הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60593

⸱

23 במרץ 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

במאמר זה

סיכום

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

תקציר

פיתוח מערכת העצבים של בעלי החוליות דורש תיאום מדויק של התנהגויות סלולר מורכבות ואינטראקציות. השימוש ברזולוציה גבוהה בטכניקות הדמיה vivo יכול לספק חלון ברור לתוך תהליכים אלה באורגניזם החי. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר תאים וצאצאים שלהם בזמן אמת כטופסי מערכת העצבים. בשנים האחרונות, פיתוחים טכניים בטכניקות ריבוי צבעים הרחיבו את סוגי השאלות שניתן לחקור. את הגישה ססגוניות במחקר ניתן להשתמש כדי לא רק להבדיל בין תאים כמו, אלא גם כדי לצבוע את הצבעים שיבוטים שונים מרובים של תאים הקשורים כי כל אחד מהם שואבים תא מחולל קדמון אחד. זה מאפשר ניתוח שושלת היוחסין של שיבוטים רבים והתנהגויות שלהם בו זמנית במהלך הפיתוח. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות מתויג תאים על בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח. הדבר שימושי במיוחד לאחר האינטראקציות הסלולריות בין תאים, שקשה לתייג בצורה מסובכת באמצעות צבעים מונחי-מיזם מסורתיים. הגישה שלנו יכולה לשמש למעקב אחר קשרי השושלת בין מספר שיבוטים שונים בו זמנית. ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו באמצעות טכניקה זו מספקות מידע עשיר שניתן להשוותו באמצעות מניפולציות גנטיות או תרופתי. בסופו של דבר התוצאות שנוצרו יכולים לעזור לענות על שאלות סיסטמטית על איך מערכת העצבים מתפתחת.

מבוא

בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, בריכות של תאים מיוחדים המקצועית לחלק שוב ושוב באזורים מתרבים, הפקת מערכים מגוונים של תאים ביתי. התאים שנולדו במהלך תקופה התפתחותית זו לאחר מכן להבדיל ולנסוע כדי ליצור את האיברים המתהווה. במערכת העצבים, כגון ושלתי glia להצמיח נוירונים בוגרים באזורים חדרית. כמו נוירונים לנדוד הרחק מן החדרים ובוגרים, הרקמה המתרחב בסופו של דבר יוצר את המבנים מורכבים מאוד של המוח1,2,3,4,5,6. התיאום בין חלוקת ושלתי ובידול והגירה של נוירונים יקבעו את הגודל, הצורה והתפקוד של המוח בסופו של דבר, משפיעה ישירות על התנהגות7,8,9,10. למרות ששליטה הדוקה על תהליכים אלה חיונית באופן ברור להתפתחות המוח הרגילה, המנגנונים הגלובליים המווסתים את הדינמיקה הזאת אינם מובנים היטב. כאן אנו מתארים כלי לחקר פיתוח מערכת העצבים ברזולוציה התאית, המאפשר לחוקרים להמחיש תאים מחולל קדמון ונוירונים ב vivo המוח המתפתח מתפתח עם ברייקשת ולעקוב אחר התנהגותם לאורך זמן דרך הזמן לשגות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד11. הגישה יכולה גם להיות מותאמת לדמיין חלקים אחרים של העובר המתפתח.

כדי להתבונן ולהבחין בין תאים במוח מתפתח דג זברה, יש לנו להתאים את טכניקת התיוג תא במוח11. ברייבוו bow מנצל באופן אקראי, ביטוי קומבינטורית של שלושה חלבונים פלורסנט ברורים (FPs) כדי לסמן אוכלוסיה של תאים. בעוד ביטוי ברירת המחדל של ביטוי המוח הוא אדום FP, שילוב מחדש על ידי היצורים האנזים recombinase תוצאות ביטוי של mCerulean (חלבון פלורסנט ציאן, CFP) או חלבון פלורסנט צהוב (yfp)12,13. הסכום המשולב של כל FP מבוטא בתא נותן לו גוון ייחודי, המאפשר הבחנה חזותית ברורה מתאים שכנים. בנוסף, כאשר תא מקדמון מתחלק, כל תא בת יהיה לרשת את הצבע מתא האם, הפקת שיבוטים מקודד צבע ומאפשר לחוקרים לעקוב אחר שושלת היוחסין11,14. בזמן ששימש במקור לניתוח המעגלים העצביים בעכברים12, המוח כבר ביטא במגוון רחב של אורגניזמים מודל, כולל דג זברה15.

הטכניקה שלנו בונה על תיוג ססגוניות הקודם ושיטות הדמיה לתמונה ישירה שיבוטים מקודד בצבעים לאורך זמן בחיים zebrafish. בשל שקיפות אופטית שלהם העוברים, דג דג זברה מתאים גם ניסויים הדמיה16, ומחקרים קודמים יש מנוצל המוח באמצעות בראבפיש כדי ללמוד מגוון של רקמות, כולל מערכת העצבים11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. היכולת לדמות במישרין אל תוך האורגניזם החי, יחד עם התפתחות הרחם המהירה שלהם לשעבר, לעשות דג זברה מודל יקר ערך של פיתוח בעלי חוליות. בניגוד למוח היונקים, האזור המתרבים כולו של המוח המלא של הדגים הוא זמין להדמיה ללא הפרעה לסביבה אנדוגניים שלה6. הדבר מאפשר לערוך ניסויים באורגניזם החי, ולא בהכנות מחוץ לגוף או ברקמה קבועה. בניגוד לניסויים הדמיה קבועה, במחקרים vivo לאפשר עיצוב האורך, הפקת שעות של נתונים שניתן לנתח עבור דפוסי, ובכך להגדיל את הסבירות להתבוננות אירועים נדירים יחסית. בהתאם למהירות ולאורך של האירועים המעניינים, החוקרים יכולים לבחור לבצע קצר (1 – 2 h) או ארוך (עד ~ 16 h) זמן הדמיה של ניסויים. באמצעות החום דג זברה מיזם ההלם 70 (hsp70, hsp), ביטוי המוח יכול להיות מבוקרת באופן זמני28,29. בנוסף, ביטוי הפסיפס הנגרמת על ידי מקדם זה מתאים גם לתיוג ומעקב אחר שיבוטים רבים11.

היכולת לזהות באופן חזותי שיבוטים מרובים בתוך המוח החי הוא יתרון של שיטה זו. חשוב מחקרים קודמים שחקרו את התפקיד של שיבוטים בתוך פיתוח של מערכת העצבים מנוצל וקטורים retroviral יעיל לסמן תא מחולל קדמון יחיד וצאצאו באמצעות בודד FP או אחרים בחלבון דמיינו. תיוג כזה מאפשר לחוקרים להתבונן שיבוט יחיד לאורך זמן, או בתוך מבחנה או בvivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. בניגוד לשיטות לעקוב אחר ההתנהגות של התאים בתוך שיבוט אחד, הצבעים ברורים של המוח לאפשר לחוקרים להתבונן הדינמיקה בין שיבוטים. בנוסף, על ידי שימוש בברקידה כדי לתייג שיבוטים רבים בתוך המוח, נתונים נוספים על התנהגות שבטיים נאסף ביחס לטכניקות התווית שיבוט יחיד11. וחשוב מכך, ניתן להרחיב את הגישות המתוארות כאן כדי ליצור השוואות התפתחותיות בין דגים שעברו מניפולציות גנטיות או פרמקולוגית שונות18. בסך הכל, יתרונות אלה לגרום לפקיעה זמן ב vivo קונפוקלית יקוד הדמיה של הברקשת-ביטוי דג זברה אידיאלי עבור חוקרים לחקור את הפיתוח של מערכת העצבים בעלי חוליות, במיוחד אלה המעוניינים בתפקיד של שיבוטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) ב לואיס & קלארק קולג '.

1. הזרקת מיקרובדג עוברי

  1. להגדיר סוג פראי, בוגרים דג זברה הפרדה מין טנקים הזיווג אחר הצהריים לפני ביצוע מיקרו זריקות39,40.
  2. הכן את פתרון הדנ א. בבוקר המיקרוזריקות לדלל hsp: zebrabow11 ה-DNA פלמיד לריכוז של ~ 10 ng/Μl ב 0.1 mM kcl, יחד עם 2.5% פנול אדום ו 3.75 u מrecombinase האנזים.
  3. בצע מיקרוזריקות של פתרון ה-DNA לתא אחד של העוברים דג זברה בתוך 45 מינימום של הפריה39,41. הכנס כ 4.2 nL של פתרון זה לתוך העובר כל, שווה ערך ל ~ 42 pg של DNA פלמיד.
    הערה: השלב המיקרו-הזרקה יכול להיות מושמט אם הטרנסגניים, קו הבארבי-ביטוי הביטוי הוא הזדווג במקום, כגון tg (ubi: דג זברה)15 ו Tg (neurod: דג זברה)18. ביצוע זריקות מיקרו יכול להיות יתרון כי זה מאפשר לחוקרים נכייל מספר העתק וצפיפות תוויות. יתר על כן, בונה ה-DNA השני שתגים או מניפולציה מוצר גנטי מסוים ניתן להזריק לצד ברייבוו במידת הצורך (למשל, חלבון פלורסנט הרבה אדום המשלים את ברייבוו18).
  4. שמור עוברים מוזרק בצלחות פטרי של E3 בינוני39 בחממה 28 ° c עבור 24 שעות.

2. זעזוע חום כדי לגרום לביטוי ברייקד

הערה: אם ה-DNA מוזרק או המזריקו התבטא אינו מנצל את היזם hsp70 כדי לכונן את הביטוי, את הצעד הלם חום ניתן לדלג, עוברים בריאים יש להעביר מיד phenylthiourea (PTU) ב 24 h הפריה פוסט (hpf).

  1. ב 24 hpf, cull מתים עוברים מעוותים מהקבוצה של עוברים מוזרק. אז, להעביר את העוברים בריאים לצינור 50 mL, עם עד 20 עוברים/צינור.
  2. ממלאים את הצינורות עם 10 מ"ל של E3. מניחים כובע על גבי כל צינור, אבל לא סוגרים היטב.
  3. מניחים את מתלה הצינורית המכילה את צינורות 50 mL זקוף באמבט מים 37 ° c. ודא כי רמת המים באמבט גבוהה יותר מאשר רמת E3 בצינורות ולהשאיר אותם 80 כדי 90 דקות.
  4. הסירו את מתלה הצינורית עם העוברים מאמבט המים וחזרו לחממה הזקופה ב -28 ° c. אפשר עד 1 h ל-E3 להתקרר והעוברים מחדש בהדרגה את האקלים לטמפרטורה. ואז, להעביר את העוברים לצלחות פטרי של 0.2 mM PTU ב E3 מחומם בחממה כדי למנוע פיגמנטציה של עוברים.
    זהירות: PTU הוא כימיקל רעיל, כי יש לטפל בזהירות ולהיפטר כראוי. . לבישת כפפות זה מוצע

3. הקרנת עוברים לביטוי ברייבוו

  1. ב 2 כדי 4 h לאחר ההלם החום, לבחון את העוברים תחת מיקרוסקופ רגיל לניתוח פלואורסצנטית עבור ביטוי של CFP או YFP, אשר מצביע על שילוב מוצלח בריינרד ברייקד (מביטוי ברירת המחדל של dTomato).
    הערה: אם זמינות מספר אפשרויות מסנן פלואורסצנטית, ההקרנה עבור CFP היא הדרך היעילה ביותר לזיהוי דגים משולבים היטב. אם מסנני CFP ו-YFP אינם זמינים, YFP יכול להיות במעומעם גם תחת חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מסננים עקב חפיפה בפרופילים ספקטרלו שלהם.
  2. לבחור עוברים עם ביטוי FP חזק לאורך ולהעביר למנה נפרדת עם PTU. עוברי תמונה ביום 1 הפריה הודעה (dpf; 28 hpf או מאוחר יותר) או לשמור על העוברים PTU ו התמונה ב 2 או 3 dpf.

4. עוברים התקנה עבור ב Vivo הדמיה

  1. לפני יום הניסוי, להכין את הכלי מניפולציה לחדר הדמיה והעובר.
    1. הכן את חדר ההדמיה על ידי הדבקת בזהירות טבעת פלסטיק למרכז של צלחת פטרי 60 מ"מ.
    2. באופן אופציונלי, להכין מניפולטור מותאם אישית העובר כדי להעביר עוברים בתוך הצלחת העוברים האוריינט תוך כדי הרכבה. בניית מניפולטור על ידי הדבקת אורך קטן של קו דיג ניילון (~ 1/2 בתוך, ~ 6 ליברות) עד לסופו של מקל כותנה עץ לנקות כי כבר נחתך ~ 4 אורך.
  2. אם יש צורך (כלומר, הדמיה ב 2 dpf או מוקדם יותר), לפני טעינת העוברים deורורonate באמצעות מזרקים תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  3. . מורדם מאוד עוברי דגים
    1. מילוי צלחת פטרי 60 מ"מ בחצי הדרך עם E3 ולהוסיף 5 – 6 טיפות של 4 מ"ג/mL MS-222 Tricaine-S לריכוז הסופי של ~ 0.2 mM. . מערבולת לערבב
      זהירות: Tricaine צריך להיות מטופל בזהירות ולהיפטר כראוי.
    2. העברת עוברים מ PTU אל פתרון tricaine, להבטיח כמו PTU קטן מועבר ככל האפשר. בעוד הרפלקסים דגים צריך לחדול לאחר 1 – 2 דקות, להשאיר את העוברים בטריקיין עד 10 דקות כדי להבטיח ההרדמה יסודית עבור ניסויים הדמיה זמן.
    3. ודא כי העוברים מורדם כראוי. העריכו את רפלקס ההבהיל על ידי נגיעה זנבות העובר בעדינות עם העובר מניפולטור. אם התנועה הרפלקס נצפתה, להוסיף טיפה נוספת של tricaine לצלחת רחוק ככל האפשר ומערבולת לערבב. התבוננו בקצב לב העובר תחת טווח החיתוך. אם הוא איטי באופן חריג, להוסיף טיפות נוספות של E3 לצלחת כדי להפחית את הריכוז tricaine.
  4. . בסדר.
    1. להעביר את הדג למרכז הטבעת פלסטיק בתוך חדר ההדמיה ולהסיר את העודף E3 ככל האפשר באמצעות העברה משופעת בצנרת.
    2. באמצעות פיפטה העברה נקייה, לכסות את הדג עם 1.0% נמוך להמיס agarose (LMA) ב E3 מאוחסן ב 42 ° c ולמלא את טבעת הפלסטיק כולה עם שכבה דקה של העלה. השתמש בפיפטה העברה כדי למשוך בעדינות את העוברים לתוך הקצה הצינורות ובחזרה לתוך הצמח מבלי להציג בועות אוויר.
    3. לפני שעלה מתקשה, להשתמש במהירות העובר מניפולטור כדי לכוון את הדגים כראוי. אם הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, הצב את העוברים קרוב למשטח העליון של הצמח ככל האפשר. הצב את העוברים במקביל לתחתית חדר ההדמיה עם הזנב ישר.
      הערה: עבור הדמיה מוחית מראש, ניתן למקם את העוברים בתצוגה ממשונן. יש לנקוט את הטיפול כדי לוודא שראשיהם של העוברים אינם טובעים בעוד האגקם עדיין נוזלי. כיוונים אחרים עשויים להיות מתאימים למקד רקמות אחרות המתפתחות להדמיה. עבור מיקרוסקופים הפוכים, הרכבה ייעשה באופן שונה, בדרך כלל מיקום הדג קרוב לתחתית צלחת פטרי זכוכית.
  5. המתינו עד שהוא הרדן, ואז למלא את חדר ההדמיה עם E3. הוסף E3 ככל האפשר כדי להסביר את האידוי במהלך ההדמיה.

5. זמן פקיעה הדמיה Confocal וקד של פיתוח דג Zebrafish המוח

  1. מניחים את חדר ההדמיה על המיקרוסקופ הקונטואני כהכנה להדמיה.
    1. מניחים את חדר ההדמיה עם הדג ו-E3 על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
    2. בחר מטרה עם צמצם מספרי גבוה מרחק עבודה ארוך, כגון מטרה טבילה 20x מים (1.0 NA).
    3. מצא אזור עם תיוג צפוף ובהיר כראוי של סוג התא (ים) של עניין.
      הערה: מערכת טמפרטורה מבוקרת/מכשיר על המיקרוסקופ עשוי לשמש גם כדי להסדיר את הטמפרטורה והלחות במהלך הפעלות הדמיה ארוכה. זה יכול להקטין את האידוי.
  2. הגדר את פרמטרי הרכישה. להדמיה בבררכיל
    1. תמונה כל ערוץ FP ברציפות. אם אתה משתמש בתוכנה מסחרית (למשל, תוכנה זן), זה נעשה על ידי הכנת שלושה "מסלולים". השתמש לייזר ארגון להלהיב CFP ב 458 nm ו YFP ב 514 nm. השתמש DPSS 561 לייזר ננומטר לרגש Dעגבניה. איסוף פליטות בין 463-509 nm עבור CFP, 519 – 555 nm עבור YFP, ו 566 – 691 nm עבור dTomato.
    2. עבור תצוגה על המסך, הקוד CFP ככחול, YFP כצהוב, ו-dTomato כאדום.
      הערה: הגדרות אלה ישתנו בהתאם לקווי לייזר ותכונות אחרות זמינים במיקרוסקופ קונפוקלית וקד. כדי להגדיל את מהירות ההדמיה, הערוצים CFP ו-dTomato יכולים להיות מובחנות בו מבלי לעבור בגלישה ניכרת. אם מתבצע גם הדימות של FP נפרד, כגון FP בצבע אדום-הרבה, ניתן להבחין בתמונה זו ברצף או בו ב-YFP.
    3. הגדר את פרמטרי ההדמיה הכלליים כדי לקחת תמונות של 16 סיביות עם רזולוציה של לפחות 1024 x 1024 ובממוצע פעמיים. כוונן את הזום בהתאם לאזור ואת סוג התא של עניין (כלומר, עבור הדמיה המוח החודש עם מטרה 20x הזום יהיה נע בין 1.0-2.5). למקסם את שדה התצוגה כדי לאפשר צמיחה של הדג לאורך זמן.
    4. צפייה ברצועה אחת בכל פעם (וביטול לייזרים אחרים כדי למנוע photobleaching לבנה), למטב את הגדרות הרכישה עבור כל FP בנפרד (למשל, כוח לייזר, גודל חריר, לצבור שפופרת פוטוליטיפייר, וכו ').
    5. בחר את טווח מחסנית Z לתמונה.
      הערה: עבור הפעלות הדמיה ארוכה (> 2 h), לקחת בחשבון כי הדג ימשיך לצמוח במהלך הדמיה, ובכך גם את השדה XY ו-Z מחסנית טווח צריך להסביר את זה עם חדר נוסף. אם הדמיה המוח החודש, כוללים שטח בשדה עבור הרקמה לעבור rostrally במהלך תקופת ההדמיה. יש לכלול גם מקום לגידול בממד Z. כלול בתמונה כ-10 – 20 יקרומטר מעל לאזור העניין, אם הדגים ממוקמים לתצוגה משונן או מועלת.
  3. כוונן פרמטרים עבור דימות בזמן הדמיה.
    1. בחר מרווח זמן. אורך מרווח נע בין 10 – 30 דקות לעקוב אחר mitotic ו האפוטוטיים האירועים במוח המתפתח מתפתח. אורך מרווח ישתנה בהתאם למהירות האירועים המעניינים והזמן הכולל שנדרש כדי ללכוד מחסנית Z אחת.
    2. בחר את אורך הפעלת ההדמיה. הפעלות הדמיה זמן בדרך כלל להתרחש בלילה והוא יכול להימשך לפחות 16 h.
  4. . תריץ את הניסוי
    הערה:     הדגים יכולים להיות מורדמים מיד לאחר הדמיה או גזור בקפידה מן agarose באמצעות מזרקים וחזר ל E3 להתאושש. הדגים ששוחזרו לאחר מכן ניתן לשחזר שוב בשלב מאוחר יותר, אף מיקום התא ועומק יהיה משמרת במהלך תקופה זו בשל הצמיחה הכוללת.

6. ניהול קבצים בזמן קפיצה

  1. יבא את קובץ התמונה לתוך תוכנת הניתוח.
    1. אם נעשה שימוש בתוכנת Zen, שמור את הקובץ בתבנית. czi לאחר השלמת רכישת התמונה. הקפד לשמור נתונים גולמיים בתבנית תואמת פיג'י42 ו/או תוכנות אחרות.
    2. יבא לתוך תוכנת פיג'י באמצעות BioFormats יבואן.
      הערה: קבצים בזמן הקפיצה יהיו גדולים ועשויים לדרוש כמויות משמעותיות של זמן וזיכרון לפתיחה לצורך ניתוח. לכן, מועיל להיות אסטרטגי באופן שבו הם נשמרים ונפתחים. זה יכול להיות שימושי כדי לשמור גירסה באיכות נמוכה יותר, כי ניתן לפתוח בקלות רבה יותר כדי לחפש אירועים של עניין על ידי עין.
  2. אם אתה משתמש בפיג, צור קבוצות מערכות קטנות וניהול יותר של קבצי מעבר זמן. צור קבוצות מערכות בין אם בזמן (למשל, הצגת מחסנית Z מלאה בנקודת הזמן הראשונה) או בעומק (למשל, הצגת הראשון 50 Z-סעיפים בכל פעם) על ידי לחיצה על תמונה| ערימות| כלים| בצע מחסנית משנה.

7. שבטים כמותיים ניתוח צבע של תמונות במוח

  1. למדוד את ערכי העוצמה האדום, הירוק והכחול (RGB) עבור תאי העניין בפיג.
    הערה:     הוראות אלה הן ספציפיות לניתוח תמונות בפיג. עם זאת, החוקרים עשויים להעדיף להשיג ערכי עוצמת RGB מתכוון בתוכנית תוכנה חלופית.
    1. ודא שהקובץ נחתך כהלכה כך שאין רווח שחור מסביב לקצות התמונה. החלל השחור יוריד באופן מלאכותי את מדידות העוצמה המינימליות הדרושות לניתוח. אם יש צורך לחתוך את הקובץ, בחר בלחצן בחירה מלבן וצייר אזור מעניין (ROI) סביב שדה התצוגה, למעט כל השטח השחור. לחץ על תמונה| חיתוך.
    2. הגדר את כלי המדידה כדי לקחת מידות משמעות, מינימום ומקסימום של ערך אפור. לחץ על נתח| קבע מדידות. ודא שתיבות הסימון עבור מינימום &Amp; ערך אפור מירבי וערך אפור ממוצע שתיהן נבחרו.
    3. הצגת קבצי הנתונים הגולמיים או תת-הערימות Z בפיג, מצא תאים מעניינים לניתוח צבע שבטים. במוח החלק האחר, המשובטים שיבוטים ניתן לזהות חזותית על ידי הגוון המשותף שלהם, כמו גם את האוריינטציה הרדיאלי שלהם. אין לבחור תאים הנמצאים בקשר קרוב, ולכן קשה לפתור אותם מתאים שכנים בצבע אחר. . זה עלול להיות קשה לכמת את הגוון שלהם
    4. חפש את מרכז Z של תא העניין באמצעות פס הגלילה z. לחץ לחיצה ימנית על לחצן בחירה אליפטית ובחר בלחצן בחירה אליפטית. כלי בחירה אחרים יתאימו לסוגי תאים שונים. צייר ROI אליפטי סביב המרכז ~ 2/3 של גוף התא.
    5. באמצעות פס גלילה C, בחר את הערוץ האדום (dtomato). קח את המדידה בעוצמה מרושעת עבור ערוץ זה על ידי בחירת ניתוח| . תמדודאת זה חזור עם אותו ההחזר ומישור מוקד עבור הערוצים הירוקים (YFP) וכחול (CFP) ושמור את כל ערכי העוצמה הממוצע.
    6. לחץ במקום כלשהו בתמונה כדי להסיר את ההחזר האליפטי של תא הריבית.
    7. למדידת רמות רקע לנורמליזציה, השתמש בפס הגלילה C ובחר בערוץ האדום (dtomato). קח את מדידת האינטנסיביות המינימלית עבור השדה כולו בערוץ זה על-ידי בחירה באפשרות ' נתח' | . תמדודאת זה חזור על אותו מישור מוקד עבור הערוצים הירוקים (YFP) וכחול (CFP) ושמור את כל ערכי העוצמה המינימלית.
  2. חישוב משקולות ערוץ RGB יחסיים לתאי הריבית.
    הערה:     ניתן לבצע חישוב של משקולות ערוץ RGB יחסיים מערכי אינטנסיביות אלה במגוון של תוכניות תוכנה, כגון Microsoft Excel או R43.
    1. לנרמל את מדידת העוצמה הממוצע של ה-ROI של התא עבור כל ערוץ על-ידי הפחתת העוצמה המינימלית מהשדה כולו באותו ערוץ ומישור מוקד.
    2. סכם את ערכי עוצמת ה-RGB המנורמל הממוצע מכל אחד מהערוצים כדי לאתר את עוצמת ה-RGB המנורמלת הכוללת עבור התא.
    3. חשב את משקל הערוץ היחסי עבור כל אחד מהערוצים על-ידי חלוקת ערך העוצמה המנורמל הממוצע עבור אותו ערוץ לפי עוצמת ה-RGB המנורמלת הכוללת.
  3. הצגת משקולות ערוץ RGB יחסי כחלקות טרנארי באמצעות חבילת טרנארי עבור R43,44. חלקות טרנארי שימושיות כדי להמחיש את האשכולות של צבעים דומים במרחב RGB תלת-ממדי.
  4. לחשב את מקדם התפשטות הצבע כדי לכמת את ההפרש בין צבעי תא.
    1. חשב את המרחק האוקלידי בין שני הצבעים במרחב RGB תלת-ממדי באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-1
      כאשר R, G ו-B הם משקלי ערוץ ה-RGB היחסי המחושב ב-7.2.
    2. כדי להקל על ההבנה, לנרמל את מרחק הצבע על ידי חלוקה על ידי √ 2, המרחק המקסימלי האפשרי בין צבעים, כדי לקבל מקדם התפשטות צבע בין 0 ו-1, כאשר 0 מציין בדיוק את אותו צבע ו 1 מציין צבעים שונים לחלוטין (למשל, אדום טהור וכחול טהור).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות vivo הדמיה מרובת הצבעים בגישה להדמיה המתוארת כאן. אנו מראים כי בראיקשת צבע מקודד שיבוטים של תאים באזור החדרית ההתרבות של הפיתוח דג זברה המוח14 (איור 1).

בדרך כלל, כאשר התאים שכותרתו המוח המסומנים היו מסודרים לאורך סיבים רדיאליים מסוימים, הם חלקו את אותו צבע (איור 1D), אשר ניתן לכמת כמו משקולות ערוץ RGB היחסי (איור 1d). זה מרמז כי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחיש שיבוטים של תאים מחולל קדמון ונוירונים בפתח המוח המתפתח ולעקוב אחריהם בvivo באמצעות ברייבוו ומיקרוסקופיה מיקרוסקופית הזמן11. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה ללימודי חוץ גופית או לשעבר vivo היא היכולת להתבונן ישירות באזור ההתרבות של המוח בעלי החוליות בסביבתו הטבעית לאורך זמן. טכניקה זו בונה על המחקרים הקודמים שכותרתו שיבוט יחיד באמצעות וקטורים retroviral יעיל. לעומת זאת, השימוש hsp: zebrabow לבנות את הצבע קודים שיבוטים רבים במקביל, המאפשר לעקוב אחר השושלת ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים לי. א. פאן, י. ליבט ו-זי טוביאס לתרומות טכניות ואינטלקטואליות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (פרס 1553764) וקרן הצדקה של אמ. ג'יי מרדוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיפטת העברה של 1.5 מ"ל (קצה עדין)Globe Scientific, Inc.134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Alfa AesarL06690מדולל ל-0.2 מ"מ ב-E3 למניעת פיגמנטציה של עובר
50 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג352070לעוברים מזעזעי חום
6 פאונד חוט דיג ניילוןSecureLineNMT250להכנת מניפולטורים עוברים
7.5 מ"ל צינור העברהGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881עבור E3
צמר גפןפוריטן867-WC ללא דבקלהכנת מניפולטורים עובריים
Cre recombinaseניו אינגלנד BiolabsM0298M
אמבטיה יבשה דיגיטליתGenemate490016-616משמש לאחסון LMA ב-42 מעלות; C
דיסקציה אפיפלואורסצנטי
צינורות נימי זכוכיתPrecision InstrumentsTW100F-4
IncubatorForma Scientific3158לשמירה על עוברים ב-28 מעלות; C
תבניות צלחת הזרקהכלי מדע אדפטיבייםTU-1
אמבט מים איזוטמפפישר סיינטיפיק2320לעוברים מזעזעים בחום
KClAMRESCO0395עבור E3 ולתמיסת DNA להזרקות
מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזרZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120ליצירה לוחות הזרקת
אגרוז אגרוז נמס נמוך (LMA)AMRESCOJ234
מיכלי הזדווגותAquaneering, Inc.
ZHCT100 מתילן כחולסיגמאM9140עבור E3
MgSO4Sigma9397עבור E3
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
MS-222 טריקאין-Sווסטרן כימיקלים, בע"מציר עשוי ב-4 מ"ג/מ"ל במי אוסמוזה הפוכה (RO), ולאחר מכן הוסיף טיפה ל-E3 לריכוז סופי של 0.2 מ"מ להרדמת עוברים
NaClJ.T. Baker4058-01לצלחות פטרי E3
(90 מ"מ, 60 מ"מ)Genesee Scientific32-107Gלשיכון עוברים ויצירת תא הדמיה (60 מ"מ)
פנול אדוםSigmaP0290
סמני טבעת תפרים רכיםתלתן נידלקראפט, בע"מ354ליצירת תא הדמיה עם צלחת פטרי
דבק סופר (בקרת אולטרה ג'ל)Loctite1363589להכנת מניפולטורים של עוברים
מחטי מזרקבקטון דיקינסוןBD329412לעוברים
היקף World

מקורות

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3(2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120(2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53(2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115(2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635(2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239(1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימוי Brainbowמערכת העצבים של דגי זברהתאי אב עצבייםניתוח שושלות קלונאליותפלואורסצנציה רב-צבעיתדימוי In Vivoמעקב אחר חלוקת תאיםזיהוי אפופטוזיסנדידה גרעינית בין-קינטית
מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.