מאמר שיטה

סיבוכים מופחתים לאחר חיבור מחדש עורקי במודל חולדה של השתלת כבד אורתוטופית

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60628

⸱

7 בנובמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Department of Immunology, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המטרה של מחקר זה היא לשנות את מודל השתלת כבד אורתוטופית חולדה כדי לייצג טוב יותר השתלת כבד אנושי ולשפר את הישרדות הנמען. השיטה המוצגת מחדש את זרימת העורקים הכבדים על ידי חיבור עורק הכבד המשותף של הכבד התורם לעורק הכבד התקין של הכבד הנמען.

תקציר

מודל השתלת כבד אורתוטופית חולדה (OLT) הוא כלי רב עוצמה ללמוד דחייה חריפה וכרונית. עם זאת, זה לא ייצוג מלא של השתלת כבד אנושי בשל היעדר חיבור מחדש עורקי. מתואר כאן הוא הליך השתלה שונה הכולל את ההתאגדות של חיבור מחדש של עורק הכבד (HA), המוביל לשיפור ניכר בתוצאות ההשתלה. עם זמן anhepatic ממוצע של 12 דקות ו 14 s, חיבור מחדש HA תוצאות זברה משופרת של הכבד מושתל ועלייה בהישרדות הנמען לטווח ארוך מ 37.5% כדי 88.2%. פרוטוקול זה כולל את השימוש באזיקים ומחזיקים בהדפסת תלת-ממד כדי לחבר את וורין הפורטל וקאווה וונה טהרה נחותה. זה יכול להיות מיושם לחקר היבטים מרובים של השתלת כבד, מתגובה חיסונית וזיהום להיבטים טכניים של ההליך. על ידי שילוב שיטה פשוטה ומעשית לחיבור מחדש עורקי באמצעות טכניקת microvascular, פרוטוקול OLT חולדה שונה זה מחקה מקרוב היבטים של השתלת כבד אנושי וישמש מודל מחקר יקר ורלוונטי קלינית.

מבוא

הנטל העולמי של מחלת כבד ממשיך לגדול, עם עלייה של 30% במקרי מוות הקשורים למחלות כבד בין השנים 2005 ל-20131,,2. השתלת כבד היא לעתים קרובות המפלט היחיד עבור חולים עם מחלת כבד בשלב הסופי. הכבד הוא האיבר המוצק השני בתדירות הגבוהה ביותר, ומספר השתלות הכבד שבוצעו ברחבי העולם עלה ב-7.25% בין השנים 2015 ל-20161,2. למרות השכיחות שלה, שיעורי ההישרדות לאחר ההשתלה הפכו קיפאון3,4,5. שיעור ההישרדות של 15 שנה החולה הוא דיווח להיות 53%, ואת 20 שנה שיעור ההישרדות החולה עשוי להיות נמוך כמו 21%3,5. אמנם יש יוזמות אימונוביולוגיה חדשות ומלהיבות שעשויות להוביל לטיפולים חדשים ותוצאות קליניות משופרות, אבל עדיין אין מודל בעלי חיים קטן ואמין שבו ניתן לבחון אותם.

מודל OLT חולדה היה בשימוש נרחב בחקירת השתלת כבד, כוללדחייה 6,7 ,,8,9,,10, עמידותחיסונית 11,השתלת איסכמיה-reperfusion8,פציעה 12,דיכוי חיסוני 13, ופציעה בעץהמרה 14,15,16,17. עם זאת, חיסרון של המודל בצורתו הנוכחית הוא התמליות והתמותה הגבוהה לאחר הניתוח18,19. זהו חסרון רציני המנוכה למבצע האנושי, והוא פוגע ביכולת להסיק מסקנות רלוונטיות קלינית מהמודל20.

בנוסף, חלק גדול של חולה זו ניתן לייחס לחיבור מחדש של עורק הכבד חסר או לא מושלם (HA)18. למרות צעד קריטי בהשתלת כבד אנושי, קשיים טכניים נוטים לסכן חיבור מחדש HA במודל OLT חולדה. כתוצאה מכך, צינור מרה (BD) anastomosis הוא קלוש ותוצאות שיעור גבוה של דליפת מרה ונמק BD21. מעבר לשכיחות הגבוהה שלסיבוכים מרה 22, היעדר זרימה עורקי משנה את הפיזיולוגיה של הכבד השתל לאחרהשתלה 23, עם היפוקסיה בשתל כבדהתורם 24 ונזק לכבד שנצפה באונהמודלק 19,25,26. חולדה OLT ללא חיבור מחדש עורקי גם נוטה לקדם פיברוזיס27. פרוטוקול OLT חולדה המתואר להלן מטפל בבעיות אלה על ידי שילוב שלב שחזור HA פשוט עם עכברוש שפורסם בעבר OLTשיטה 28, וכתוצאה מכך שימור של parenchyma הכבד ושיעורי הישרדות משופרים.

להשתלת כבד יש שלושה שלבים: (1) חילוץ של שתל הכבד מהתורם, (2) הכנת שתל הכבד התורם, ו-(3) החלפת הכבד הנמען בשתל הכבד. ההליך כולל מניפולציה של חמישה מבנים אנטומיים: קאווה וונה נחותה suprahepatic (SHVC), ויריד פורטל (PV), קאווה וונה נחותה אינפרא-הרפתית (IHVC), עורק הכבד (HA) ותעלות מרה (BD).

OLT בחולדה הוצג לראשונה על ידי לי ואח '. באמצעות anastomosis microsuture של SHVC, PV ו- IHVC, וטכניקה משיכה דרך עבור BD29. מודל זה שופרה מאוחר יותר באמצעות הטכניקה שני שרוול בשנת 197930. מאז, הוצעו מספר טכניקות חלופיות, כאשר הרוב מתמקדים באנסתומוזיס ורתי ובשימוש בטכניקה דו-שרוולית עם כמה שינויים31. למרות ANastomosis HA תואר בעבר במודל OLT חולדה באמצעות טכניקות כגון microsuture, שרוול, שרוולים תוך לומים26,,31, 32,33,,34,טכניקותאלה דורשות לעתים קרובות כישורי מיקרוכירורגיים מאומנים מאוד, לשנות באופן משמעותי פיזיולוגיה חולדה, הם נפגעים על ידי פקקת ו / או סיבוכים biliary27,35.

יתר על כן, הבחירה של הליך כירורגי יכול גם להשפיע על הזמן anhepatic (זמן מ הידוק PV כדי reperfusion של שתל באמצעות PV מחדש), שהוא קריטי להצלחה של השתלת כבד חולדה. באופן ספציפי, שיעורי הישרדות גבוהים נצפו עם זמני anhepatic של 15-20 דקות36, ו 30 דקות הוא הגבולהעליון להצלחה 37,38. לכן, המטרה של שיטה זו היא ליישם מודל OLT עכברוש כירורגי פחות פולשני וקלות יותר לאימוץ כי הוא מסוגל לחבר מחדש את עורק הכבד, לקדם זיגה יעילה של הכבד המושתל, לשמור על זרימה לציבר מרה המטופל, ולשמר את מצבו הפיזיולוגי של המטופל.

מפורטים הנה כל השלבים של פרוטוקול מתוקן זה, כולל מניפולציה של תא המטען הצליאק של הכבד התורם, כמו גם את השימוש של 1) סטנט 1.5 מ"מ לבצע חיבור שרוול מחוץ לאלומיניום עם המטופל תקין HA, 2) תפר פועל לשחזור SHVC, 3) שני אזיקי פלסטיק בהדפסת 3D לשחזור PV ו- IHVC39,40, 4) חיבור מחדש של שרוול מיקרווסקולרי עבור HA18,27,41 ו- 5) טכניקת סטינגטון BD שתוארהקודם לכן 28. שני צעדים נוספים כלולים גם: סומק קר דרך PV, משטר אנטיביוטיקה המבוסס על ממצאים קודמים17. פרוטוקול OLT ממוטב זה ממזער סיבוכים ותחלואה perioperative ובאופן הדוק יותר מודלים הליך ההפעלה הכירורגית המועסקים בהשתלת כבד אנושי.

פרוטוקול

המחקר בוצע על פי ההנחיות של טיפול מכרסמים וניתוח, פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים רשת הבריאות של האוניברסיטה (UHN AUP #: 5840.3) ובהתאם להנחיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. המחקר משתמש חולדות לואיס זכר (זן LEW / SsNHsd), 12-14 שבועות בן, במשקל בין 250-300 גרם.

1. הגדרת ציוד

  1. החזק קצה חד של 31 G עם מחזיק מחט וצור מזרק קהה בצורת L על-ידי כיפוף הקצה שוב ושוב הלוך ושוב עד שהקצה ייפרץ. באמצעות קובץ מתכת שטוח, בוטה וחלק את קצה המזרק.
    1. חותכים את וווית הפורטל (PV) ו- infrahepatic קאווה וונה נחות (IHVC) אזיקים מהבסיס 3D מודפס עם אזמל(חומר משלים 1, חומר משלים 2, איור 1, דמות משלימה 1).
      הערה: תוכנת עיצוב תלת-ממדית משמשת לעיצוב האזיקים והמחזיקים, המודפסים על מדפסת תלת-ממד(טבלתחומרים) באמצעות שרף39הניתןלשחזור אוטומטי ,40 (מפרטים עבור כל החומר המודפס בתלת-ממד הכלול בחומר המשלים 1-10).
    2. השתמש אזמל חדש כדי לחתוך את קטטר 22 G לתוך צינור מלומט דו צדדי (3.5 מ"מ אורך). בעזרת האזמל, חרטו בעדינות קווים על פני השטח של סטנט צינור המרה (BD) (אל תחתוך דרך קיר הצינור). תחריטים אלה ימנעו קשרים מחליקים במהלך ההליך.
    3. השתמש אזמל חדש כדי לחתוך את קטטר 24 G לתוך צינור חד צדדי קצה מלומט (2.0 מ"מ אורך), וליצור כמה שריטות על פני השטח של סטנט עורקים חדש.
      הערה: מנע צמצום או צמצום של לומן של סטנט BD על-ידי הימנעות מיישום הלחץ על סטנט. אם סטנט מצטמצם או חסם, הישרדותו של המטופל תיפגע על ידי חסימה מרה.

2. פעולת התורם

  1. הגדר משטח חום ל-37°C והמקם אותו מתחת לפלטפורמה הכירורגית. הפעל את צג הטמפרטורה כך שטמפרטורת הליבה של העכברוש יכולה להיות מנוטרת באמצעות בדיקה פי הטבעתית. תארגן את אפליקציית ההרדמה של ההרדמה.
    הערה: במהלך הניתוח, לפקח על עומק ההרדמה על ידי מיקום קצב הנשימה, קצב הלב, צבע של האיברים / קרום רכי, ונוכחות של כל רפלקסים גמילה דוושה.
  2. לסדר את סביבת העבודה עטופה בניתוח עם כל המכשירים והחומרים הדרושים (כלומר, מספריים, מלקות, גזה, הפרין, מפשקים, כרית אמצע, טיפים כותנה, 4-0 משי, 7-0 משי, 8-0 תפר סטרילי שאינו נספג, ותפר מונופילמנט לא ספוג 10-0) ממוקמים בנוחות בצידי הפלטפורמה הכירורגית.
  3. סדר את תחנת העבודה עם כל הפתרונות, כולל פתרון ההקטאט של רינגר ו-300 U של נתרן הפרין (ראה טבלת חומרים).
  4. לשקול את החיה. להרדים את החולדה התורם על ידי הצבתו בתא ההרדמה עם 5% isoflurane, 5 L/min זרימת אוויר, ו 70% FiO2 עבור אינדוקציה. כאשר החולדה מאבדת את הכרתה, להקטין את ההרדמה ל 3% isoflurane, 0.5 L/min זרימת אוויר, ו 70% FiO2. בדוק אם אין תגובת דוושה על-ידי צביטת הגובה.
  5. הכן את עור הבטן. באמצעות מכונת גילוח חשמלית, מוציאים את הפרווה מהצד האוורני. בתשומת לב בחן את קצב הנשימה של התורם עד שהוא מגיע לקצב יציב ועמוק.
    1. הנח את החולדה העטוף בניתוח כך שהצד האוורני שלו פונה לתקרה. מניחים את האף בנבלות מרדים עם 3% isoflurane, 0.5 L/min זרימת אוויר, ו 70% FiO2. הכן את קיר הבטן עם povidone-יוד, עובד מהאמצע כלפי חוץ, ואחריו 70% אתנול.
  6. בצע חתך מתהליך ה-xiphoid לסימפוזיס הערווה באמצעות מספריים כירורגיות עגולות, ולאחר מכן לשפר את החשיפה עם חתך רוחבי דו-צדדי. לעצור כל דימום מדופן הבטן באמצעות יחידה אלקטרוכירורגית דו קוטבית לתורבת. לאחר החתך, הפחת את התחזוקה ל- 2%, זרימת אוויר של 0.5 L/min ו- 70% FiO2.
    הערה: התאם את מאדה איזופלוראן כדי להשיג קצב נשימה של כ נשימה אחת לשנייה וזכור להעריך באופן קבוע את עומק ההרדמה במהלך הניתוח.
  7. מניחים תפר משי 4-0 בתהליך xiphoid ולהשתמש בתפר כדי למשוך את קיר החזה cephalad. להדביק את חוט המשי לראש המבנה שמחזיק את מנוא ההרדמה במקום. החזק את חלל הגוף של העכברוש התורם פתוח עם מפשפים המודפסים בתלת-ממד (ראה חומר משלים 3) המוצבמשני צדי הבטן (המפשקים מוחזקים במקומם עם גומיות המחוברות למגנטים בפלטפורמה הכירורגית).
    הערה: מפס יתושים יכול לשמש גם כדי לתפוס את תהליך xiphoid ולמשוך את cephalad. לתקן את מפלצות היתוש במקום באמצעות קלטת.
  8. השתמש בספוג גזה לא ארוג (4 ס"מ על 4 ס"מ) מעומעם בתמיסת הלקטאט של רינגר כדי להקיף את המעיים הקטנים והגדולים. השתמשו בספוג גזה קטן, רטוב ולא ארוג (2 ס"מ על 4 ס"מ) כדי לכסות בעדינות את הכבד.
  9. מניחים גזה מגולגלת קטנה מתחת לאמצע כדי להרים את הבטן ולשפר את החשיפה של קאווה וחנה נחותה על-טבעית (SHVC).
  10. חותכים את הרצועה הפאלציפורם. הפרד את וווית הסרעפת השמאלית מה-SHVC באמצעות מיקרו-מפס. לתלות את וורי הסרעפת השמאלית עם 7-0 משי, להישאר קרוב SHVC.
    הערה: השתמש בספוג גזה קטן, רטוב ולא ארוג, לח עם הקטאט של רינגר והניח על הכבד, כדי למשוך בעדינות את הכבד הרחק מתהליך ה-xiphoid ולחשוף את וורין הסרעפת השמאלי.
  11. חותכים את המשולש השמאלי ואת הרצועות הגסטרו-hepatic עם מספריים עגולים.
  12. לחשוף את האונה caudate על ידי בזהירות מושך בחזרה את האונות השמאליות והאמצעיות לכיוון תהליך xiphoid באמצעות ספוג גזה קטן, רטוב, לא ארוג. שחררו את הרצועה המפרידה בין האונה הקצה משאר הכבד עם מספריים עגולים.
  13. לחלק ולהפריד את הרצועה hepato-הוושט באמצעות יחידה אלקטרוכירורגית דו קוטבית קרוב לוושט.
    הערה: הזיזו בעדינות את המעיים הקטנים והגדולים לצד השמאלי של חלל הבטן וכסו אותם בגזה רטובה ולא ארוגה.
  14. לנתח את הרטרופריטוניום והשומן המכסים את ה-IHVC. לחשוף ולבודד את IHVC עד לווין הכליה השמאלית.
  15. עקור מעט את ה-IHVC עם ספוגית כותנה כדי לחשוף ולאחר מכן לצרוב את כל הורידים הקטנים המתמזגים לצד הימני של ה-IHVC, באמצעות היחידה האלקטרו-כירורגית הדו-קוטבית. כמו כן לצרוב את כל ורידים המותניים מתמזגים לתוך IHVC.
  16. מחלקים את וירק העל-טבעי הימני (בלוטת יותרת הכליה) בין שני קשירה של משי 7-0, ונשארים קרובים ל-IHVC. שחררו את הכבד מהרצועות האחוריות שלו על ידי חיתוך אלה תחת מתיחה עדינה.
  17. בודדו את וווין הכליה הימני מעורק הכליה הימני ומהרקמות השכנות באמצעות צריבה עדינה. לאטום את פתח וורין הכליה הנכון עם 8-0 קשירה סטרילית לא ספוגה.
  18. נתק את השומן המכסה את PV כדי לאתר את וריד pyloric (וריד קיבה ימין) ואת וריד הטחול בנקודות שבו הם למזג את PV. לייט ורידים אלה עם 7-0 משי, חיזוק הצד הקרוב ביותר PV עם 8-0 תפר סטרילי לא נספג. לחלק את הורידים בין העניבות.
    הערה: לחשוף את PV באמצעות גזה קטנה, רטובה כדי למשוך בחזרה את התריסריון. הכניסה של השרוול קל יותר אם שומן מנותק PV, אשר גם מונע היצרות של שרוול PV.
  19. להזריק 300 IU של נתרן הפרין לתוך IHVC, מדולל 1 מ"ל של תמיסת מלח רגילה, באמצעות מזרק 1 מ"ל (מחט 31 G).
  20. הפוך חתך 5 מ"מ מתחת bD bifurcation ולהכניס את סטנט BD לתוך BD המשותף. עניבה נוספת יכולה להיעשות מתחת לחתך, שהוא 10 מ"מ מתחת לחתך. ברגע שהסטנט מאובטח, תחתוך את ה-BD בין שני הקשרים האלה.
  21. לעולם אל תחתוך את ה-BD או את עורק הכבד (HA). מניחים תפר תפר מונופילמנט כירורגי סטרילי 10-0 בלתי ספיג במיקום 3 ב-BD בחתך כסמן למניעת פיתול לאחר חיבור מחדש.
  22. לחשוף את HA הנכון ולחלק את עורק גסטרו (GDA) בין שתי קשירה משי 7-0. לחשוף את עורק הקיבה השמאלי, עורק הטחול, ותא המטען צליאק. קשור את שלושת העורקים גם בהסתה וגם קרוב להמראה שלהם.
  23. חותכים את עורק הקיבה השמאלי, עורק הטחול, ותא המטען הצליאק בין עניבות העורק. לאט להזריק 20 מ"ל של קר (4 ° C) תמיסת הקטאט של רינגר לתוך PV, באמצעות מזרק 20 מ"ל עם מחט 21.5 G. חותכים את הקאווה וריד מתחת לנקודה שבה וריד הכליה השמאלי מתמזג עם IHVC כדי לאפשר זרימת סומק.
    הערה: המחט צריכה להישמר רחוק ככל האפשר מההילום. התפרם הכבד קר perfusion צריך להימשך בין 1-2 דקות. תוך שטיפה בכבד, השתמש ביד השנייה כדי להשפריץ את הקטאט של רינגר קר על פני השטח של הכבד.
  24. חותכים את תא המטען PV מתחת לווריד הטחול לאחר הסומק. חותכים את ה-IHVC ממש מעל וווין הכליה השמאלי. חותכים את ה-SHVC הסמוך לסרעפת.
  25. חותכים את הרצועות ואת רקמת החיבור בין הכבד לבין רטרופריטונום.
    הערה: ודא כי ישנם אורכים מספיקים של קירות SHVC הקדמיים והראוריים כדי להקל על anastomosis caval העליון. זה חיוני לחתוך מיד סמוך הסרעפת כדי לשמור על אורך רב ככל האפשר.
  26. לאחר שהכבד הוסר מהבטן, מהר למקם אותו לתוך צלחת מלאה בתמיסת הקטאט של 4 מעלות C רינגר. מניחים את המנה מעל משטח קרח כדי לשמור על טמפרטורה קרה.
  27. היפטרו מלשרידי העכברוש התורם, בהתאם להנחיות המוסדיות.

3. הכנת כבד חולדה תורם ("ספסל אחורי")

  1. מלאו את צלחת פטרי הקרה בנפח מספיק של תמיסת הקטאט של 4°C Ringer כדי להשתגר בכבד החולדות התורם. סובבו בזהירות את כבד התורם הצף בצלחת בזהירות, כך שמשטח ם נחות פונה כלפי מעלה. לשים את האזיקים עבור PV ו- IHVC (חומר משלים 1 וחומר משלים 2,בהתאמה) לתוך המנה.
  2. משוך את PV דרך שרוול PV ולקפל את קצה הוריד על השרוול. קשור את PV בבטחה סביב השרוול באמצעות 7-0 משי. לשטוף את PV עם 10 מ"ל של 4 °C תמיסת הקטאט של רינגר.
  3. חזור על שלב 3.2 עם IHVC, ללא סומק.
  4. הסר את רקמת השומן סביב גזע הצליאק. יוצרים שרוול עורקי גדול יותר על ידי חיתוך לפתוח את bifurcation של גזע צליאק, עורק הטחול, ועורק קיבה שמאל(איור 2א').
    הערה: קשה להכניס את סטנט העורקים לתוך HA המשותף. למתוח וליישר את העורק עם מקציפים מספר פעמים לפני הכנסת הסטנט. ודא כי ההתעוות של סטנט פונה כלפי מעלה כי העורק אינו מעוות(איור 2ב).
  5. לשים את 1.5 מ"מ אורך 24 G סטנט עורקי לתוך התורם משותף HA דרך השרוול העורקי. אבטחו את סטנט עם 8-0 ליגטורה פוליפרופילן (איור 2C) ולשטוף את סטנט עם תמיסת הקטאט של רינגר (איור 2D).
  6. מקם מיקרו-מהדק (4-6 מ"מ אורך) על IHVC proximal, אשר נועד למנוע אובדן דם לאחר reperfusion הפורטל ולהימנע תסחיף אוויר.
  7. לסובב את הכבד ולחשוף את הצד העליון שלה. הוסף שני 8-0 תפרים נקודת מתחדד פוליפרופילן על הקצוות לחוץ ומדיאלי של SHVC.
  8. שמור את הכבד ב 4 מעלות צלזיוס כך שהוא יהיה מוכן להשתלה לתוך התורם.

4. פעולת נמען

  1. עיין בסעיף פעולת התורם לעיל וחזור על שלבים 2.1-2.4.
    הערה: חולדות זכר לואיס בגילאי 12-14 שבועות משמשים כאן, במשקל 5-20 גרם כבד יותר מאשר התורמים. במהלך הניתוח, לפקח על עומק ההרדמה על ידי מיקום קצב הנשימה, קצב הלב, צבע של האיברים / קרום רכי, ונוכחות של כל רפלקסים גמילה דוושה.
  2. הניחו את החולדה העטוף בניתוח כשצד האוורור שלה פונה כלפי מעלה. מניחים את האף בנבלות ההרדמה לשאיפת isoflurane. להניח את העיניים עם חומר סיכה אופטי. הכן את קיר הבטן עם פרובידון יוד ראשון, לאחר מכן עם 70% אתנול.
  3. להזריק 5 מ"ל של תמיסת הקטאט של רינגר באופן תת עורי משני צידיו התחתון של קיר הבטן הגחוני. השתמש עוזר של עוזר כירורגי להזריק 0.5 מ"ל של 200 מ"ג/ק"ג piperacillin נתרן תוך שרירי לתוך קיר הבטן השמאלית לפני פתיחת בטן. בנוסף, לנהל 0.5 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל bupivacaine תת עורי לתוך קיר הבטן הימנית.
    הערה: לתת את אותה מנה של נתרן piperacillin 1x/day במשך 3 ימים לאחר הניתוח.
  4. מכינים את דופן הבטן שוב עם פרובידון-יוד תחילה ולאחר מכן עם 70% אתנול. הפוך חתך קו אמצע מן xiphoid החזה 1 ס"מ מעל סימפוזיס הערווה. הפחתה של isoflurane ל- 2%, זרימת אוויר 0.5 L/min, ו FiO2 70% עבור תחזוקה של הרדמה לאחר ביצוע החתך.
    הערה: מפסים יתושים יכול לשמש כדי לתפוס את תהליך xiphoid ולמשוך את cephalad. לתקן את מפלצות היתוש במקום באמצעות קלטת. חלל הגוף נשאר פתוח על ידי מפשפים בהדפסת תלת-ממד (ראה חומר משלים 3)משני הצדדים עם גומיות המוחזקות מגנטית בפלטפורמה הכירורגית.
  5. עטו את המעיים הקטנים והגדולים בספוג גזה רטוב ולא ארוג (4 ס"מ על 4 ס"מ) לחים בתמיסת הקטאט של רינגר. השתמש קטן (2 ס"מ על 4 ס"מ), ספוג גזה רטוב ולא ארוג לח עם תמיסת הקטאט של רינגר כדי לכסות בעדינות את הכבד.
  6. מקם משטח תמיכה קטן בהדפסת תלת-ממד (מחזיק אחורי; ראה חומר משלים 4) מתחת לאמצע החולדהכדי להגדיל את החשיפה של SHVC על-ידי כיפוף הסיבוב. זה יכול להתבצע בבטחה בחולדות והוא מוצא להורג על ידי עוזר מנתח.
  7. חותכים את הרצועה האלכסונית והשתמשו בספוג גזה קטן ורטוב כדי למשוך בעדינות את הכבד מתהליך ה-xiphoid ולחשוף את וווין הסרעפת השמאלי. הפרד את וווית הסרעפת השמאלית מה-SHVC באמצעות מיקרו-מפס. לתלות את וווית הסרעפת השמאלית עם 7-0 משי קרוב הסרעפת.
  8. חותכים את המשולש השמאלי ואת הרצועות הגסטרו-hepatic עם מספריים עגולים.
  9. משוך את האונות השמאליות והאמצעיות בעדינות לכיוון תהליך ה-xiphoid עם ספוג גזה קטן ורטוב שאינו ארוג כדי לחשוף את האונה הקודרת. לנתק את הרצועה שמפרידה את האונה caudate משאר הכבד.
  10. מחלקים את הרצועה ההפטו-ושט ולתחלל את כל נקודות הדימום עם יחידת האלקטרוכירורגית הדו-קוטבית, תוך שמירה על קשר קרוב לכבד. חותכים את הרצועות בהיבט האחורי של הכבד.
  11. משוך בזהירות את המעיים הקטנים והגדולים לצד השמאלי של חלל הבטן וכסה אותם בגזה רטובה ולא ארוגה.
  12. לנתח את retroperitoneum ושומן על IHVC לחשוף ולבודד את IHVC עד לווהק הכליה הנכון. תעקור מעט את ה-IHVC עם ספוגית כותנה וצרוב ורידים קטנים המתמזגים לצד הימני של ה-IHVC, באמצעות היחידה האלקטרו-כירורגית הדו-קוטבית. באופן דומה, לצרוב את כל ורידים המותניים הנכנסים IHVC.
  13. מחלקים את וירך ימין (בלוטת יותרת הכליה) בין שני קשירה משי 7-0. שחררו את הכבד מהרצועות האחוריות שלו על ידי חיתוךם תחת מתיחה עדינה.
  14. השתמש בגזה קטנה ורטובה עם תמיסת הקטאט של רינגר כדי למשוך את התריסריון ולחשוף את ה-PV. נתק שומן מהביפורציה של PV וריד פילור.
  15. חלקו את ה-BD 0.5 ס"מ מתחת ל-bifurcation hilar שלה והכניסו סטנט BD ל-BD הדיסטלי המשותף. ניתן למצוא עניבה נוספת מעל החתך, קרוב לחתך. חותכים את ה-BD קרוב לכבד אבל דיסטל לעניבה.
  16. הפרד את ה-BD עם מקצות והימנע מחיתוך ה-BD או HA המתאים. מניחים תפר מונופילמנט לא ספוג 10-0 (לדוגמה, אתילון) במיקום השעה 3 ב-BD כסמן למניעת פיתול לאחר חיבור מחדש.
  17. לחשוף את HA הנכון ואת bifurcation של HA ו GDA הנפוצים. לחשוף את הא שמאל, באמצע HA, וימין HA. תקשור את שלושת העורקים לתפורת הצ'ה ותחתוך את העורקים קרוב לכבד, מעל העניבות.
  18. שים חתיכת גזה דקה ארוכה מאחורי SHVC.
  19. מקם מחזיק IHVC בהדפס תלת-ממדי או "ידית" (קאווה 150 גרם 2.1; ראה חומר משלים 5)מאחורי IHVC, ותפור את קצות ה"ידית" המודפסת בתלת-ממד יחד באמצעות תפר מונופילמנט לא ספוג 10-0(איור 3א').
  20. מקם מחזיק PV בהדפס תלת-ממדי או "ידית" (Porta 1.4.1-see חומר משלים 6)מאחורי PV, נחות ישירות לכבד, ולתפור את הקצוות של "ידית" מודפסת בתלת-ממד יחד באמצעות תפירת מונופילמנט לא ספוגה 10-0.
  21. באופן רופף לקשור קשירה משי 7-0 מתחת שני מחזיקי 3D מודפס (IHVC ו PV) (איור 3A).
  22. מהדק את IHVC ממש מעל וווין הכליה הימנית, אשר עדיין צריך להיות מתחת מחזיק caval 3D מודפס.
  23. מהדק את PV ממש מעל וריד pyloric, אשר צריך להיות מתחת מחזיק PV 3D מודפס. הקלט את הזמן האנפטי, שמתחיל בנקודה זו. ירידה של 0.5% isoflurane, 0.5 L/min זרימת אוויר, ו 70% FiO2 לתחזוקת הרדמה.
  24. לשטוף 2 מ"ל של 37 °C תמיסת הקטאט של רינגר באמצעות bifurcation של PV באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G מצורף.
  25. מהדק את SHVC מעל הכבד עם מהדק Kitzmiller. חותכים מתחת לאותו מלחציים, נשארים קרובים ככל האפשר לכבד.
  26. גזור מעל המחזיקים המודפסים בתלת-ממד הן עבור PV והן עבור IHVC (איור 3A). הסר את הכבד של הנמען. בזהירות לכוון את הכבד התורם ולמקם אותו בחלל הגוף של המטופל באופן כזה כי anastomosis caval העליון ניתן ליצור.
  27. השתמש ב- 8-0 פוליפרופילן פועל תפר להצטרף SHVC של התורם עם SHVC של המטופל ליד הסרעפת. ראשית, מקום להישאר תפרים של 8-0 פוליפרופילן בצד שמאל וימין של התורם ומקבל SHVC. ואז, לקשור אותם על החלק החיצוני של קיר ורין.
  28. השתמש בצד שמאל 8-0 פוליפרופילן לתפור את הקיר האחורי של SHVC משמאל לימין ולקשור ימינה 8-0 פוליפרופילן. השתמש בצד שמאל 8-0 פוליפרופילן לתפור את הקיר הקדמי של anastomosis SHVC משמאל לימין, משאיר את שני שליש האחרונים של קו התפירה רופף. לשטוף באמצעות 20 מ"ל של הקטאט של רינגר בין התפרים רופפים תוך הקפדה לחלץ את כל בועות אוויר.
  29. להדק את התפרים רופפים ו לעשות עניבה בצד החיצוני של SHVC. חתוך את 8-0 הנותרים תפר פוליפרופילן.
    הערה: הסרטון מחזיק את SHVC של הנמען במקום, מה שהופך אותו קל יותר לתפור את התורם ואת SHVC של הנמען יחד. רטוט את משך הזמן של anastomosis SHVC. בשלב זה, ידיות פורטה מחוברות ללחן זרוע המחזיק (זרוע המחזיק McGil + מחזיק מיני זרוע LAB + מחזיק זרוע רך חלק 1.3; ראה חומר משלים 7,חומר משלים 8, וחומר משלים 9,בהתאמה), נחות ישירות לכבד. אפליקציית זו נתמכת על-ידי בסיס בעלים בהדפסת תלת-ממד (בסיס בעלים 3.1; ראה חומר משלים 10).
  30. הכנס את שרוול PV(חומר משלים 1)מהתורם לתוך הנמען PV ולהדק את עניבת משי 7-0. לשטוף את PV של התורם ואת הנמען עם פתרון הקטאט של רינגר התחמם ל 37 מעלות צלזיוס לפני החיבור.
  31. הסר את המלחציים אטראומטיים SHVC (ראשון), לאחר מכן קליפ microvascular עבור PV (שני). להסתפר מחדש את הכבד עם דם חם; בנקודה זו, זמן השלב האנפטי הסתיים. תקליט הפעם.
  32. יוצקים 10 מ"ל של תמיסת הקטאט של רינגר חם על גבי הכבד כדי להתחמם. הסר את המחזיקים המודפסים בתלת-ממד עם מספריים עגולות (חותכים את התפר המאבטח).
  33. הכנס את השרוול IHVC התורם(חומר משלים 2) לתוךהמטופל IHVC ואבטח עם עניבת משי 7-0. הסר תחילה את קליפ IHVC התורם, ולאחר מכן את הקליפ של הנמען (איור 3ב'). הקאווה מחוברת לתדר המחזיקים ולבסיס המחזיקים כמתואר לעיל,
  34. הסר את מחזיקי מדפסת תלת-ממד (פורטה וקאווה) עם מספריים עגולות (חותכים את התפר המאבטח; איור 3C), וכתוצאה מכך IHVC מחובר (איור 3D).
  35. בדוק בקפידה את האזור סביב הכבד לדימום. Instil 3 מ"ל של תמיסת הקטאט של רינגר 37 °C בתוך חלל הגוף.
  36. חיבור עורקי: לחתוך את החלק של גזע הצליאק מהתורם המשתרע מעבר סטנט.
  37. מהדק את ה-HA הנכון של הנמען וחתוך את העניבה בסוף. חותכים כל רקמה נוספת המקיפה את כליהדם (איור 4א'). עם תמיסת הקטאט של רינגר, לשטוף את הלומן של שני התורמים וכלי הנמען מסתיים.
  38. משוך את הנמען HA תקין לתוך השרוול של סטנט HA התורם כדי להשיג את anastomosis HA. מניחים אתלון 10-0 דרך ההיבט השמאלי של (התורם) HA, 2.5 מ"מ מעל פתח דיסטל של סטנט (מבחוץ פנימה), ואז החוצה דרך סוף סטנט, עם 10-0 אתלון (4 ס"מ אורך) מונחה על ידי מחטמעוקלת (איור 4B).
  39. Transfix הנמען תקין HA 0.5 מ"מ מתחת לפתח כלי, הצבת התפר הראשון (מבפנים החוצה) לצד השמאלי של הכלי, לאחר מכן (מבחוץ פנימה) לצד הימני של העורק.
  40. מניחים את התפר דרך הקיר הימני של (התורם) HA מבפנים החוצה, במרחק מהפתח סטנט זהה לתפר המקורי. למשוך את שני הקצוות של 10-0 מונופילמנט לא נספג, אשר להחליק את הנמען HA הנכון למעלה ולתוך סטנט HA(איור 4C).
    הערה: שים לב לשיבת דם. אפשרות אחת היא לחתוך GDA התורם כדי לאשר כי דם הוא שאיבה דרך anastomosis. הקפד לקשור מחדש את העורק לפני המעבר לשלב הבא של ההליך אם GDA נותק.
  41. קשרו את המונופילמנט הלא ספוג 10-0 עם עצמו, מעל התורם HA(איור 4ד'). האנסטומוזה העורקית הושלמה כעת.
  42. anastomosis מרה: מניחים עניבה באופן רופף סביב הנמען BD וסטנט(איור 5A),ולאחר מכן להסיר את סטנט BD. שטוף את ה-BD של הנמען והתורם לפני השלמת החיבור מרה.
  43. הכנס את סטנט ה-BD של התורם לתעלות המרה של המטופל(איור 5ב')והדק את העניבה שהונחה בעבר סביב הנמען BD (איור 5ג').
  44. החזר את המעיים לחלל הגוף. להחדיר 2 מ"ל של 37 °C תמיסת הקטאט של רינגר לחלל כדי לשטוף אותו. לספוג חלק מהתמיסה עם גזה.
  45. ודא כי המעיים הם בחזרה בעמדה המקורית שלהם לפני תפירת צפרקודקודית ועור עם 5-0 מונוקריל.
  46. סגור את החתך בשתי שכבות עם מונוקריל 5-0. להזריק 0.5 מ"ל של 0.5% bupivacaine סביב צפר parietal תפור ולחזור על זה פעם העור תפור יחד.
  47. בעדינות להחליק את החולדה הנמען במבת נייר בעת העברה לכלוב. אפשרו לבעלי החיים גישה חופשית למים ולמזון מזמן ההתעוררות. שמור שמיכה חמה במחזור מים מתחת לחצי מהכלוב במשך 24-38 שעות. חולדה אחת מיועדת לכלוב אחד בתקופה שלאחר הניתוח המיידית.

5. טיפול לאחר הניתוח

  1. משרים כדורי מזון במים ומים אותם בצלחת פטרי על רצפת הכלוב.
  2. נטר את קצב הלב, קצב הנשימה וצבע העור של החולדה.
  3. לתת צינורצילין בימים שלאחר הניתוח 1, 2, ו 3. לנהל buprenorphine תת עורית ולפקח על כל סימנים של כאב כגון כל שינוי התנהגותי, עייפות, פרווה לא מנומה, דיכאון, השחתה, או אובדן תיאבון עבור 72 השעות הראשונות.
    הערה: הכאב מוערך לפחות 2x מדי יום במשך 3 ימים לאחר ההשתלה, אז לפחות 1x מדי יום ואילך.

תוצאות

בעוד הקמת מודל OLT חולדת anastomosis שאינו HA באמצעות פרוטוקול שתואר קודםלכן 28, הצוות שלנו נצפתה 50% ו 37.5% שיעורי הישרדות ב 21 ימים ו 60 ימים לאחר הניתוח, בהתאמה. למרות שיעור גבוה של הישרדות לטווח ארוך ללא anastomosis HA דווחו על ידי כמהקבוצות 28, תוצאות מוקדמות אלה מדגישים את החסרונות של אין זרימה עורקית. לעומת זאת, הליך החיבור מחדש של HA הממוטב הגדיל משמעותית את ההישרדות לטווח ארוך מ-37.5% ל-88.2% (p = 0.015)(איור 6).

ניתוח היסטולוגי של תת קבוצה מייצגת של בעלי חיים מושתלים ללא חיבור מחדש HA (בימים 6 ו 13 לאחר הניתוח) הראה סימנים של פגיעה בכבד היפוקסי עם נמק צנטרילובלרי(איור 7). נמק כבד נרחב היה קשור עם רמות גבוהות מאוד של אלנין אמינוtransferase (ALT) ו אספרטה אמינוטרנספראז (AST) בבעלי חיים אלה(איור 7). לעומת זאת, חולדות מושתלות עם חיבור מחדש HA לא הראה סימנים של פגיעה בכבד, וניתוח היסטולוגי גילה מבנה parenchyma כבד נורמלי עם acini מאורגן, לובולות (למשל, ווריקט מרכזי וטריאדות פורטל עם ווריקט הכבד), עורקים, צינור מרה(איור 7).

למרות שהזמן anhepatic ממוצע במהלך 23 פעולות נפרדות היה מקובל (12 דקות ו 14 s [± 78 s]), זה עדיין אפשרי כי הישרדות במודל שאינו HA חיבור מחדש בסופו של דבר ניתן לשפר עם תרגול מוגבר. עם זאת, ראוי לציין כי שלוש מתוך ארבע בעלי החיים שהושתלו ללא חיבור מחדש של HA (אשר היו במעקב להישרדות ארוכת טווח) הומתו עקב מצוקה בימים 56, 96 ו-111 לאחר הניתוח. בנוסף, ניתוח היסטולוגי של הכבד גילה שינויים תגובתיים לאחר פגיעה בכבד hypoxic כולל התפשטות צינור מרה מסומן, פיברוזיס פריפורטל ודלקת, פרודיה כבד מעוותת(דמות משלימה 2). הנוכחות של תכונות מורפולוגיות של פגיעה בכבד hypoxic לאשש את הממצאים כי חיבור מחדש HA חשוב עבור עירוי כבד יעיל ותפקוד נורמלי.

figure-results-1
איור 1: ייצוג סכמטי של עיצוב השרוול המודפס בתלת-ממד עבור וורי פורטל וקאווה וונה נחותה אינפרא-הפטית. העניבה הראשונה מהודצת בגרוב (ii) הקרוב ביותר לפניית (iii), והעניבה השנייה מהודצת בגרוב (i) הרחוק ביותר מהידית. הקוטרים החיצוניים הם (iv) 2.38 מ"מ עבור וורין הפורטל (PV) ו- 2.15 מ"מ עבור קאווה וחנה נחותה (IHVC). הקוטרים הפנימיים הם (v) 1.74 מ"מ עבור PV ו- 1.38 מ"מ עבור IHVC. אורכים הם (vi) 2.60 מ"מ עבור PV ו 2.15 מ"מ עבור IHVC (מפרטים מדויקים עבור כל החומרים המודפסים בתלת-ממד ניתן למצוא בחומרים משלימים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: החדרת סטנט עורק הכבד בשתל. (א)קצה הפתיחה של תא המטען הצליאק (i) מורחב על ידי חיתוך עורק הטחול לעורק הקיבה השמאלי, אשר חושף את bifurcation של HA המשותף. (2) סטנט BD קשור לפני החילוץ של כבד החולדות התורם. (3) שרוול PV ו (4) שרוול IHVC מוכנסים וקשורים על ידי קיפול קצות כלי על השרוול. (ב)(i) כדי להכניס את סטנט HA, HA המשותף החשוף נמתח מספר פעמים עם מפסים. (ג)סטנט HA ממוקם באופן מאובטח HA המשותף וקשור עם 8-0 פרולין . (ד)(i) סטנט HA הוא סמוק עם (ii) תמיסת לקיטאט של רינגר (BD = צינור מרה, IHVC = קאווה וריד נחות אינפרא-הרפטי, HA = עורק הכבד). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: חיבור וירה נחות אינפרא-הפאטי באמצעות מחזיק בהדפסת תלת-ממד. (A) PV (i) מחובר באותה טכניקה כמו חיבור IHVC. השתל הוא (ii) מהודק מעל (iii) שרוול IHVC. פתיחת IHVC הנמען היא (iv) תופרת בצידי הפתח למחזיק בהדפסת תלת-ממד כדי להשאיר אותו פתוח. משי רופף (v) 7-0 קשור סביב הנמען IHVC. (ב)השרוול של השתל IHVC הוא (i) מוכנס בתוך הנמען IHVC. העניבה הרופפת עכשיו מהודקה. (ג)המלחציים מוסרים, ו-(i) בעל המודפס בתלת-ממד מנותק במספריים. (D)משי נוסף (i) 7-0 קשור סביב החיבור אם לא מאובטח, אבל בדרך כלל עניבה אחת מספיקה (PV = ויריד פורטל, IHVC = קאווה וונה נחותה אינפרא-מרחבית). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4
איור 4: חיבור שרוול מיקרווסקולרי של עורק הכבד. (א)(i) סטנט ה-BD אינו מחובר לנמען. (2) סטנט HA ממוקם בשתל, המקושר ל-HA הנכון של הנמען (iv). (3) PV מחובר. (ב)10-0 את'יון עם מחט מעוקלת (i) נמשך דרך סטנט HA לצדדים של הנמען HA סוף הפתיחה. (ג)אתלון 10-0 נמשך בחזרה דרך סטנט HA; לכן, HA הנכון של הנמען נמשך דרך סטנט כמו שרוול. (ד)(i) עניבה עם אתלון 10-0 נעשה ברגע HA הנכון של הנמען נמשך לתוך סטנט לחלק שעובר לראשונה דרך סטנט HA. (ה)מוצג כאן הוא סכמטי של anastomosis HA המתואר ב (B), (C), ו - (D) (BD = צינור מרה, HA = עורק הכבד, PV = ווריקט). *קצה הפתיחה של תא המטען הצליאק מורחב על ידי חיתוך עורק הטחול לעורק הקיבה השמאלי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-5
איור 5: חיבור צינור מרה באמצעות שני סטנטים. (א)(i) סטנט BD שתל מוכנס לתוך הנמען BD בעזרת סטנט (ii) קשור באופן רופף בפתיחת BD של הנמען.(iii) PV מקושר לפני חיבור BD, אשר ממוקם מאחורי BD. (ב) סטנט בסוף BD של הנמען מוסר משמש פתח מורחב (i) להכניס את סטנט BD קשור השתל. (ג)העניבה המאבטחת באופן רופף את סטנט הנמען משמשת כעת לקשור את החיבור, ו-(i) משי 7-0 נוסף משמש כדי לשמור בחוזקה על סטנט במקום כדי למנוע החלקה או פיתול של סטנט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-6
איור 6: אחוזי הישרדות להשתלה. השתלת כבד חולדה אורתוטופית ללא חיבור מחדש HA (n = 8) ועם חיבור מחדש HA (n = 17). בעלי חיים עוקבים מקרוב לאחר ההשתלה לסימנים של אי ספיקת כבד ו / או זיהום לפחות 60 ימים. חולדות שלא הראו סיבוכים לאחר הניתוח נחשבו לניצולים (*p = 0.015, כפי שחושב על ידי הערכת קפלן-מאייר [מבחן דרגה ארוכה]). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-7
איור 7: הערכה היסטופתולוגית כבד. המחלקה המטוקסילין המייצגת וקטעים מוכתמים באאוסין בבעלי חיים(A)ללא ו-(B)עם חיבור מחדש של עורק הכבד (HA) בימים 6 ו-13 לאחר השתלת כבד (LTx). (ג)parenchyma כבד נורמלי מראה טריאדת פורטל (וורי פורטל, עורק, צינור מרה), לובולות כולל ווריקט מרכזי, acini. Hepatocytes ליד טריאדת הפורטל הם אזור 1 hepatocytes; hepatocytes ליד וווה מרכזי בתוך לובולות הם אזור 3 hepatocytes; ו hepatocytes בין אזורים 1 ו 3 הם אזור 2 hepatocytes (ALT = אלנין אמינוtransferase, AST = אספרט אמינוtransferase, CV = ורין מרכזי). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-8
דמות משלימה 1: סטנט וממדים שרוול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-9
דמות משלימה 2: הערכה היסטופתולוגית כבד מראה הפרעה של parenchyma הכבד. נציג המטוקסילין וסעיפים מוכתמים אאוסין בבעלי חיים ללא חיבור מחדש HA בימים 54, 96, ו 111 לאחר LTx. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

חומר משלים 1: שרוול פורטה 200 גרם - תמיכה 2.0. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 2: קאווה שרוול 200 גרם - תמיכה 2.0. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 3: מפשק כבד 200 גרם. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 4: מחזיק אחורי - 1.2. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 5: קאווה 150 גרם - 2.1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 6: פורטה 1.4.1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 7: מחזיק זרוע מקגיל. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 8: מעבדת זרוע מיני מחזיק. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 9: מחזיק זרוע רך חלק 1.3. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

חומר משלים 10: בסיס מחזיק - 3.1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

דיון

מודלים קטנים להשתלת כבד בעלי חיים חשובים להבנת חסינות להשתלה וזיהוי אסטרטגיות טיפוליותחדשניות 32. מודל השתלת כבד בעלי חיים קטן אידיאלי משכפל את כל השלבים של ההליך האנושי, כולל חיבור עורקי. זה יכול להיות מאתגר לפרש תוצאות מדגל OLT חולדה, כמו רוב הגרסאות אינם משלבים צעד anastomosis HA, אשר מוביל שיעור גבוה יותר של סיבוכים ותוליות42. כמה הליכי שחזור השתמשו בעורק הכליה, אשר דורש הסרת הכליה27. פרוטוקול זה מונע הסרת איברים, כפי שהוא מעבר למה שקורה בהליך האנושי.

שחזורים עורקים יכולים להתבצע גם על ידי מניפולציה של חבי העורקיםחולדה 31. עם זאת, שיטות אלה דורשות ניתוח נרחב והידוק של העורקים. אם זמן המלחציים הוא ממושך, אז חולדת הנמען יהיו תוצאות גרועות הקשורות איסכמיה דיסטל43. בבני אדם, טכניקה כירורגית LT כרוכה קשירה וחלוקה של העורק גסטרו-ודם המטופל (GDA). עם זאת, התכונות הפיזיולוגיות והאנטומיות של מכרסמים להפוך השתלה באמצעות טכניקה זו מאתגרת יותר מבחינה פיזיולוגית, עלול להוביל לסיבוכים (כלומר, נמק של הלבלב צינור מרה35 ודליפת מרה44). החיבור העורקי מחדש בפרוטוקול זה נועד לעקוף אתגר זה, לשמור על זרימת דם צינור, ולשפר את תוצאות הנמען.

השימוש בשרוול טכניקה סטנינג לשחזור של חולדה HA תואר בעבר27. בטכניקה זו, סטנט משמש כמדריך, והעורק משוחזר מתא המטען הצליאק התורם לנמען משותף HA. לאחר מכן, הנמען נפוץ HA נותח ולאחר מכן, GDA הנמען קשור27. כתוצאה מכך, אספקת הדם לחלק התחתון של הנמען BD וראש הלבלב עלולה להיות בסכנה. הוא האמין כי זרימת הדם הנלוות לאזור זה לעתים קרובות מספק זרימת דם לקויה לתעלות המרה. לדוגמה, פרוטוקול זה בודק את GDA הנמען תחילה עם קליפ microvascular ולאחר מכן מחלק את BD הנמען. כאשר GDA מהודק, BD מחולק אינו מדמם. לאחר הסרת מהדק GDA, דימום מהיר מן ה-BD נצפתה. פרוטוקול זה, אשר שומר על זרימה טובה לציבר מרה הנמען מחולק, מגן על הפיזיולוגיה של רקמת הכבד הנמען על ידי מתן זיגת דם כבד נאותה ומניעת פגיעה בכבד היפוקסי לאחר OLT.

בצד התורם, סטנט HA מוכנס לתוך תא המטען צליאק במהלך הכנת השתל בקלות על ידי יצירת תיקון מתא המטען צליאק, עורק קיבה שמאל, עורק הטחול. ניתן להכניס את סטנט דרך הפתח הרחב, וזה פחות קשה מאשר לנסות להכניס את סטנט לתוך גזע הצליאק לבד. נמצא כי 24 G הוא גודל אידיאלי לשימוש עבור סטנט HA. אורך סטנט צריך להיות 1.0-1.5 מ"מ אורך, כי זה פועל כשוהר פתוח כדי לאפשר HA הנכון של המטופל להסתכם בקלות לתוך HA המשותף של התורם. עם תשומת לב זהירה למקום שבו 10-0 תפר את'ילון ממוקם, דם זורם דרך חיבור זה לעולם לא לגעת סטנט ישירות, ו HA הנכון של המטופל יהיה להגן עליו מבפנים, הפחתת הסיכון לסיבוכים. חשוב לציין, HA של התורם הוא אף פעם לא מהודק על מנת למנוע vasospasm. ההצלחה של שחזור עורקים מוערכת על ידי השארת GDA התורם פתוח. anastomosis מוצלח תוצאות זרימת דם טובה מן GDA התורם לאחר שחזור הושלמה.

בפרוטוקול זה, בדומה לאחרים, חיבור מחדש SHVC הוא הצעד האיטי ביותר ובסופו של דבר מכתיב את משך השלב anhepatic. ככל שמשך הזמן anhepatic עולה, הסיכון לפציעה איסכמית ותפקוד בכבד עולה45. מרכיב קריטי נוסף של דגמי חולדות OLT הוא הגדלים של השתל, סטנטים, ואזיקים. אם השתל קטן מדי, השתל עלול לסובב או להתהפך, ולחסום את חיבורי כלי הדם. גודל סטנטים ואזיקים עשוי לדרוש התאמות בהתאם לגיל, מין, משקל, ומתח של החולדה. גודל האזיקים המשמשים כאן נבחר כמתואר קודםלכן 28, וגודל שרוול אחד ששלט עבור גודל חולדה שימש. לא היו סימנים של מצוקה או סיבוכים (כלומר, גודש בכבד, בצקת, ascites, או splenomegaly) במהלך תקופת המעקב (עד כה: חציון = 133 ימים לאחר הניתוח, מינימום = 115 ימים לאחר הניתוח, מקסימום = 161 ימים לאחר הניתוח). מחקרים נוספים כדי לקבוע את הגודל המתאים של PV ו- IHVC עבור זנים שונים חולדה חשבונאות הן גיל ומין מוצדקים.

פרוטוקול OLT חולדה שונה זה משתמש באזיקים מודפסים בתלת-ממד עבור PV ו- IHVC, כמתוארבעבר 39,40. השיטות הקיימות לחיבור PV ו- IHVC כוללותטכניקת מיקרו-שכנוע 32,טכניקת שרוול 46, וטכניקת סד זמניתזעירה 47. טכניקת השרוול המודפסת בתלת-ממד נבחרה, שכן היא מאפשרת לתקינה של גודל השרוול על פי זן חולדות וקלה להכנה ולשימוש. ניתן להדפיס בבת אחת כמויות גדולות של אזיקים עם אותם ממדים. המשטח החלקי של השרוול יש שני חריצים כדי לסייע עם אבטחת קשרים ולמנוע החלקה. זנב משולב גם בעיצוב השרוול כדי לאפשר מניפולציה קלה יותר של השרוול. בסך הכל, הוא האמין כי שילוב אזיקים מודפסים 3D מוביל שיעורי הצלחה גבוהים ושחזור של הליך OLT על ידי קיצור זמן anhepatic. נקבע כי טכניקה זו גם מקצרת את עקומת הלמידה הכירורגית.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר ביסס מודל הדומה יותר להשתלת כבד אנושי על ידי שילוב שלב חיבור מחדש של העורקים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ללמוד היבטים חיסוניים וכירורגיים רבים של השתלת כבד והוא יכול לשמש מודל כדי לבדוק התערבויות טיפוליות רומן רלוונטי להשתלה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן באמצעות כספים מהתוכנית להשתלת איברים מרובי איברים ב-UHN ותמיכה מהקרן המערבית של טורונטו ג'נרל וטורונטו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10-0 EthilonEthicon2830G10-0 Ethilon Black 1X5 אינץ' BV100-4 מתחדד
10 מ"ל מזרקBDB302995Luer-Lok, סטרילי, חד פעמי
1 מ"ל מזרקBDB309628Luer-Lok, סטרילי, חד פעמי
20 מ"ל מזרקBDB301031Luer-Lok, סטרילי, חד פעמי
שרוול מודפס בתלת מימד עבור IHVCשרוול
מודפס תלת מימד
מחזיק מודפס תלת מימד מותאם אישית עבור IHVC
מחזיק מודפס תלת מימד מותאם אישית עבור PVמזרק מותאם אישית
3 מ"לBDB309657Luer-Lok טיפ, סטרילי, חד פעמי
4-0 SofsilkCovidenGS-835Wx משי קלוע מקודד, 30 אינץ', תפר 1-מחט 26 מ"מ אורך 1/2 מעגל מחט נקודת התחדדות
5-0 מונוקרילאתיקוןY433Hמונופילמנט לא צבוע 1X27 אינץ' TF
5 מ"ל מזרקBDB309646Luer-Lok טיפ, סטרילי, חד פעמי
7-0 משיטלפלקס רפואי103-Sשחור
8-0 פרולןאתיקון2775G8-0 פרולן כחול 1X24 אינץ' BV130-5 EVP מחזיק מחט מיקרו חמוש כפול
ללא תפיסתמכשירים כירורגיים של AesculapFD231Rמעוקל 120 מ"מ, 4 3/4 ופריים;
מחזיק מחט Barraquer, לסתות עדינות במיוחד 8.0 מ"מ, מעוקל עם מנעול חיצוניRumex International Co.8-025Tגודל קטן, מחזיק מחט טיטניום
Barraquer, לסתות עדינות 12.0 מ"מ, מעוקלות עם מנעולהחוצה Rumex International Co.8-021Tגודל קטן, טיטניום
BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 INBD Angiocath / Autoguard38252322 גרם x 1.00 אינץ' (0.9 מ"מ x 25 מ"מ) קטטר ללא כנפיים, 37 מ"ל/דקה
BDPrecisionGlide מחטים חד פעמיות: שיפוע רגיל - דופן רגילה.BDB305106מחטי נירוסטה PrecisionGlide עם רכזות פוליפרופילן שקופות, מקודדות בצבע. מחט מזרק 22 G
BD Precisionglide 21GBD305167מד 21, אורך 1.5 אינץ', מחט היפודרמית
BD Precisionglide מחט מזרק 30GBD305128מד 30, אורך 1 אינץ', מחט היפודרמית
תמיסת Betadine מאת Purdue Products LPPurdue Products Lp67618-150-1710% פובידון– תמיסה מקומית יוד USP
הזרקת Bupivacaine BP 0.5%SteriMax Inc.DIN:024436940.5% (100 מ"ג/20 מ"ל)
מלקחיים קשירה מעוקליםDuckworth & פלטפורמות קשירה של קנט2-501E6 מ"מ, פירים ישרים, ידית שטוחה, אורך 88 מ"מ
בקר טמפרטורת DCFHC Inc.40-90-8D
DK מספריים לאיריס (מעוקל)Duckworth & קנט1-211Bטיפים קהים, אורך חיתוך 4 מ"מ, אורך קצה לציר 11 מ"מ, ידית עגולה, אורך 107 מ"מ
אתנול, 200 הוכחה (100%), USP, Decon LabsDecon Labs, Inc.2716לדלל ל-70% עם d2H2O
מפסק חוט מתכוונןעדין Fine Science Tools17004-05התפשטות מקסימלית: 3.5 ס"מ, עומק 5 ס"מ
מכשיר הרווארד Isoflurane Isoflurane Funnel-Fill VaporizerHarvard Appartus Limited34-1040SV
Heparin LEO (הפרין נתרן)LEO Pharma Inc.DIN:0045381110,000 יחב"ל/10 מ"ל
Ice-PakCryopakFIP880164.00 אינץ' x 7.00 אינץ', עובי 1.50 אינץ'
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9%Piramal Healthcare LimitedDIN: 02231929250 מ"ל, הרדמה באינהלציה, NDC 66794-017-25
מלקחיים לבקרת תפרים מתכווננים דרך הלחמיתDuckworth & פלטפורמות2-502N5 מ"מ, פירים ישרים, ידית שטוחה, אורך 84 מ"מ
USP מוזרק של רינגר לקטט, 1000 מ"לבקסטר ושות'.DIN: 00061085JB2324
מקפרסון קשירת מלקחייםדאקוורת' & Kent2-500Eפלטפורמות קשירה 6 מ"מ, פירים ישרים, ידית שטוחה, אורך 90 מ"מ
מספריים מצנבאום - 14.5 ס"מFine Science Tools14024-14ישר חד/קהה
Micro Kitzmiller ClampScanlan3003-630אורך לסת 23 מ"מ, אורך 11 ס"מ
מיקרוסקופ-Leica M525 F20Leica Microsystemsאין מספר קטלוגי
ספוגיגזה לא ארוגיםFisherbrand22-028-556
Olsen-Hegar עם חותך תפריםFine Science Tools12002-1415 מ"מ קצה חיתוך, 2 מ"מ משטח לסת - 14 ס"מ
OptixCare סיכה לעיניים, 25 גרםOptixCareES-KE8O-69U1לשעבר Optixcare חומר סיכה כירורגי לעיניים
Piperacillin מלח נתרןSigma-AldrichP8396פניצילין אנלוגי
פוריטני 3 אינץ' ספוגית כותנה סטנדרטית עם ידית עץPuritan Medical Products Company LLC803-WCמוליך כותנה רגיל עם ידית עץ
מחזיק מחט עם ידית עץ מחזיק מחט עם ידית עגולה ישר עם מנעולFine Science Tools12075-12ידיות עגולות מאפשרות התאמות קלות בקצות האצבעות - 12.5 ס"מ
מספריים שיאה מעוקליםקהים Fine Science Tools14105-12מספריים להשתלה עם דפוס קל ועדין - 12 ס"מ
נירוסטה מיקרו סרפינים מעוקלים - 4 מ"מכלי מדע עדינים18055-06אורך לסת 4 מ"מ, רוחב לסת 0.75 מ"מ, אורך כולל 16 מ"מ, לחץ לסת 125 גרם
נירוסטה מיקרו סרפינים מעוקלים - 6 מ"מכלי מדע עדינים18055-05אורך לסת 6 מ"מ, רוחב לסת 1 מ"מ, אורך כולל 17 מ"מ, לחץ לסת 100 גרם
נירוסטה מיקרו סרפינס ישר - 6 מ"מכלי מדע עדינים18055-03אורך לסת 6 מ"מ, רוחב לסת 1 מ"מ, אורך כולל 15 מ"מ, לחץ לסת 100 גרם
פלטפורמהמותאמת אישית,
מכונת הרדמה מגנטית SurgiVet Vaporstickשירותי הרדמה כללית, IncV7015
T / משאבה טיפול מקומיStrykerTP700 סדרת
משאבת לחץ ואקוםBarnant Co.400-1901
מספריים Vannas עם מיקרו-שיניים ישרכלי מדע עדינים15070-08קצה חיתוך: 5 מ"מ, קוטר קצה: 0.1 מ"מ - 8.5 ס"מ
וטרינרי בופרנורפיןCeva בריאות בעלי חיים בע"מNAC מס 123803520.324 מ"ג/מ"ל בופרנורפין הידוכלוריד תמיסת הזרקה לכלבים וחתולים
Vetroson V-10 יחידה אלקטרוכירורגית דו קוטביתSummit Hill LaboratoriesNo מספר קטלוגי
וילון כירורגיPDC HealthcareDRP1824פלסטיק שקוף סטרילי רב תכליתי, 18 אינץ' x 24 אינץ', 40/מארז
מותאם אישית עבור PV קשירה מלוטשות מאוד של קנט כירורגית

מקורות

  1. Global Observatory on Donation and Transplantation. Organ Donation and Transplantation Activities. , http://www.transplant-observatory.org/download/2016-activity-data-report (2016).
  2. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  3. Dopazo, C., et al. Analysis of adult 20-year survivors after liver transplantation. Hepatology International. 9 (3), 461-470 (2015).
  4. Schoening, W. N., et al. Twenty-year longitudinal follow-up after orthotopic liver transplantation: a single-center experience of 313 consecutive cases. American Journal of Transplantation. 13 (9), 2384-2394 (2013).
  5. Pischke, S., et al. Factors associated with long-term survival after liver transplantation: A retrospective cohort study. World Journal of Hepatology. 9 (8), 427-435 (2017).
  6. Hamdani, S., et al. Delayed and short course of rapamycin prevents organ rejection after allogeneic liver transplantation in rats. World Journal of Gastroenterology. 23 (38), 6962-6972 (2017).
  7. Endo, K., et al. Pretransplant replacement of donor liver grafts with recipient Kupffer cells attenuates liver graft rejection in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (5), 944-951 (2015).
  8. Zhao, Z., et al. IL-34 Inhibits Acute Rejection of Rat Liver Transplantation by Inducing Kupffer Cell M2 Polarization. Transplantation. 102 (6), e265-e274 (2018).
  9. Nagakawa, Y., et al. Over-expression of AIF-1 in liver allografts and peripheral blood correlates with acute rejection after transplantation in rats. American Journal of Transplantation. 4 (12), 1949-1957 (2004).
  10. Gao, L. H., Zeng, L. X., Chen, H. M., Wan, R. H. Cytomegalovirus infection accelerates the process of chronic rejection in rat liver transplantation. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2536-2538 (2013).
  11. Wu, Y., et al. Effects of combined genes of CTLA4Ig and IDO in post-liver transplantation immune tolerance of rats. Annals of Hepatology. 15 (5), 729-737 (2016).
  12. He, X. S., et al. Influence of warm ischemia injury on hepatic functional status and survival of liver graft in rats. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 2 (4), 504-508 (2003).
  13. Tamura, A., et al. Combination effect of tacrolimus and FTY720 in liver transplantation in rats. Transplantation Proceedings. 31 (7), 2785-2786 (1999).
  14. Wang, Z., et al. RhGH attenuates ischemia injury of intrahepatic bile ducts relating to liver transplantation. Journal of Surgical Research. 171 (1), 300-310 (2011).
  15. Jiang, J. W., et al. Chronic bile duct hyperplasia is a chronic graft dysfunction following liver transplantation. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1038-1047 (2012).
  16. Tang, Y., et al. S-Adenosylmethionine attenuates bile duct early warm ischemia reperfusion injury after rat liver transplantation. Molecular Immunology. 95, 83-90 (2018).
  17. Nosaka, T., Bowers, J. L., Cay, O., Clouse, M. E. Biliary complications after orthotopic liver transplantation in rats. Surgery Today. 29 (9), 963-965 (1999).
  18. Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47 (3), 428-431 (1989).
  19. Post, S., et al. The impact of arterialization on hepatic microcirculation and leukocyte accumulation after liver transplantation in the rat. Transplantation. 54 (5), 789-794 (1992).
  20. Hori, T., et al. Impact of hepatic arterial reconstruction on orthotopic liver transplantation in the rat. Journal of Investigative Surgery. 25 (4), 242-252 (2012).
  21. Zhou, S., et al. New method of stent-facilitated arterial reconstruction for orthotopic mouse liver transplantation. Journal of Surgical Research. 187 (1), 297-301 (2014).
  22. Noack, K., Bronk, S. F., Kato, A., Gores, G. J. The greater vulnerability of bile duct cells to reoxygenation injury than to anoxia. Implications for the pathogenesis of biliary strictures after liver transplantation. Transplantation. 56 (3), 495-500 (1993).
  23. Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26 (1), 198-205 (1997).
  24. Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62 (5), 582-587 (1996).
  25. Zhao, D., Wheatley, A. M. Orthotopic liver transplantation in the rat: comparison of models with and without rearterialization of the graft. European Surgical Research. 25 (5), 294-302 (1993).
  26. Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49 (4), 675-678 (1990).
  27. Liu, X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a New Technique for Reconstruction of Hepatic Artery during Liver Transplantation in Sprague-Dawley Rat. PLoS One. 10 (12), e0145662(2015).
  28. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  29. Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16 (6), 664-669 (1973).
  30. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  31. Kashfi, A., et al. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation Proceedings. 37 (1), 185-188 (2005).
  32. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), a015495(2013).
  33. Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45 (4), 830-832 (1988).
  34. Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48 (6), 1080(1989).
  35. Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48 (1), 166-168 (1989).
  36. Shi, Y., et al. Magnetic ring anastomosis of suprahepatic vena cava: novel technique for liver transplantation in rat. Transplant International. 28 (1), 89-94 (2015).
  37. Dippe, B. E., et al. An improved model for rat liver transplantation including arterial reconstruction and simplified microvascular suture techniques. Journal of Investigative Surgery. 5 (4), 361-373 (1992).
  38. Kobayashi, E., Kamada, N., Goto, S., Miyata, M. Protocol for the technique of orthotopic liver transplantation in the rat. Microsurgery. 14 (8), 541-546 (1993).
  39. Oldani, G., et al. Efficient nonarterialized mouse liver transplantation using 3-dimensional-printed instruments. Liver Transplation. 22 (12), 1688-1696 (2016).
  40. Oldani, G., et al. Manufacturing devices and instruments for easier rat liver transplantation. Journal of Visualized Experiments. (75), e50380(2013).
  41. Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22 (2), 62-68 (2002).
  42. Li, G. L., et al. High incidence of biliary complications in rat liver transplantation: can we avoid it? World Journal of Gastroenterology. 17 (26), 3140-3144 (2011).
  43. Zammert, M., Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping. Best Practice and Research: Clinical Anaesthesiology. 30 (3), 257-269 (2016).
  44. Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56 (1), 19-24 (1993).
  45. Ijtsma, A. J., et al. The clinical relevance of the anhepatic phase during liver transplantation. Liver Transplation. 15 (9), 1050-1055 (2009).
  46. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  47. Marni, A., Ferrero, M. E. A four-technique comparative study of orthotopic liver transplantation in the rat. American Journal of Surgery. 156 (3 Pt 1), 209-213 (1988).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CuffsHeparin SodiumStentingRinger s Lactate
סיבוכים מופחתים לאחר חיבור מחדש עורקי במודל חולדה של השתלת כבד אורתוטופית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.