולל קדמון אחד. זה מאפשר ניתוח שושלת היוחסין של שיבוטים רבים והתנהגויות שלהם בו זמנית במהלך הפיתוח. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות מתויג תאים על בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח. הדבר שימושי במיוחד לאחר האינטראקציות הסלולריות בין תאים, שקשה לתייג בצורה מסובכת באמצעות צבעים מונחי-מיזם מסורתיים. הגישה שלנו יכולה לשמש למעקב אחר קשרי השושלת בין מספר שיבוטים שונים בו זמנית. ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו באמצעות טכניקה זו מספקות מידע עשיר שניתן להשוותו באמצעות מניפולציות גנטיות או תרופתי. בסופו של דבר התוצאות שנוצרו יכולים לעזור לענות על שאלות סיסטמטית על איך מערכת העצבים מתפתחת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, בריכות של תאים מיוחדים המקצועית לחלק שוב ושוב באזורים מתרבים, הפקת מערכים מגוונים של תאים ביתי. התאים שנולדו במהלך תקופה התפתחותית זו לאחר מכן להבדיל ולנסוע כדי ליצור את האיברים המתהווה. במערכת העצבים, כגון ושלתי glia להצמיח נוירונים בוגרים באזורים חדרית. כמו נוירונים לנדוד הרחק מן החדרים ובוגרים, הרקמה המתרחב בסופו של דבר יוצר את המבנים מורכבים מאוד של המוח¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. התיאום בין חלוקת ושלתי ובידול והגירה של נוירונים יקבעו את הגודל, הצורה והתפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) ב לואיס & קלארק קולג '.

1. הזרקת מיקרובדג עוברי

להגדיר סוג פראי, בוגרים דג זברה הפרדה מין טנקים הזיווג אחר הצהריים לפני ביצוע מיקרו זריקות³⁹^,⁴⁰.
הכן את פתרון הדנ א. בבוקר המיקרוזריקות לדלל hsp: zebrabow¹¹ ה-DNA פלמיד לריכוז של ~ 10 ng/Μl ב 0.1 mM kcl, יחד עם 2.5% פנול אדום ו 3.75 u מrecombinase האנזים.
בצע מיקרוזריקות של פתרון ה-DNA לתא אחד של העוברים דג זברה בתוך 45 מינימום של הפריה³⁹^,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות vivo הדמיה מרובת הצבעים בגישה להדמיה המתוארת כאן. אנו מראים כי בראיקשת צבע מקודד שיבוטים של תאים באזור החדרית ההתרבות של הפיתוח דג זברה המוח¹⁴ (איור 1).

בדרך כלל, כאשר התאים שכותרתו המוח המסומנים היו מסודרים לאורך סיבים רדיאליים מסוימים, הם חלקו את אותו צבע (איור 1D), אשר ניתן לכמת כמו משקולות ערוץ RGB היחסי (איור 1d). זה מרמז כי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחיש שיבוטים של תאים מחולל קדמון ונוירונים בפתח המוח המתפתח ולעקוב אחריהם בvivo באמצעות ברייבוו ומיקרוסקופיה מיקרוסקופית הזמן¹¹. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה ללימודי חוץ גופית או לשעבר vivo היא היכולת להתבונן ישירות באזור ההתרבות של המוח בעלי החוליות בסביבתו הטבעית לאורך זמן. טכניקה זו בונה על המחקרים הקודמים שכותרתו שיבוט יחיד באמצעות וקטורים retroviral יעיל. לעומת זאת, השימוש hsp: zebrabow לבנות את הצבע קודים שיבוטים רבים במקביל, המאפשר לעקוב אחר השושלת ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לי. א. פאן, י. ליבט ו-זי טוביאס לתרומות טכניות ואינטלקטואליות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (פרס 1553764) וקרן הצדקה של אמ. ג'יי מרדוק.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
פיפטת העברה של 1.5 מ"ל (קצה עדין)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	מדולל ל-0.2 מ"מ ב-E3 למניעת פיגמנטציה של עובר
50 מ"ל צינורות חרוטיים	קורנינג	352070	לעוברים מזעזעי חום
6 פאונד חוט דיג ניילון	SecureLine	NMT250	להכנת מניפולטורים עוברים
7.5 מ"ל צינור העברה	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl₂	Sigma	C3881	עבור E3
צמר גפן	פוריטן	867-WC ללא דבק	להכנת מניפולטורים עובריים
Cre recombinase	ניו אינגלנד Biolabs	M0298M
אמבטיה יבשה דיגיטלית	Genemate	490016-616	משמש לאחסון LMA ב-42 מעלות; C
			דיסקציה אפיפלואורסצנטי
צינורות נימי זכוכית	Precision Instruments	TW100F-4
Incubator	Forma Scientific	3158	לשמירה על עוברים ב-28 מעלות; C
תבניות צלחת הזרקה	כלי מדע אדפטיביים	TU-1
אמבט מים איזוטמפ	פישר סיינטיפיק	2320	לעוברים מזעזעים בחום
KCl	AMRESCO	0395	עבור E3 ולתמיסת DNA להזרקות
מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	ליצירה לוחות הזרקת
אגרוז אגרוז נמס נמוך (LMA)	AMRESCO	J234
מיכלי הזדווגות	Aquaneering, Inc.
ZHCT100 מתילן כחול	סיגמא	M9140	עבור E3
MgSO₄	Sigma	9397	עבור E3
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 טריקאין-S	ווסטרן כימיקלים, בע"מ		ציר עשוי ב-4 מ"ג/מ"ל במי אוסמוזה הפוכה (RO), ולאחר מכן הוסיף טיפה ל-E3 לריכוז סופי של 0.2 מ"מ להרדמת עוברים
NaCl	J.T. Baker	4058-01	לצלחות פטרי E3
(90 מ"מ, 60 מ"מ)	Genesee Scientific	32-107G	לשיכון עוברים ויצירת תא הדמיה (60 מ"מ)
פנול אדום	Sigma	P0290
סמני טבעת תפרים רכים	תלתן נידלקראפט, בע"מ	354	ליצירת תא הדמיה עם צלחת פטרי
דבק סופר (בקרת אולטרה ג'ל)	Loctite	1363589	להכנת מניפולטורים של עוברים
מחטי מזרק	בקטון דיקינסון	BD329412	לעוברים

היקף World

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles